一种小分子荧光HClO探针、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种小分子荧光HClO探针、制备方法及其应用 (Small-molecule fluorescent HClO probe, preparation method and application thereof ) 是由 丁峰 戴立上 张积太 孙鹏 陈洪 于 2021-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小分子荧光HClO探针、制备方法及其应用。该小分子荧光探针由7-(二乙氨基基)香豆素-3-甲醛和2-肼基苯并噻唑基团合成而来,其中二者连接部分易被次氯酸氧化后导致2-肼基苯并噻唑基团脱落,从而生成另一香豆素衍生物,与此同时探针荧光也由绿色转为蓝色,因此可实现比色和荧光比率式、精确和快速地检测次氯酸或次氯酸根离子,可用于检测活细胞中外源性及内源性的次氯酸或次氯酸根离子。此外,它还可以检测溶液、植物豆芽、检测试纸中外源性的次氯酸或次氯酸根离子。本发明合成方法简单,操作方便,并不需要苛刻的条件,而且合成产率和纯度都很高。因此,它在次氯酸或次氯酸根离子检测方面具有良好的应用前景。(The invention discloses a small-molecule fluorescent HClO probe, a preparation method and application thereof. The micromolecule fluorescent probe is synthesized by 7- (diethylamino) coumarin-3-formaldehyde and 2-hydrazino benzothiazole groups, wherein the connecting part of the two groups is easy to be oxidized by hypochlorous acid to cause the 2-hydrazino benzothiazole groups to fall off, so that another coumarin derivative is generated, and meanwhile, the fluorescence of the probe is converted from green to blue, so that a colorimetric and fluorescent ratio type can be realized, the hypochlorous acid or hypochlorite ions can be accurately and quickly detected, and the micromolecule fluorescent probe can be used for detecting exogenous and endogenous hypochlorous acid or hypochlorite ions in living cells. In addition, it can also detect exogenous hypochlorous acid or hypochlorite ions in solution, plant bean sprouts and detection test paper. The synthesis method is simple, convenient to operate, does not need harsh conditions, and has high synthesis yield and purity. Therefore, the method has good application prospect in the aspect of hypochlorous acid or hypochlorite ion detection.)
技术领域
本发明属于荧光成像分子探针领域，具体涉及一种小分子荧光探针、制备方法及其应用。
背景技术
与羟基自由基、单线态氧、一氧化氮、超氧化物等一起，HClO或其阴离子形式(ClO-)构成了活性氧(ROS)家族。ROS几乎在所有类型的生命过程中都发挥着重要作用，从细胞信号传导到癌症进展，再到自噬。HClO是各种ROS中的重要参与者，也有助于保持我们的免疫系统功能良好。低浓度的HClO可以杀死入侵的微生物或病原体。另一方面，过量的HClO已被证明会导致DNA损伤并导致多种疾病。这些复杂的情况需要我们开发高灵敏度和高选择性的HClO探针，以监测其在所有系统内的微妙变化。
多年来，一些基于不同构建块和传感策略开发的HClO探针已被报道。其中，基于荧光的HClO探针占据了当前报道的绝大部分。总体而言，目前报道的HClO探针主要建立在香豆素(CM)或罗丹明衍生物块上。香豆素因其优异的物理和化学性质而被广泛用于构建小分子荧光探针，本申请人之前已经开发了几种CM衍生的荧光探针，它们都可以在各种模型系统中在体外和体内检测各类离子，参见中国专利申请号202110292304.X、202110297631.4。
