黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用
阅读说明：本技术 黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用 (Cucumber CsSTK gene, protein, expression vector and application ) 是由 刘�东 秦智伟 辛明 张艳菊 周秀艳 潘春清 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用,属于分子生物学技术领域。本申请公开一种黄瓜CsSTK基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；由所述的CsSTK基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；含有所述的CsSTK基因的表达载体。还公开所述的CsSTK基因或所述的蛋白或所述的表达载体在提高黄瓜棒孢叶斑病的抗性中的应用。本发明通过基因工程验证了通过过表达CsSTK得到的转基因植物,经接种鉴定,黄瓜棒孢叶斑病发病症状明显减轻,说明过表达CsSTK可以明显增强对黄瓜棒孢叶斑病的抗性。(The invention discloses a cucumber CsSTK gene, a cucumber CsSTK protein, an expression vector and application, and belongs to the technical field of molecular biology. The application discloses a cucumber CsSTK gene, the nucleotide sequence of which is shown as SEQ ID NO: 1 is shown in the specification; the amino acid sequence of the protein coded by the CsSTK gene is shown as SEQ ID NO: 2 is shown in the specification; an expression vector containing the CsSTK gene. Also discloses the application of the CsSTK gene or the protein or the expression vector in improving the resistance of cucumber corynespora leaf spot. According to the invention, genetic engineering verifies that the disease symptoms of cucumber corynespora leaf spot are obviously relieved by inoculating and identifying the transgenic plant obtained by over-expressing CsSTK, which indicates that the resistance to the cucumber corynespora leaf spot can be obviously enhanced by the over-expressing CsSTK.)
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用。
背景技术
黄瓜(学名：Cucumis sativus L.)葫芦科一年生蔓生或攀援草本植物，在中国各地普遍栽培。在生产中黄瓜易受多种病原菌的侵染，严重影响其产量和品质。黄瓜棒孢叶斑病是一种常见的真菌病害，主要是由病原真菌多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)引起。现有的防治方法主要是采用化学方法进行防治，长期使用化学手段进行防治，虽能够对黄瓜棒孢叶斑病起到防治作用，但长期使用易导致病原菌抗药性的产生。同时化学农药残留对土壤以及人类健康都带来不利影响。针对这种情况，目前主要是采用培育新的抗性品种或者寻找更安全的生物制剂，但是培育抗性品种需要时间长且目前棒孢叶斑病抗性品种极为缺少，而生物制剂虽然相对化学制剂更安全，但是成本高，起效慢。另外，目前对于黄瓜棒孢叶斑病研究甚少，多集中在病原菌生理生化、抗药性、遗传多样性方面的研究，对于抗病机理方面的研究仍处于起步阶段。
