阅读说明：本技术 一种小叶金花草的鉴别方法及其应用 (Method for identifying small-leaf golden camellia and application thereof ) 是由 陈锋 李嘉 张颖 杨海船 何春欢 张赟赟 巫凯 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小叶金花草的鉴别方法及其应用,属于药物分析技术领域。本发明鉴别方法包括供试品溶液的制备方法和高效液相色谱检测条件；用中药指纹图谱相似度软件进行处理,得小叶金花草的指纹图谱；将相关色谱数据导入SPSS软件进行聚类分析和主成分分析,并得到相关分析结果。本发明建立了小叶金花草HPLC指纹图谱的共有模式,指认了11个共有峰,其中4个共有峰为已知成分,涵盖了药材指标性成分的大部分信息,该方法简便、快速、重现性好,填补了小叶金花草质量控制方法的空白,具有较高的应用价值。(The invention discloses an identification method of small-leaf golden camellia and application thereof, belonging to the technical field of drug analysis. The identification method comprises a preparation method of a test solution and high performance liquid chromatography detection conditions; processing with traditional Chinese medicine fingerprint similarity software to obtain fingerprint of herba Gerberae Piloselloidis; and (4) importing the related chromatographic data into SPSS software for cluster analysis and principal component analysis, and obtaining a related analysis result. The method establishes a common mode of the HPLC fingerprint spectrum of the California leaflet, identifies 11 common peaks, wherein 4 common peaks are known components and cover most information of index components of medicinal materials, and has the advantages of simplicity, rapidness, good reproducibility, filling of the blank of the quality control method of the California leaflet, and high application value.)

一种小叶金花草的鉴别方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，对药材中主成分进行分析和药材质量进行评价，更具体的说是涉及一种小叶金花草的鉴别方法及其应用。

背景技术

小叶金花草来源于中国蕨科植物野雉尾金粉蕨Onychium japonicum(Thunb.)Kze.，别名金花蕨、小野鸡尾、日本乌蕨等，为广西瑶族和壮族地区民间常用中药。其味苦，具有清热解毒，利湿，止血的功效。主要用于治疗风热感冒，肺热咳嗽，急性肠胃炎，黄疸，便血等。目前有关小叶金花草的研究主要在生药鉴別、配子体发育、化学成分的分离及药理作用等方面，未见质量评价方面的研究。

中药成分复杂，药效多样，HPLC是中药材的主流分析手段，它对药材的质量评价有重要意义。中药以及中药制剂在世界各地的需求增长很快，因此药材质量的评估和控制尤为关键，由于中药很难完全定性所有化合物，但是这些化合物通常在治疗方面起到协同作用，找到合适的分析方法变得很有必要。中药指纹图谱研究不仅是一种中药材的鉴别方法，也是作为质量标准评价的重要手段之一，已被国内外学者广泛认可，逐渐成为一种趋势，它能较全面地反映中药的整体化学特征。中药化学成分复杂，而且含量会受各种因素影响，更丰富的物质基础研究方法具有很高的应用价值。

因此，提供一种小叶金花草的鉴别方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种小叶金花草的鉴别方法及其应用，该方法简便、快速、重现性好，填补了小叶金花草质量控制方法的空白，具有较高的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种小叶金花草的鉴别方法，具体步骤如下：

(1)供试品溶液的制备

将供试小叶金花草样品打成粉末，过三号筛；取小叶金花草粉末1.0g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇-乙酸-水(45:5:50)溶液30mL，称质量，水浴加热回流1.5h，放冷至室温，再次称质量并补足质量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、菊苣酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得含上述4种成分质量浓度分别为5.07，8.26，6.53，32.46μg/mL的混合对照品溶液，过滤，取续滤液，作为对照品溶液；

(3)高效液相色谱检测及指纹图谱生成

吸取步骤(1)所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行高效液相色谱检测，记录105分钟内的指纹图谱；

高效液相色谱条件为：采用Agilent XDB-C18(250mm×4.6mm×5μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.4％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10min，10％A；10～60min，10％A→30％A；60～105min，30％A)；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；进样量：10μL，分析时间：105min；

(4)相似度分析

将色谱图导入“中药色谱指纹相似度评价系统”软件中进行分析，选择参照图谱，采用多点校正法进行色谱峰匹配，选择中位数法生成对照图谱；采用“中药色谱指纹相似度评价系统”软件，以药材样品HPLC对照图谱为参照，进行相似度评价；

