阅读说明：本技术 一种亚麻荠种子标准指纹图谱建立方法以及检测芦丁含量的方法 (Standard fingerprint spectrum establishment method for camelina sativa seeds and method for detecting rutin content ) 是由 李飞飞 魏悦 范毅 李智宁 宋梦娇 于立芹 张丽先 宁二娟 朱杰 张桃桃 王韬 于 2020-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种亚麻荠种子标准指纹图谱的建立和芦丁含量的测定方法,包括供试品溶液的制备、指纹图谱制作和HPLC色谱条件的选择,用高效液相色谱仪对12批亚麻荠种子进行测定,通过分析比较,确定了16个共有特征峰,这些共有特征峰构成了亚麻荠种子的指纹特征,可作为亚麻荠种子的标准指纹图谱。本发明标准指纹图谱出峰多、各峰分离度良好,方法重复性好,所建立的标准指纹图谱能有效地表征和控制亚麻荠种子的质量。(The invention provides a method for establishing a camelina sativa seed standard fingerprint and measuring rutin content, which comprises the steps of preparing a test solution, preparing the fingerprint and selecting HPLC (high performance liquid chromatography) chromatographic conditions, wherein 12 batches of camelina sativa seeds are measured by using a high performance liquid chromatograph, and 16 common characteristic peaks are determined by analysis and comparison, constitute the fingerprint characteristics of the camelina sativa seeds and can be used as the standard fingerprint of the camelina sativa seeds. The standard fingerprint spectrum of the invention has multiple peaks, good separation degree of each peak and good repeatability of the method, and the established standard fingerprint spectrum can effectively represent and control the quality of camelina sativa seeds.)

一种亚麻荠种子标准指纹图谱建立方法以及检测芦丁含量的 方法

技术领域

本发明属于色谱检测技术领域，具体涉及一种亚麻荠种子标准指纹图谱建立方法以及检测芦丁含量的方法。

背景技术

亚麻荠(Camelina sativa L.)为一年生草本植物，是一种古老的油料作物，属木兰纲，五桠果亚纲，山柑目，十字花科，亚麻荠属(Camelina)。前期研究发现亚麻荠种子中含有丰富的总黄酮，植物甾醇、不饱和脂肪酸、多种氨基酸和微量元素，富含人体必需脂肪酸和多种天然活性成分，研究发现亚麻荠种子中芦丁含量较高，药理学研究发现，芦丁是一种良好的自由基清除剂，具有抗脂质过氧化、保护急性缺血性损伤、抗癌和防紫外等作用。亚麻荠种子颗粒较小，很容易掺假，从而导致种子质量很难控制。目前，尚未有关于亚麻荠种子标准指纹图谱建立以及测定亚麻荠种子芦丁含量的相关报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种亚麻荠种子标准指纹图谱建立方法以及检测亚麻荠种子中芦丁含量的方法，该标准指纹图谱可以更好的控制亚麻荠种子质量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种亚麻荠种子标准指纹图谱，该指纹图谱为HPLC标准指纹图谱，包括16个共有特征峰(1～16)，其保留时间分别为：(1号峰)3.14min、(2号峰)6.85min、(3号峰)8.38min、(4号峰)9.52min、(5号峰)10.72min、(6号峰)12.60min、(7号峰)22.56min、(8号峰)23.08min、(9号峰)25.76min、(10号峰)30.96min、(11号峰)31.99min、(12号峰)33.05min、(13号峰)38.37min、(14号峰)39.83min、(15号峰)42.65min、(16号峰)43.48min。指纹图谱中有16个特征峰，以10号峰芦丁作为参照峰。

一种上述亚麻荠种子标准指纹图谱的建立方法，其包括如下步骤：

1)供试品溶液制备：称取干燥的亚麻荠种子粉10g，用150-250mL石油醚回流提取6-10h，挥干石油醚，得脱脂后的亚麻荠种子粉末；精密称取1.0g脱脂后的亚麻荠种子粉末，加入40-60mL浓度70-85％的甲醇，称定重量并记为m，超声提取1-3h，冷却，再称重，用70-85％的甲醇补足重量至m，摇匀，滤过，取滤液过0.22-0.45μm滤膜即得供试品溶液；

