GhMYB44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用
阅读说明：本技术 GhMYB44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用 (Application of GhMYB44 gene in differentiation and development of cotton callus ) 是由 王晔 陈全家 葛晓阳 刘理森 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了GhMYB44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用,属于转基因技术领域。本申请通过超表达GhMYB44基因,使中棉所24植株外植体7d形成层中细胞结构发生了重组、30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征、45d愈伤组织的有类似胚性愈伤组织细胞团出现,这些表型说明该基因能够促进受体材料更快从愈伤组织分化为胚性愈伤组织,加快再生苗进程,从外植体得到再生苗时间仅需182d,比对照缩短了24.7％,为棉花基因转化和快速育种做出贡献。(The invention discloses an application of GhMYB44 gene in differentiation and development of cotton callus, belonging to the technical field of transgenosis. According to the application, the GhMYB44 gene is overexpressed, so that the cell structure in the cambium of the 7d of the explant of the plant 24 of the Zhongmiao institute is recombined, the cells of the 30d callus present small and round characteristics, and the cells of the 45d callus have embryogenic-like callus groups, and the phenotypes show that the gene can promote the receptor material to be quickly differentiated into the embryogenic callus from the callus, so that the process of the regenerated seedling is accelerated, the time for obtaining the regenerated seedling from the explant is only 182d, is shortened by 24.7% compared with the reference, and contributes to the gene transformation and quick breeding of cotton.)
技术领域
本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种GhMYB44基因在棉花遗传转化中的应用。
背景技术
棉花是世界上最主要的经济作物之一，其纤维是纺织工业的重要原料，种子是重要的油料来源，棉花纺织加工业和种植业是国民经济的重要组成部分。目前我国棉花品种的综合竞争力弱，在纤维品质，产量，抗病，耐旱及耐盐碱等方面亟需提高，培育出具有竞争力的新品种迫在眉睫，利用基因工程改良棉花品种是快速有效的途径。但现有的转基因体系，存在着转化周期长、体细胞胚畸形率高和正常再生苗数量少等问题，严重限制了基因工程在棉花品种改良中的应用。
为解决这个瓶颈问题，我们需要解析调控棉花体细胞胚胎发生的调控网络，筛选改良棉花遗传转化体系的关键基因，优化棉花体细胞胚胎发生体系，为高效创制棉花新品种奠定基础。
因此，如何提供一种可加快棉花愈伤组织分化发育的基因是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了GhMYB44基因在棉花胚性愈伤组织分化发育中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
GhMYB44基因在加快棉花愈伤组织分化发育中的应用；所述GhMYB44基因序列如SEQ ID NO.1所示；
GhMYB44蛋白在加快棉花愈伤组织分化发育中的应用；所述GhMYB44蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；
一种GhMYB44基因超表达棉花植株的愈伤组织诱导培养基，包括：含有0. 5mol/L2,4-D和0.5mol/L KT的MSB培养基；
一种GhMYB44基因超表达棉花植株的胚性愈伤组织诱导培养基，包括：含有0.5mol/L KT的MSB培养基；
一种GhMYB44基因超表达棉花植株的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取棉花幼苗下胚轴，置于权利要求3所述的愈伤组织诱导培养基中，适宜条件下，培养30-40天；
(2)待长出愈伤组织后，将愈伤组织转移至权利要求4所述的胚性愈伤组织诱导培养基中，适宜条件下培养，得胚性愈伤组织。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述适宜条件为：28±2℃，光照强度 2000Lx，光照周期16h/8h；
优选的，步骤(1)中，培养周期为30天；
还包括以下步骤：
(3)将胚性愈伤组织继代到胚状体诱导培养基中进行胚状体诱导，得胚状体；
还包括以下步骤：
(4)将胚状体继代到成苗培养基中培养得转基因幼苗；
还包括以下步骤：
(5)将转基因幼苗继代到生根培养基，长出白根后炼苗，移栽温室；
所述棉花品种为中棉所24；