此外，目前可用的HClO探针部分存在合成程序复杂、灵敏度和/或选择性不令人满意、水溶性差、对生物或环境检测方面应用潜力的探索不足等缺点。而且，大多数HClO探针依赖于荧光团单元的荧光增强或淬灭来实现检测，这显然比那些依赖于比率荧光响应的要差，因为其不容易受其他环境因素的影响。总之，这些不足之处敦促我们继续开发新的HClO探针。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种小分子荧光HClO探针、制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明的第一方面，提供一种小分子荧光HClO探针，其技术方案是，所述小分子荧光探针分子式为C21H21N4O2S，其结构式为：
本发明的第二个方面是提供一种如上述的小分子荧光HClO探针的制备方法，其由7-(二乙氨基基)香豆素-3-甲醛和2-肼基苯并噻唑在溶剂中反应合成。
进一步设置是所述的溶剂为乙醇。
进一步设置是7-(二乙氨基基)香豆素-3-甲醛和2-肼基苯并噻唑在溶剂中搅拌反应生成固体，反应结束后，过滤并用乙醇洗涤，干燥后得到所述的小分子荧光HClO探针。
另外，本发明还提供一种如所述的小分子荧光HClO探针在检测、识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子的应用。
本发明还提供一种用于检测、识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子的试剂或试剂盒，其包含如所述的小分子荧光HClO探针。
本发明还提供一种检测、识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子的方法，包括以下步骤：
(1)将如权利要求1所述的小分子荧光HClO探针与待测试样混合；
(2)通过判断混合前后溶液颜色是否变化可以检测、识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子，若混合后溶液荧光向蓝色变化，则可判断环境中或生物样品中存在次氯酸或次氯酸根离子。
进一步设置是所述的步骤(2)具体通过紫外分光光度法，在300nm～700nm的波长范围内测定混合前后溶液的吸光度；根据混合前后溶液的颜色变化识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子水平。
进一步设置是所述的步骤(2)具体通过荧光分光光度法，以395nm为激发波长，在420nm到720nm的波长范围内测定混合后溶液的荧光发射波长；在发射波长478和528nm下荧光发射强度比值来识别环境中或生物样品中次氯酸或次氯酸根离子水平变化。
上述技术方案中，所述生物样品为活细胞、植物豆芽或检测试纸。
本发明的有益效果如下：本发明提供的小分子荧光探针以7-(二乙氨基基)香豆素-3-甲醛和2-肼基苯并噻唑为基础而合成，具有绿色荧光，其连接部分易被次氯酸氧化后导致2-肼基苯并噻唑基团脱落，从而生成香豆素衍生物，与此同时探针荧光也由绿色转为蓝色。该小分子探针可实现比色和荧光比率式、精确和快速地检测次氯酸或次氯酸根离子，可用于检测溶液、植物豆芽、生物试纸中外源性的次氯酸根离子以及活细胞中外源性和内源性的次氯酸根离子。由于采用比率式检测，因而实验结果不易受周围环境的影响，而且该探针反应迅速(<100s)，检测限低(545nM)，在同类探针中属于领先水平，而且我们探索了其在细胞、植物豆芽及开发的简易测试试纸等不同系统中检测HClO的应用，因此它在次氯酸或次氯酸根离子检测方面具有非常良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为实施例1中小分子荧光探针合成的路线模式图；
图2为实施例1合成的小分子荧光探针的质谱；
图3为实施例1合成的小分子荧光探针的核磁碳谱；
图4为实施例2中小分子荧光探针对次氯酸识别的紫外和荧光光谱；
图5、6为实施例3中小分子荧光探针对次氯酸的选择性、速度响应性及pH适应性；
图7为实施例4中小分子荧光探针在癌细胞中检测外源性和内源性的次氯酸；
图8为实施例5中小分子荧光探针在植物豆芽中检测外源性的次氯酸；
图9为实施例6中小分子荧光探针在检测试纸中检测外源性的次氯酸；
图10为实施例7中小分子荧光探针对次氯酸识别的密度泛函理论计算。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：合成小分子荧光探针
合成小分子荧光探针的化学式如图1所示，其中EtOH为乙醇，RT为室温。
具体合成的过程如下：将7-(二乙氨基基)香豆素-3-甲醛(500mg,2.04mmol)溶解在30mL乙醇溶液中，并在室温下加入2-肼基苯并噻唑(336mg,2.04mmol)搅拌，室温搅拌反应16h，反应物经过布氏漏斗过滤并用乙醇洗涤干燥即可得到绿色目标探针固体。如图2、3所示，通过质谱、核磁以及光谱学方法可以确定该产物即为目标小分子荧光探针。
实施例2：小分子荧光探针对次氯酸响应的紫外、荧光光谱及荧光比色分析测试HClO
制备0.5mL小分子荧光探针(10.0×10-6mol/L)的EtOH/PBS(v/v＝2/8，pH-7.4)溶液。0-30μM次氯酸溶液滴加到探针溶液中，如图4(A)所示，在探针溶液中加入次氯酸后，在450nm处的主吸收带逐渐减弱，～550nm处有一个新的吸收峰，其吸光强度随HClO离子浓度逐渐增加。内图显示荧光探针溶液颜色在添加次氯酸后由本来绿色变成了无色，从而可以实现比色检测次氯酸。