2)指纹图谱制作：供试品溶液进行液相色谱分析，得到亚麻荠种子的指纹图谱；

色谱检测条件为：色谱柱：Angilent Eclipse XDB C18柱(250mm*4.5mm，5.0μm)；检测器：二极管阵列检测器(DAD)；柱温：30～40℃；波长：280nm；流动相：乙腈-0.1％甲酸，采用梯度洗脱方式：0→20min→50min，乙腈10％→17％→29％；流速：0.8-1.2mL/min；进样量：10μL；

3)标准指纹图谱的确定：按照上述提供的方法，对12批亚麻荠种子建立了HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了16个共有特征峰，这些共有特征峰构成了亚麻荠种子的指纹特征，可作为亚麻荠种子的标准指纹图谱。

本发明提供了一种检测亚麻荠种子中芦丁含量的方法，其包括如下步骤：

1)对照品溶液制备：精确称取芦丁标准品适量，加甲醇溶解，摇匀获得对照品溶液，每1mL对照品溶液中含1000～2000μg芦丁；精密量取0.2、0.4、0.5、0.8、1.3mL对照品溶液，置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制获得一系列不同浓度的对照品溶液；

2)供试品溶液制备：称取干燥的亚麻荠种子粉10g，用150-250mL石油醚回流提取6-10h，挥干石油醚，得脱脂后的亚麻荠种子粉末；精密称取1.0g脱脂后的亚麻荠种子粉末，加入40-60mL浓度70-85％的甲醇，称定重量并记为m，超声提取1-3h，冷却，再称重，用70-85％的甲醇补足重量至m，摇匀，滤过，取滤液过0.22-0.45μm滤膜即得供试品溶液；

3)色谱检测：将上述配制获得的一系列不同浓度的对照品溶液进行色谱检测，以芦丁浓度为横坐标，芦丁峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将供试品溶液进行色谱检测并记录芦丁的峰面积，代入标准曲线，计算出芦丁含量；

色谱检测条件为：色谱柱：Angilent Eclipse XDB C18柱；检测器：二极管阵列检测器；柱温：30～40℃；波长：280nm；流动相：乙腈-0.1％甲酸，采用梯度洗脱方式：0→20min→50min，乙腈10％→17％→29％；流速：0.8-1.2mL/min；进样量：10μL。

进一步优选的，称取干燥的亚麻荠种子粉10g，置于索氏提取器中，加入200mL石油醚回流提取8h。

本发明提供了上述亚麻荠种子标准指纹图谱在亚麻荠种子质量控制中的应用。

具体的，上述亚麻荠种子标准指纹图谱在亚麻荠种子质量控制中的应用，亚麻荠种子的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度不低于0.9。

查阅现有文献发现，相关控制亚麻荠种子质量的技术大多为种植技术，尚未有关于亚麻荠种子标准指纹图谱建立的相关文献。本申请采用HPLC对不同地区12批次的亚麻荠种子中芦丁含量进行分析，并建立了亚麻荠种子的标准指纹图谱，从而能够更好的控制亚麻荠种子的质量。本发明提供了一种亚麻荠种子HPLC指纹图谱的建立和芦丁含量的测定方法，本发明通过多个工艺的筛选，将亚麻荠种子中的多个有效成分分离并检测出来，所得的指纹图谱出峰多、各峰分离度良好，方法重复性好。通过对12批亚麻荠种子指纹图谱的对比，确定其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。所建立的标准指纹图谱能有效地表征亚麻荠种子的质量。和现有技术相比，本发明方法的有益效果如下：