综上所述，本发明公开了GhMYB44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用；通过超表达GhMYB44基因，使中棉所24植株外植体7d形成层中细胞结构发生了重组、30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征、45d愈伤组织的有细胞团出现，组织共培养时间仅需182d，比对照缩短了24.7％，为棉花组织培养和快速育种做出贡献。
附图说明
图1：为外植体诱导培养7d后组织学观察图片，A和B为超表达GhMYB44基因材料MYB44-559和MYB44-572，C为对照ZM24，D和E为抑制子材料MY B44-SRDX-9和MYB44-SRDX-55。。
图2：转基因材料和对照材料胚性愈伤组织分化率折线图；MYB44-559和MYB 44-572为超表达材料，ZM24为常规对照，MYB44-SRDX-9和MYB44-SRDX-5 5为MYB44基因抑制子材料。
图3：转基因材料与对照材料在愈伤组织诱导培养基上培养30天，然后继代到胚性愈伤组织诱导培养基20天后的形态；A和B为转基因株系，C和D为对照 ZM24。
图4：转基因材料与对照材料光学和扫描电镜图片；A依次为MYB44-559、MY B44-572、ZM24、MYB44-SRDX-9和MYB44-SRDX-55在愈伤组织培养基上培养30天的解剖镜图片；B依次为MYB44-559、MYB44-572、ZM24、MYB44-S RDX-9和MYB44-SRDX-55在愈伤组织培养基上培养30天的扫描电镜图片；C 依次为MYB44-559、MYB44-572、ZM24、MYB44-SRDX-9和MYB44-SRDX- 55在愈伤组织培养基上培养30天后，继代到胚性愈伤组织诱导培养基上培养1 5天的解剖镜图片；D依次为MYB44-559、MYB44-572、ZM24、MYB44-SRD X-9和MYB44-SRDX-55在愈伤组织培养基上培养30天后，继代到胚性愈伤组织诱导培养基上培养15天的扫描电镜图片。
图5：转基因材料缩短棉花转化周期。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的棉花品种陆地棉(Gossypium hirsutumL.)品种中棉所24来源于中国农业科学院棉花研究所种质库，在下文中简称中棉所24。下述实施例中的设计的激素sigma公司产品；培养基及其他产品来自试剂公司；
MSB培养基：溶质及其浓度为：NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，K H2PO4 170mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，FeSO4·7H2O 27.85mg/L，Na2EDTA 37.25mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg /L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.83mg/L，Na2MOO4·2H2O 0.25mg/L，CuSO4·5H2O 0. 025mg/L，COCl2·6H2O 0.025mg/L，肌醇100mg/L，VB110mg/L，VB 6 1.0mg /L，烟酸1.0mg/L，28g/L蔗糖，5.6g/L琼脂；溶剂为蒸馏水；pH5.8；
愈伤组织诱导培养基：向MSB培养基加入2,4-D和KT，使2,4-D和KT含量均为0.5mol/L，得愈伤组织诱导培养基；
胚性愈伤组织诱导培养基：向MSB培养基加入KT和IAA至其含量为0.5 mol/L，得胚性愈伤组织诱导培养基
胚状体诱导培养基：向MSB培养基加入KT和6-BA至其含量为0.01mol/ L，得胚状体诱导培养基。
成苗培养基：向MSB培养基加入IAA和6-BA至其含量为0.05mol/L，得成苗培养基。
生根培养基：向MSB培养基加入6-BA至其含量为0.1mol/L，得成苗培养基。
无菌苗培养基：溶质及其浓度为：NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L， KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L，25g/L蔗糖， 2g/L植物凝胶；溶剂为蒸馏水；pH5.8。
实施例1中棉所24超表达35S::GhMYB44植株的获得
GhMYB44超表达载体的构建：
将植物表达载体pCambia2300的限制性核酸内切酶XbaI识别序列和限制性核酸内切酶KpnII识别序列间的DNA(植物表达载体pCambia2300被限制性核酸内切酶XbaI和KpnII切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为核苷酸序列是SEQ ID No.1(GhMYB44)的DNA分子，保持植物表达载体 pCambia2300的其它序列不变得到GhMYB44基因表达载体，其名称为pCambi a2300-35S:GhMYB44。
阳性农杆菌的获得
将重组载体pCambia2300-35S:GhMYB44导入根癌农杆菌LBA4404感受态中，经PCR鉴定后得到含有重组载体pCambia2300-35S:GhMYB44的重组农杆菌。
转基因过程：
将阳性农杆菌接种至含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL利福平，50μg/mL链霉素的LB液体培养基中活化；在转化棉花的当天，将活化的菌按1：100的比例接种到50mL的新的含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL利福平，50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，在28℃，190rpm的摇床中培养至使OD600的值到0.3- 0.4之间。
在灭菌的培养皿中将棉花下胚轴切成0.5-0.8cm长的切断，倒入培养好的农杆菌浸染3分钟左右后倒出菌液，用无菌滤纸把下胚轴切段上的残留菌液吸除，然后将下胚轴转移至MSB基本培养基上，在黑暗条件下23℃的培养箱共培养4 8h。
两天后，将下胚轴转移至含卡那霉素(50mg/L)和头孢(200mg/L)的愈伤组织诱导培养基上，28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，培养30天左右，得愈伤组织；