随着分子技术不断的进步以黄瓜基因组测序的完成，黄瓜基因组中多种转录因子已被系统分析，如ERF、MLO等，但目前对于黄瓜STK基因功能的研究甚少，尤其是黄瓜STK基因与棒孢叶斑病抗性间的相关研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过在感病品种中过表达CsSTK明显增强对黄瓜棒孢叶斑病的抗性。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种黄瓜CsSTK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：
atgtcaaaggttcttgcagcaatattaggaggttctgcaggagccgtggcattggtgggattgattattatacttttaagattcttagcacgctcgagaaacactgcaagaacttccgagactggctcttctgatccatctgttcaagtgggaaggcatgttggtattgaattgactctacgagatgctaggcgttttgagatggcagagttggtgttggccactaatgatttcagcgacaagaacttgattggagaagggaaatttggggaggtctataagggtatgcttcaggatggaatgttcgtcgctataaaaaagcggcatggagcgcctagtcaggatttcgtagatgaggtacactacctctcgtctattcagcatcgaaatctcgtgactcttttgggctactgccaggaaaataatctacagtttctcatctttgattatatacccaacggaagtgtttctagccacatatatggcactgagcagcgttcggctgagaagctggagttcaagatcagactctcaatagctctgggggcagctaaaggtctgtcacatcttcactccatgagccctcgtttgacacacagaaacttcaagacatccaacgttcttgtagatgagaattttatagctaaagtggcagatgcaggacttcacaatgtcatgcgaagatttgacgtttcagaatcatcgtcccgagcaacagcagatgagatatttcttgcacctgaggtaaaagagtttcgacaattttccgagaaaagtgacgtatatagtttcggcgtattccttttggagttggtaagcggtcaaaaagcgactgatgcacctgtttccaatcccaattatactctggtggactggatacaaaacaatcagagaaagagcgatattggtagcattacggatccaaggttagggaagagcttcactgaggaaggtatgggtgaactaatggatttgatacttcaatgcgtcgaatattcaagcgagaggcgtccagtgatgagctacgtggtgacagagctggaaaggatactggagaaagagatgaacttaacaacagtgatgggagaaggaagcccaactgttactcttgggagtcagttgttcaaaaccacaaagtaa。
本发明还提供由所述的CsSTK基因编码的蛋白。
优选的是，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：2：
MSKVLAAILGGSAGAVALVGLIIILLRFLARSRNTARTSETGSSDPSVQVGRHVGIELTLRDARRFEMAELVLATNDFSDKNLIGEGKFGEVYKGMLQDGMFVAIKKRHGAPSQDFVDEVHYLSSIQHRNLVTLLGYCQENNLQFLIFDYIPNGSVSSHIYGTEQRSAEKLEFKIRLSIALGAAKGLSHLHSMSPRLTHRNFKTSNVLVDENFIAKVADAGLHNVMRRFDVSESSSRATADEIFLAPEVKEFRQFSEKSDVYSFGVFLLELVSGQKATDAPVSNPNYTLVDWIQNNQRKSDIGSITDPRLGKSFTEEGMGELMDLILQCVEYSSERRPVMSYVVTELERILEKEMNLTTVMGEGSPTVTLGSQLFKTTK。