1)将亚麻荠种子作为一个整体对待，通过比较其共有特征峰可以找出其他种子与亚麻荠种子之间的差异；

2)适用于亚麻荠种子真伪和品质的鉴别和控制；

3)供试品制作简便，色谱条件容易实现；

4)本发明方法的稳定性和重现性等都比较好。

附图说明

图1为芦丁标准品(A)和供试品的HPLC色谱图(B)；

图2为芦丁的标准曲线图；

图3为不同地区12批亚麻荠种子的指纹图谱；

图4为亚麻荠种子的标准指纹图谱。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

1仪器与材料

1.1仪器

ME204万分之一电子天平(上海梅特勒·托利多)，AUW220D十万分之一电子天平(日本岛津)，LC-20AT液相色谱仪带SPD-M20A检测器(日本岛津)，FW-80高速万能粉碎机(北京永光)，超声波提取仪KQ-500E(江苏昆山)。

1.2材料

12批不同地区产的亚麻荠种子(采自陕西编号S1～S3、青海编号S4～S6、甘肃编号S7～S9、河南编号S10～S12)，甲醇、石油醚、甲酸等均为市售分析纯，乙腈为色谱纯，超纯水，芦丁标准品购自中国药品检定所(批号100080-201811)。

2方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液的制备

精确称取芦丁标准品适量，加甲醇溶解，摇匀，使得每1mL对照品溶液中含1415.3μg芦丁。4℃避光存储。

2.1.2供试品溶液制备

将干燥的亚麻荠种子用粉碎机粉碎过3号筛，称取10g亚麻荠种子粉，置于索氏提取器中，加入200mL石油醚，回流提取8h，将去除油脂的粉末挥干石油醚，得脱脂后的亚麻荠种子粉末。

精密称取1.0g脱脂后的亚麻荠种子粉末，加入80％甲醇50mL，称定重量并记为m，超声提取2h，冷却，再称重，用80％甲醇补足重量至m，摇匀，滤过，取滤液，过0.45μm滤膜即得供试品溶液。

2.2色谱条件

色谱柱：Angilent Eclipse XDB C18柱(250mm*4.5mm，5.0μm)；检测器：二极管阵列检测器(DAD)；柱温：35℃；波长：280nm；流动相：流动相：乙腈-0.1％甲酸，采用梯度洗脱方式：0→20min→50min，乙腈10％→17％→29％；流速：1.0mL/min；进样量：10μL。在上述色谱条件下对照品和供试品色谱图见图1。

2.3样品中芦丁含量的测定

精密量取0.2、0.4、0.5、0.8、1.3mL上述“2.1.1”制备的对照品溶液，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制一系列不同浓度的对照品溶液。分别吸取对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以芦丁的浓度C(μg/mL)为横坐标、峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)。

将不同地区、干燥的亚麻荠种子用粉碎机粉碎过3号筛，称取10g亚麻荠种子粉，置于索氏提取器中，加入200mL石油醚，回流提取8h，将去除油脂的粉末挥干石油醚，得脱脂后的亚麻荠种子粉末。分别精密称定脱脂后的亚麻荠种子粉末1.0g，采用“2.1.2”方法制备各供试品溶液，每个样品平行制备三份。精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录芦丁峰面积，代入标准曲线计算出芦丁的浓度，并依据公式(1)计算得出芦丁含量，结果见表1。表1的实验结果表明河南、青海和陕西含量接近，不同产地的质量分数有一定差异。

式中：C样------样品中芦丁浓度(μg/mL)；

V-------样品溶液定容体积50(mL)；

m------样品称样量1.0000(g)。

表1不同地区亚麻荠种子中芦丁的含量测定结果(n＝3)

2.4亚麻荠种子指纹图谱的建立及相似度评价

2.4.1指纹图谱建立

分别称取不同地区所产的12批干燥亚麻荠种子样品，采用“2.1.2”方法制备供试品溶液，按照“2.2”色谱条件进行测定，分析得到HPLC指纹图谱(见图3)，从指纹图谱上共得到16个共有峰，确定其中1个共有峰为芦丁(10号峰)，由于芦丁在12个批次的供试品中的峰面积较大，且峰位居中，因此选择10号峰芦丁为参比峰，计算16个共有峰的相对保留时间及相对峰面积，结果见表2和表3。获得的标准指纹图谱见图4，包括16个共有特征峰(1～16)，其保留时间分别为：(1号峰)3.14min、(2号峰)6.85min、(3号峰)8.38min、(4号峰)9.52min、(5号峰)10.72min、(6号峰)12.60min、(7号峰)22.56min、(8号峰)23.08min、(9号峰)25.76min、(10号峰)30.96min、(11号峰)31.99min、(12号峰)33.05min、(13号峰)38.37min、(14号峰)39.83min、(15号峰)42.65min、(16号峰)43.48min。