将形成的愈伤组织转移至含卡那霉素和头孢的胚性愈伤组织诱导培养基中，28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，培养60天左右，得胚性愈伤组织；
将分化出的胚性愈伤组织继代到胚状体诱导培养基上，28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，15-20d继代一次，直至长出幼芽；
将幼芽组织继代到成苗培养基上，待长出幼苗后，进一步转接到再生苗生根培养基中做生根培养，28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下， 15-20d条件下生根两周，之后将再生苗从培养基中取出，泡在自来水中，28± 2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，进行炼苗，一周后移栽到花盆里，得中棉所24超表达35S::GhMYB44植株。
实施例2
将转基因获得的过表达GhMYB44-1棉花不同株系的种子GhMYB44-559和 GhMYB44-574脱绒后剥去棉籽的外壳后，棉仁用0.1％的升汞浸泡消毒5min，然后用无菌水冲洗3-5次，播于无菌苗培养基上使其萌发并长成无菌苗。在无菌工作台上，用经过酒精灯火焰消毒的手术刀片将生长至7天的无菌苗的下胚轴切成0.5厘米的小段，放入棉花愈伤组织诱导培养基，28±2℃，人工光照强度2 000Lx，光照周期16h/8h条件下，进行组织培养30天，得愈伤组织。
将长出愈伤组织的外植体切段继代到棉花胚性愈伤组织诱导培养基中，28± 2℃，人工光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，培养30天，得胚性愈伤组织。
将胚性愈伤组织继代到胚状体诱导培养基中，28±2℃，人工光照强度2000 Lx，光照周期16h/8h条件下，进行胚状体诱导培养30d，得胚状体。
将胚状体继代到成苗培养基上，28±2℃，人工光照强度2000Lx，光照周期 16h/8h条件下，培养60天，待长出幼苗后，进一步转接到再生苗生根培养基中做生根培养，28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，生根30天，之后将再生苗从培养基中取出，泡在自来水中，28±2℃，光照强度2000Lx，光照周期16h/8h条件下，进行炼苗，一周后移栽到花盆里，得植株幼苗，统计培养时间结果如图5所示。
从组织培养40d开始观察愈伤组织分化情况，分别于40d，50d，60d，80d 统计分化效率，结果如图2所示；通过扫描电镜进一步观察发现，超表达外植体45d的愈伤组织，结果如图4所示。
通过体细胞胚胎发生过程的转录组数据分析，发现GhMYB44基因在体细胞胚发育过程显著上调表达，因此，推测GhMYB44基因可能在棉花体细胞胚发育过程中发挥着重要的作用。为了验证GhMYB44在棉花体细胞胚胎发生过程中的功能，我们构建了超表达并转化棉花。结果发现超表达GhMYB44抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖，超表达GhMYB44促进胚性愈伤组织的产生及体细胞胚的发生。对GhMYB44的超表达材料进行了组织学观察和电镜扫描，结果发现在愈伤组织诱导培养基上诱导7d后，在35S::MYB44的形成层中细胞结构发生了重组，而对照ZM24中维管细胞过度增殖，形成层区域起始不明显 (图1)。为了进一步观察发现超表达外植体30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征，而对照ZM24外植体愈伤组织细胞大而长。通过扫描电镜进一步观察发现，超表达外植体45d愈伤组织的有细胞团出现，是胚性愈伤组织前期形态。而对照ZM24外植体愈伤组织细胞松散，不成团(图2)。将转基因材料和对照中棉所24在愈伤组织诱导和分化培养基上进行培养。分别在40d，50d，60d，8 0d统计分化效率，结果发现，过表达材料的分化率远远高于对照中棉所24(图 3)。
对比例1
中棉所24重复实施例2的操作，182d后，未能得到植株幼苗，结果如图1 -5所示。
对比例2
在北京金唯智生物科技公司合成KpnI-SRDX-SacI序列，得到带有KpnI 和SacI双酶切位点的SRDX与pUC19-T相连的重组质粒，将重组质粒构建到 pAMBIA2300载体上，转化棉花，得到两个株系，为是嵌合抑制子表达载体材料；GhMYB44-SRDX-9和GhMYB44-SRDX-55重复实施例2的操作，结果如图 1-5所示。
对比例3
中棉所24按照正常组织培养方法进行培养(如图5所示)，即将胚性愈伤组织诱导培养基培养时间和胚状体诱导培养基培养时间均延长30d，其余操作与实施例2相同，结果242d后可得到植株幼苗。
结果分析
通过体细胞胚胎发生过程的转录组数据分析，发现GhMYB44基因在体细胞胚发育过程显著上调表达，因此推测GhMYB44基因可能在棉花体细胞胚发育过程中发挥着重要的作用。为了验证GhMYB44在棉花体细胞胚胎发生过程中的功能，我们构建了超表达并转化棉花。结果发现超表达GhMYB44抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖，超表达GhMYB44促进胚性愈伤组织的产生及体细胞胚的发生。对GhMYB44的超表达材料进行了组织学观察和电镜扫描，结果发现在MSB培养基上诱导7d后，在35S::MYB44的形成层中细胞结构发生了重组，而对照ZM24中维管细胞过度增殖，形成层区域起始不明显(图3)。为了进一步观察发现超表达外植体30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征，而对照ZM24外植体愈伤组织细胞大而长。通过扫描电镜进一步观察发现，超表达外植体45d愈伤组织的有细胞团出现，是胚性愈伤组织前期形态。而对照Z M24外植体愈伤组织细胞松散，不成团(图4)。将转基因材料和对照中棉所2 4在愈伤组织诱导和分化培养基上进行培养。分别在40d，50d，60d，80d统计分化效率，结果发现，过表达材料的分化率远远高于对照中棉所24(图2)。共培养时间对照ZM24为242d，而ZM24-35S::MYB44转基因植株为182天，转基因植株比对照缩短了24.7％(如图5所示)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 新疆农业大学