(5)共有峰的指认及相关性分析

药材样品确定了11个共有峰，与混合对照品溶液比对，依照步骤(3)色谱条件进样检测；设定参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

指纹图谱是测定中药各种化学成分而得到的光谱或色谱图，结合HPLC，对中药材的基因片段进行研究，是评价中药优劣、鉴别真伪、区分物种和确保一致性和稳定性的有效方法。本发明以13批小叶金花草为例，指认了高效液相指纹图谱中的11个共有峰，并通过对照品比对，确定了其中4个共有峰分别为原儿茶酸、香草酸、咖啡酸和菊苣酸。

(6)聚类分析

利用Waters empower工作站数据管理功能，以11个共有峰的相对峰面积为原始数据，导入SPSS 25.0软件，以组间平均数联结法，结合平方欧式距离为度量标准，对小叶金花草进行聚类分析。

我国疆域辽阔，具有复杂的自然地理环境，日照、温度、土质等环境不尽相同，为药用植物及动物的生长提供了必要的有利条件，同时也使中药材的生产和质量具有一定的地域性，造成不同批次药材中各化合物含有量多少会存在一定差异，聚类分析的目标是在相似的基础上收集数据来分类，运用SPSS软件对从指纹图谱获得的相关数据进行聚类分析，可做为初步的探索性分析，能直观、简明地得到一些结论。本发明利用这一分析方法对不同批次的小叶金花草药材进行科学的分类，从而总结规律，为质量评价提供参考。

(7)主成分分析

运用SPSS软件对各共有峰峰面积进行标准化处理后，对小叶金花草药材指纹图谱所得的11个共有峰进行主成分分析。

主成分分析为双线性模型方法，利用方差最大原则，对原始数据所包含的多个自变量进行线性拟合，以新的低维变量代替原始高维变量，即主成分，各主成分之间互不相关，从而这些主成分能够反映原始变量的绝大部分信息，且所含的信息互不重叠，进而实现数据的降维，该方法在中药质量控制方面具有广泛的应用。这为探索不同批次小叶金花草中共有成分的相关性提供了方法，运用SPSS软件对从指纹图谱获得的相关数据进行主成分分析，对方差和权重结果换算出主成分的得分，对药材质量的评价有重要参考价值。

进一步，步骤(5)确认1、4、5、8号共有峰分别为原儿茶酸、香草酸、咖啡酸和菊苣酸。

进一步，所述指纹图谱在小叶金花草质量控制中的应用。

进一步，所述指纹图谱在小叶金花草提取物和制剂检测中的应用。

本发明结合多种研究手段及分析结果，使小叶金花草的质量控制方法相较之前得到了拓展和提升，跟上了中药现代化的步伐，这有益于形成小叶金花草的质量标准，使该药材更好地为人类服务。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种小叶金花草的鉴别方法及其应用，具体为小叶金花草指纹图谱的构建方法及其指纹图谱的应用；该方法包括供试品溶液的制备方法和高效液相色谱检测条件；用中药指纹图谱相似度软件进行处理，得小叶金花草的指纹图谱；将相关色谱数据导入SPSS软件进行聚类分析和主成分分析，并得到相关分析结果。本发明建立了小叶金花草HPLC(高效液相色谱法)指纹图谱的共有模式，指认了11个共有峰，其中4个共有峰为已知成分，涵盖了药材指标性成分的大部分信息，该方法简便、快速、重现性好，填补了小叶金花草质量控制方法的空白，具有较高的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明药材样品的HPLC对照指纹图谱R；

图2附图为本发明13批药材样品的HPLC叠加指纹图谱；

图3附图为本发明混合对照品色谱图；

图4附图为本发明13批药材聚类分析结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Waters e2695系列四元梯度泵高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；XS205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KS-500DE型超声波清洗器(昆山洁力美超声仪器有限公司)；HH-S4型数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201205，纯度99.9％)；香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，纯度99.8％)；咖啡酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-18032003，纯度99.48％)；菊苣酸(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-18031720，纯度99.33％)；乙腈(美国Fisher公司，色谱纯)，磷酸为分析纯，水为超纯水。