表2不同地区12批亚麻荠种子指纹图谱共有峰相对峰面积

表3不同地区12批亚麻荠种子指纹图谱共有峰相对保留时间

2.4.2相似度评价

采用“中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对亚麻荠种子指纹图谱进行评价，以S1陕西亚麻荠种子样品色谱图作为参照图谱，利用中位数法进行多点校正，并生成对照指纹图谱，见图4，不同地区12批亚麻荠种子指纹图谱与对照指纹图谱的相似度见表4，结果表明相似度均大于0.98，说明不同产地亚麻荠种子质量相对稳定。

表4不同地区12批亚麻荠种子指纹图谱与对照指纹图谱的相似度

2.5方法学考察

2.5.1线性关系考察

精密量取0.2、0.4、0.5、0.8、1.3mL上述2.1.1制备的对照品溶液，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配制一系列不同浓度的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以芦丁的浓度C(μg/mL)为横坐标、峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线(见图2)，计算回归方程，芦丁在28.31～183.98μg/mL线性范围内回归方程为A＝8042.7C-1295.7(r＝0.9998)，表明该范围内线性关系良好。

2.5.2重复性试验

取陕西亚麻荠种子S1样品，按“2.1.2”项下方法平行制备样品溶液6份，按照“2.2”色谱条件分别进行测定，测得芦丁平均含量为0.46％，RSD为1.21％，记录色谱指纹图谱，测得其共有色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.50％，共有色谱峰的相对峰面积的RSD均小于1.70％，数据见表5和表6，表明该方法重复性良好，符合指纹图要求。

表5亚麻荠种子指纹图谱重复性共有峰相对峰面积

表6亚麻荠种子指纹图谱重复性共有峰相对保留时间

2.5.3稳定性试验

精密吸取陕西亚麻荠种子S1样品溶液10μL，分别于0、2、4、6、8、12、24h，注入液相色谱仪进行测定，以芦丁含量计算稳定性，平均值为0.46％，RSD为0.85％，记录色谱指纹图谱，测得其各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.60％，结果见表7和表8，表明供试品溶液在24h内稳定，符合指纹图要求。

表7亚麻荠种子指纹图谱稳定性共有峰相对峰面积

表8亚麻荠种子指纹图谱稳定性共有峰相对保留时间

2.5.4精密度试验

取陕西亚麻荠种子S1样品溶液，连续进样6次，测得芦丁平均含量为0.45％，RSD为0.80％，记录色谱指纹图谱，测得其各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.50％，结果见表9和表10，表明供试品溶液制备方法可操作性强，精密度良好。

表9亚麻荠种子指纹图谱稳定性共有峰相对峰面积

表10亚麻荠种子指纹图谱精密度共有峰相对保留时间

2.5.5回收率试验

取已知含量的同一批次的陕西亚麻荠种子S1样品共6份，称取0.50g，采取加样回收法，精密加入2.83mg，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进行色谱测定，回收率为99.37％，RSD为0.62％，结果见表11。

表11亚麻荠种子中芦丁添加回收率

2.5.6分析时间考察

取供试样品10μL，注入液相色谱仪，通过梯度洗脱进行色谱峰分离，运行75min，记录色谱图，在50min后无色谱峰出现，所以分析时间定为50min。

2.5.7空白试验

取80％甲醇10μL，注入液相色谱仪，按照“2.2”色谱条件记录色谱图。结果表明：甲醇溶剂峰集中在3min之前，对检测无干扰。