本发明还提供含有所述的CsSTK基因的表达载体。
本发明还提供一种利用所述的表达载体构建的转化体。
本发明还提供所述的CsSTK基因或所述的蛋白或所述的表达载体在提高黄瓜棒孢叶斑病的抗性中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
1.本发明利用基因工程技术，利用基因表达分析、基因克隆以及序列分析技术，分析了黄瓜相关基因序列信息。
2.本发明构建了含有黄瓜CsSTK基因的过表达载体，可直接用于黄瓜遗传转化。
3.本发明提供的黄瓜CsSTK基因是一个新的黄瓜响应棒孢叶斑病的编码基因，通过农杆菌介导的转化法将过表达载体pCXSN-CsSTK转入黄瓜子叶节后过表达CsSTK基因，接种棒孢叶斑病菌后，转基因植株发病症状明显比感病品系D0401发病症状轻，说明过表达CsSTK的感病品种对黄瓜棒孢叶斑病的抗性明显增强。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为CsSTK PCR产物、酶切鉴定；M：DNA marker 2K；1：PCR产物；2：质粒EcoRI酶切鉴定；
图2为pCXSN-CsSTK过量表达载体的PCR检测；M：DNA marker 2K；1-5：PCR产物；
图3为菌液PCR检测；M：DNA marker 2K；1-5：PCR产物；
图4为转基因阳性植株获得过程；a：播种；b：子叶节共培养；c-d：子叶节分化；e：分化芽生根；f：驯化；
图5为转CsSTK的D0401抗性植株的PCR检测；M：DNA marker 2K；+：阳性对照；-：无菌水对照；C：阴性对照；K：pCXSN-1250；1-13：转CsSTK基因的抗性植株；
图6为CsSTK转基因植株接种鉴定；OE2、OE5、OE7：T0代过表达CsSTK株系中表达量最高的3株；D9320：抗病系；D0401：感病系；
图7为过表达植株基因表达分析；Col：对照；OE-STK：过表达CsSTK植株；OE-ERF：过表达CsERF004植株；
图8为过表达CsSTK植株激素水平分析；
图9为无终止密码子的CsSTK开放阅读框PCR检测；M：DNA marker 2K；1：PCR产物；
图10为35S-CsSTK-eGFP表达载体PCR检测与双酶切鉴定；M：DNA marker 2K；1：PCR检测；2：质粒双酶切鉴定；
图11为35S-CsSTK-eGFP融合表达载体的PCR检测；M：DNA marker 2K；1-7：PCR产物；
图12为35S-CsSTK-eGFP融合蛋白在拟南芥原生质体中定位分析。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所涉及的黄瓜品种D9320和D0401均有东北农业大学园艺园林学院黄瓜课题组提供。
实施例1黄瓜CsSTK基因的克隆
以接种病原棒孢叶斑病菌48h后的D9320新鲜叶片cDNA为克隆模板，利用Primerpremier 6.0设计克隆CsSTK基因全长的特异性引物并进行PCR扩增。
特异性引物如下：
CsSTK-F：ATGTCAAAGGTTCTTGCAGC
CsSTK-R：TTACTTTGTGGTTTTGAACAACTG
20μL扩增反应体系，具体包括如下组分：2×Taq PCR MasterMix 10μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、cDNA模板1μL、ddH2O 8μL。
PCR扩增程序：94℃2min；94℃30s、52℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃Hold。
将扩增所得目的片段与pEASY-T3载体连接获得pEASY-T3-CsSTK大肠杆菌菌液，进行PCR鉴定并送往哈尔滨擎科生物公司测序，电泳结果显示在1140bp位置均出现目的条带，测序结果使用DNAMAN 8进行序列比对分析，结果100％正确，使用限制性内酶切EcoRI对质粒pEASY-T3-CsSTK进行单酶切鉴定(图1)，表明CsSTK克隆成功。经测定，CsSTK基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2植株过表达载体的构建及转化