实施例1

(1)供试品溶液的制备

13批药材样品经鉴定为中国蕨科植物野雉尾金粉蕨Onychium japonicum(Thunb.)Kze.的全草，具体基源信息见表1。

表1小叶金花草基源信息

分别将S1-S13的小叶金花草全草样品打成粉末，过三号筛；分别取小叶金花草粉末1.0g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入甲醇-乙酸-水(45:5:50)溶液30mL，称质量，水浴加热回流1.5h，放冷至室温，再次称质量并补足质量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

(2)对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、菊苣酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得含上述4种成分质量浓度分别为5.07，8.26，6.53，32.46μg/mL的混合对照品溶液，过滤，取续滤液，作为对照品溶液。

(3)高效液相色谱检测及指纹图谱生成

吸取上述步骤(1)所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行高效液相色谱检测，记录105分钟内的指纹图谱。其中，高效液相色谱条件为：采用Agilent XDB-C18(250mm×4.6mm×5μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.4％磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10min，10％A；10～60min，10％A→30％A；60～105min，30％A)；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；柱温：25℃；进样量：10μL，分析时间：105min。

(4)相似度分析

将色谱图导入“中药色谱指纹相似度评价系统”软件中进行分析，以S7号色谱图为参照图谱，采用多点校正法进行色谱峰匹配，选择中位数法生成对照图谱R。对照指纹图谱R见图1，13批药材样品HPLC叠加指纹图谱见图2。

采用“中药色谱指纹相似度评价系统”软件，以药材样品HPLC对照图谱R为参照，进行相似度评价。结果显示，13批药材样品相似度在0.848～0.992之间，其中10批药材样品相似度大于0.9，表明不同批次药材样品间差异并不大。相似度评价结果见表2。

表2 13批小叶金花草药材指纹图谱相似度评价结果

(5)共有峰的指认及相关性分析

药材样品确定了11个共有峰(编号为1-11)，通过与混合对照品溶液比对，依照步骤(3)色谱条件进样检测，确认1、4、5、8号共有峰分别为原儿茶酸、香草酸、咖啡酸和菊苣酸。其中8号峰峰面积较大，分离度及对称因子均符合要求，故设定为参照峰(S)，计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积。混合对照品溶液的色谱图见图3，13批药材样品相对保留时间和相对峰面积的测定结果分别见表3、表4。

表3 13批药材样品HPLC图谱共有峰的相对保留时间

表4 13批药材样品HPLC图谱共有峰的相对峰面积

(6)聚类分析

利用Waters empower工作站数据管理功能，以11个共有峰的相对峰面积为原始数据，导入SPSS25.0软件，以组间平均数联结法，结合平方欧式距离为度量标准，对13批小叶金花草进行聚类分析，结果见图4。由图4可知，13批药材样品可聚类为三类：S2、S3、S8、S12、S13聚为一类；S1、S4、S6、S9、S10、S11聚为一类；S5、S7聚为一类。其中样品S5和S7组成的一类中以菊苣酸、咖啡酸为代表的酚酸类成分的含有量最高，相似度也高，S2、S3、S8、S12和S13组成的一类整体相对酚酸类成分的含有量较低，相似度也低，提示了聚类分析对药材的质量有评价作用。

(7)主成分分析

运用SPSS软件对各共有峰峰面积进行标准化处理后，对13批小叶金花草药材指纹图谱所得的11个共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征性及其方差，部分结果见表5。结果前4个因子的累积方差贡献率达到90.527％，而前三个因子累积方差贡献率达到84.643％，可代表药材指纹图谱共有峰的大部分信息，因此选择前三个因子分别作为主成分1、2和3。主成分载荷矩阵见表6，它反映了各变量对主成分的贡献率和作用方向，由表可知，3、4、5、7、8和9号共有峰对主成分1的贡献率较大；1、2和6号共有峰对主成分2的贡献率较大，其中2和6号共有峰与主成分2呈负相关；6、10和11号共有峰对主成分3的贡献率较大。在主成分1中，经对照品比对出4、5、8号共有峰分别为香草酸、咖啡酸和菊苣酸，推断影响主成分1的主要为酚酸类成分。通过计算综合得分可以评价药材的整体质量，并根据药材的综合得分进行排名，结果见表7。在本实验中以菊苣酸为参照峰，发现其在药材中的含有量与主成分综合得分大致呈正相关关系，提示以菊苣酸为主的酚酸类成分对小叶金花草药材的质量控制有指标性意义。

表5主成分特征值及方差贡献率

表6主成分载荷矩阵表

表7 13批药材主成分得分、综合得分及排名

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。