在荧光滴定实验中，制备3mL小分子探针(10.0×10-6mol/L)的EtOH/PBS(v/v＝2/8，pH-7.4)溶液。0-30μM次氯酸溶液滴加到探针溶液中，以395nm为激发波长测量探针从420nm到720nm的荧光值，实验结果见图4(B)。可观察到探针的荧光发射随次氯酸浓度增加而变化，原始的528nm发射峰强度渐渐减小而新的478nm发射峰强度逐渐增加。图4(C，D)则分别对上述荧光发射比值变化与添加的次氯酸浓度做了分析和线性响应范围内的线性模拟，结果显示荧光F478/F528比值与次氯酸浓度(14-28μM)有很好的线性响应关系，揭示该探针可实现荧光比值式检测次氯酸水平。
实施例3:验证小分子荧光探针对次氯酸选择性、响应速度及pH适应性
制备5mL分子探针(10.0×10-6mol/L)的EtOH/PBS(v/v＝2/8，pH-7.4)溶液。通过将相应的盐溶于去离子水制备各种干扰介质溶液(1：HNAP-hdbt,2:·OH,3:AcO-,4:SO3 2-,5:O2 -,6:SO4 2-,7:HClO,8:NO3 -,9:H2O2,10:Cys,11:GSH,12:PO4 2-，30.0×10-6mol/L)。随后，将同等当量的次氯酸溶液和这些干扰介质分别加入到探针溶液中。通过荧光光谱进行检测，取荧光发射波长比值(F478/F528)进行对比。结果显示(图5A)，这些干扰介质对探针的荧光都没有产生和次氯酸那样明显的变化，属于ROS系列的·OH,H2O2也未产生明显的影响。只有加入次氯酸后，探针溶液荧光比值才产生很明显的变化。同时，肉眼可观察到探针溶液发生明显的颜色变化：从绿色变为近似无色(图5B左)；在UV照射下，探针溶液接触次氯酸后颜色从绿色变成蓝色，其它没有变化(图5B右)。
图6A研究了探针溶液对于次氯酸的响应速度，结果显示在100S左右，荧光比值就已经达到稳定的平衡值，这表明探针对于次氯酸响应是极其迅速的。图6B则研究了pH变化对于探针响应次氯酸的影响，结果表明在pH 4-8范围内，荧光比值并没有受多少影响，这表明了该探针广泛的适用范围。
实施例4：小分子荧光探针在癌细胞中成像效果
在癌细胞成像体系中，设立对照组(单独探针处理细胞)和实验组(探针处理后再加入不同浓度的次氯酸根离子处理或用LPS处理用于检测内源性的次氯酸)，最后通过荧光成像系统中的绿色和蓝色通道进行拍照记录。实验结果见图7。
如图7所示，在无次氯酸存在情况下，探针单独处理的癌细胞中只有有绿色荧光出现，而随着外源性次氯酸的添加，探针逐渐可以在细胞中出现蓝色荧光，而且强度也是逐步增加，同时绿色荧光逐渐减弱。当添加的次氯酸根离子浓度为30μM时，探针溶液绿色荧光几乎消失，而只显示蓝色荧光，这些结果说明探针可以检测癌细胞体内外源性的次氯酸。同样在LPS(2mg/ml)刺激细胞后，我们可以观察到细胞内有绿色和蓝色的荧光，这表面探针同样可以检测到内源性的次氯酸或次氯酸根离子，从而该探针可以实现对活细胞中外源性和内源性的次氯酸或次氯酸根离子的成像检测。
实施例5：小分子荧光探针在植物豆芽中成像效果
在植物豆芽成像体系中，设立对照组(探针先处理豆芽后用PBS处理)和实验组(探针先处理后再加入次氯酸处理)，然后通过荧光成像系统中的绿色和蓝色通道进行拍照记录，实验结果见图8。
图8中结果显示，在紫外灯(365nm)照射下，在无次氯酸存在情况下，探针单独处理的豆芽中只有绿色荧光出现。随着次氯酸的添加(30μM)，豆芽中探针只出现了蓝色荧光。这些结果同样说明探针可以检测植物豆芽中外源性的次氯酸或次氯酸根离子。
实施例6：小分子荧光探针在测试试纸中成像效果
在测试试纸体系中，设立对照组(单独探针处理试纸)和实验组(探针先处理后再加入次氯酸处理)，最后通过荧光成像系统中的蓝色通道和绿色通道分别进行拍照记录，实验结果如图9所示。
图9中结果显示，在无次氯酸存在情况下，探针单独处理的试纸中只有绿色荧光出现。随着30μM次氯酸的添加，试纸中探针只出现蓝色荧光，同时绿色荧光消失。这些结果同样说明探针可以检测试纸中外源性的次氯酸或次氯酸根离子。
实施例7：小分子荧光探针对次氯酸识别的密度泛函理论计算
图10为实施例4、5、6中小分子荧光探针对次氯酸识别的密度泛函理论计算；
在探针单独存在下和结合次氯酸根后荧光从绿到蓝的一个变化过程，其中具体产生变化的原因通过计算结合前后分子荧光探针的能级跃迁，计算两者跃迁时所需的能量是否有差别，从本质上来解释这种情况。实验结果见图10。
如图10所示，在探针单独存在下，分子探针的最高占据轨道(HOMO)的能量为-5.0462ev，最低未占据轨道(LUMO)的能量为-1.8937ev，而两者的能量差为：3.1525ev。探针在结合次氯酸后的HOMO值为-5.7321ev,以及LUMO值为-2.0943ev，其中两个轨道的能级差为：3.6378ev；由此可见探针结合次氯酸后能级差变大，这与其荧光光谱表现的蓝移相互对应。
本发明所述的小分子荧光探针可通过荧光光谱技术检测溶液中的次氯酸或次氯酸根离子。
该小分子荧光探针在次氯酸或次氯酸根离子存在下，紫外吸收主峰(～450nm红移到～550nm)和荧光发射峰(528nm蓝移到478nm)均发生显著的变化，从而可以根据紫外吸收后溶液颜色变化和荧光发射峰的比值变化来实现对次氯酸或次氯酸根离子的定量检测。
本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法合成小分子荧光探针，还可以实现紫外比色法和荧光光谱法精确传感次氯酸或次氯酸根离子，并且可以极为快速、准确的检测癌细胞、植物豆芽和检测试纸中的次氯酸或次氯酸根离子。因此在次氯酸或次氯酸根离子检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。