利用克隆基因CsSTK的序列全长引物进行克隆并胶回收。pCXSN-1250载体是植物表达载体，含有35s启动子，用限制性核酸内切酶XcmⅠ单酶切pCXSN-1250空载体。将切割好的空载体和目的片段按照比例混合好，使用T4连接酶16℃连接16h，获得pCXSN-CsSTK过量表达载体，使用冻融法将其转入DH-5α感受态细胞。在含有Kan的培养基上筛选培养，12h后进行菌落PCR鉴定。
pCXSN-CsSTK测序引物：
pCXSN-1250-F：CGGCAACAGGATTCAATCTTA；
pCXSN-1250-R：CAAGCATTCTACTTCTATTGCAGC。
扩增体系和反应程序同实施例1。
PCR产物电泳结果显示，在1140bp位置出现目的条带(图2)。将该菌液送往公司测序后，测序结果完全正确，说明CsSTK已成功构建到pCXSN-1250载体上，可进行后续试验。
将重组质粒按照说明书导入根癌农杆菌感受态细胞内，在YEB固体培养基(含Kan和利福平)中培养，待长出单菌落，使用基因引物进行鉴定(所用引物、反应体系以及反应程序同实施例1)，在1140bp位置存在目的条带(图3)，表明pCXSN-CsSTK过量表达载体导入根癌农杆菌成功。
实施例3转基因阳性植株获得
将种子在温水中浸泡30min后，去除种皮，使用75％乙醇消毒1min并去除种子的表面张力，再使用2-3％次氯酸钠消毒10min，灭菌水冲洗多次，除去种子表面的消毒液，使用灭菌滤纸吸干水分后，均匀的摆布在发芽培养基(MS固体粉末4.33g·L-1+30g·L-1蔗糖+2g·L-1植物凝胶，pH＝5.8)上，28℃黑暗培养48h。
使用1/2MS培养基(1/2MS固体粉末4.33g·L-1+30g·L-1蔗糖，pH＝5.8)重悬上述pCXSN-CsSTK过量表达载体导入根癌农杆菌菌体后，在无菌条件下，切去上述培养的种子表面保护膜，扒开子叶，去除生长点及下胚轴，并使用菌液进行震荡侵染，无菌滤纸吸干子叶节表面菌液后，转至共培养培养基(发芽培养基+0.5mg·L-16-BA+1.0mg·L-1ABA，pH＝5.8)在黑暗条件下进行共培养，2d后子叶节微微卷曲且周围长出农杆菌菌落，此时将子叶节转至分化培养基(共培养培养基+400mg·L-1头孢噻肟钠(Cef)+1.0mg·L-1草甘膦，pH＝5.8)，置于组织培养室进行培养，子叶节逐渐长大且变绿，10d后在去除胚轴位置长出分化芽，28d左右，分化芽生长成明显的黄瓜植株，将分化芽完整切下，放入生根培养基(发芽培养基+400mg·L-1Cef，pH＝5.8)，7d分化芽底部明显长出主根和侧根，将其转移至蛭石与土壤且1:1均匀混合的营养钵内，置于人工气候箱进行驯化培养，使用塑料薄膜进行保湿，随驯化进程推进，不断撤下塑料薄膜(图4)。
实施例4转基因阳性植株分子生物学检测
以待鉴定植株DNA为模板，pCXSN-CsSTK菌液为阳性对照，分别用无菌水、正常植株DNA和转pCXSN-1250空载体植株DNA作为阴性对照。使用pCXSN-1250-F/R进行PCR扩增。
扩增引物如下：
pCXSN-1250-F：CGGCAACAGGATTCAATCTTA；
pCXSN-1250-R：CAAGCATTCTACTTCTATTGCAGC。
扩增条件和反应程序同实施例1。
如图5所示，以无菌水和非转基因黄瓜植株总DNA作为阴性对照的泳道无目的条带出现，以转pCXSN-1250空载体植株叶片总DNA作为阴性对照的在750bp位置存在条带，阳性对照和转基因成功植株均在目标位置出现目的条带且与阴性对照存在差别，说明pCXSN-CsSTK已经成功转入黄瓜植株。
实施例5CsSTK转基因植株接种鉴定
黄瓜棒孢叶斑病菌[Corynespora cassiicola(Berk&Curt)Wei.]，由天津科润黄瓜研究所赠予。将制备好的1×105个孢子·mL-1的孢子悬浮液10μL·滴-1离体接种于叶背面，接种30滴。培养条件为26/18℃昼夜温度，16/8h光周期，持续保湿。接种7d进行病害调查。
选取上述实施例4中获得CsSTK相对表达量高的3株T0代植株叶片进行接种鉴定，具体步骤为：将制备好的1×105个黄瓜棒孢叶斑病菌(Corynespora cassiicola(Berk&Curt)Wei.，由天津科润黄瓜研究所赠予)孢子·mL-1的孢子悬浮液10μL/滴离体接种于叶背面，接种30滴。培养条件为26℃/18℃昼夜温度，16h/8h光周期，持续保湿。接种7d进行病害调查。以D9320和D0401作为抗病、感病对照。离体接种病原菌7d后进行调查。