中国农业科学院棉花研究所
<120> GhMYB44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 855
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcttgta caaggaaaga tattgatcgg attaaaggtc catggagtcc agaagaagat 60
gaggctttaa agcgtctggt tcaaacctac ggttccagga actggtcttt ggtaagtaaa 120
tcgataccgg gtcgatctgg aaagtcttgt aggctacggt ggtgcaacca gctttcccct 180
gatgttgaac accgaccctt cactcccgag gaagacgata ccatagcccg agcccatact 240
cgattcggta acaaatgggc taccattgct cgattcctca atggtcgaac cgataacgcg 300
attaagaacc actggaactc tactctcaag cgaaaatgct cttcgatgac cgatgatatg 360
aacgacgatt cacctcagcc gcttaaaaag tcagctagtc tcaatactgg taatggtgga 420
ctgggtctct acttgaactc gagaagtcct tcaggatccg atttgagtga tttgagtttg 480
cccattgcct caccggtaac aataacgggg tctttggtgc cttcaactca aacagcatcc 540
tcggctactg atcctcctac tttactcagc ctctcgttac ccggatcaga tactagtgaa 600
atcactgact taggacccgt atccaactct ttcccaagtt ctaccttggt ggcagaacca 660
gcaactgttc cggctctgaa gttgcagatg gagaagcagt ttttgaacgc tgagttattg 720
gcagtgatgc aagagatgat aagaaaagaa gtacggaagt acatgagtgg gagtgaatcc 780
aatgggcttt gttttcgaac ggaggccatt agaaaagccg tcgttaagcg tatcgggatt 840
agtaagatcg agtga 855
<210> 2
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Arg Ile Lys Gly Pro Trp Ser Pro Glu Glu Asp Asp Leu Leu
1 5 10 15
Gln Lys Leu Val Gln Lys Tyr Gly Pro Arg Asn Trp Ser Leu Val Ser
20 25 30
Lys Ser Ile Pro Gly Arg Ser Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Cys
35 40 45
Asn Gln Leu Ser Pro Gln Val Glu His Arg Ala Phe Thr Pro Glu Glu
50 55 60
Asp Glu Thr Ile Ile Arg Ala His Ala Arg Phe Gly Asn Lys Trp Ala
65 70 75 80
Thr Ile Ala Arg Leu Leu Asn Gly Arg Thr Asp Asn Ala Ile Lys Asn
85 90 95
His Trp Asn Ser Thr Leu Lys Arg Lys Cys Leu Ser Val Gly Glu Glu
100 105 110
Ser Tyr Phe Ile Thr His Gly Gly Tyr Asp Gly Asn Leu Gly Gly Glu
115 120 125
Gly Glu Gln Gln Pro Leu Lys Arg Ser Val Ser Ala Gly Leu Tyr Met
130 135 140
Ser Pro Gly Ser Pro Ser Gly Ser Asp Leu Ser Asp Ser Ser Val Pro
145 150 155 160
Val Leu Ser Ser Ser His Val Tyr Lys Pro Ile Pro Arg Thr Gly Gly
165 170 175
Val Asn Val Asp Val Asn Val Met Pro Leu Pro Gly Ala Glu Ala Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Ser Asn Asp Pro Pro Thr Ser Leu Ser Leu Ser Leu Pro
195 200 205
Gly Ala Glu Ser Tyr Glu Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Val Thr Glu
210 215 220
Ser Thr Gln Thr Arg Asn Glu Ala Lys Asn Asp Gly Lys Gly Gly Gly
225 230 235 240
Val Met Gly Phe Ser Ala Glu Phe Met Ala Val Met Gln Glu Met Ile
245 250 255
Arg Met Glu Val Arg Asp Tyr Met Val Gln Met Gln Gln Gln Asn Gly
260 265 270
Gly Val Ser Gly Gly Glu Gly Met Gly Met Cys Leu Asp Ala Gly Phe
275 280 285
Arg Asn Val Leu Ser Met Ser Arg Val Gly Val Asn Lys Ile
290 295 300