结果显示，感病品系D0401在接种黄瓜棒孢叶斑病菌后，叶片明显变黄，整个叶片均呈水渍状，发病症状明显，而转基因植株叶片仅在局部呈现水渍状，发病症状明显比感病品系D0401发病症状轻，说明过表达CsSTK的感病品种对黄瓜棒孢叶斑病的抗性明显增强(图6)。
实施例6转基因植株基因表达分析
利用qRT-PCR技术对过表达CsSTK进行基因表达分析,同时由于CsSTK基因下游基因CsERF004过表达也能增强黄瓜抗性，因此，将CsSTK基因和CsERF004基因进行对比分析。
如图7所示，结果显示：过表达CsERF004植株中CsERF004、CsPR1和CsPR4均显著上调表达；过表达CsSTK植株中CsSTK、CsERF004、CsPR1和CsPR4均显著上调表达。根据基因表达结果可以看出，过表达CsSTK和过表达CsERF004都会引起CsPR1和CsPR4的上调表达；过表达CsSTK后会使CsERF004显著上调表达，但过表达CsERF004后CsSTK的表达并没有显著性变化。
实施例7CsSTK转基因植株不同物质含量的水平分析
参照气相色谱法(刘东.黄瓜霜霉病及棒孢叶斑病双抗性分子机制的研究[D].哈尔滨：东北农业大学博士学位论文，2017.)和酶联免疫法(Zhao J，Li G，Yi G X，etal.Comparison between conventional indirect competitive enzyme-linkedimmunosorbent assay(icELISA)and simplified icELISA for small molecules[J].Analytica Chimica Acta，2006，571(1)：79-85.)分别对转基因植株进行乙烯释放量、水杨酸和茉莉酸甲酯含量的测定。
结果如图8所示，结果显示过表达CsSTK植株中的水杨酸含量和乙烯释放量均显著高于对照，茉莉酸甲酯含量显著低于对照。
实施例8CsSTK基因亚细胞定位分析
1、35S-CsSTK-eGFP瞬时表达载体构建
通过提取接种棒孢叶斑病菌48h的抗病品种D9320叶片RNA，以反转录(使用北京DiNing公司的5×Integrated RT MasterMix进行cDNA第一链的合成。按照产品的说明书，具体操作流程如下：
向200μL灭菌且预冷的EP管中加入RNA样品2pg～2μg、4×DIRT Reaction Mix 4μL，加DEPC-ddH2O补充至16μL，42℃孵育2min进行去除gDNA步骤后，立即将EP管置于冰上且将管内液体全部收集到管底，再加入5×Integrated RT MasterMix 4μL，在PCR仪内42℃孵育20min后，于85℃孵育5min以终止反应，cDNA第一链的合成完毕，置于-20℃保存。经序列分析后，使用GFP-CsSTK-F/R进行克隆，获得不含有终止密码子的CsSTK开放读码框(图9)。
CsSTK瞬时表达载体构建引物：
GFP-CsSTK-F CCAAGCTTATGTCAAAGGTTCTTGCAGCAATA
GFP-CsSTK-R GGACCCGGGTCTTTGTGGTTTTGAACA
克隆反应体系和反应程序和实施例1相同。
克隆得到的基因序列进行测序，测序结果使用DNAMAN 8进行序列比对100％正确，说明CsSTK开放阅读框克隆成功，可进行后续试验。
将pGII-eGFP空载体和PCR回收产物分别进行双酶切(BamHI和SmalI)，胶回收后两样品按照比例混合，再用T4连接酶对两回收产物进行连接，得到35S-CsSTK-eGFP瞬时表达载体，将PCR产物及双酶切产物进行电泳的结果显示，均在1140bp位置出现目的条带(图10)，说明CsSTK成功构建到pGII-eGFP载体上，35S-CsSTK-eGFP瞬时表达载体构建完成，可用于后续试验。
2、35S-CsSTK-eGFP瞬时表达载体导入根癌农杆菌
分别提取35S-CsSTK-eGFP融合表达载体和pGII-eGFP空载体质粒，将两载体分别转化至含有辅助质粒pSoup的GV3101农杆菌感受态中，48h黑暗倒置培养，长出单菌落后，进行PCR鉴定，PCR产物电泳结果显示1140bp位置出现目的条带(图11)，说明35S-CsSTK-eGFP融合表达载体成功转入根癌农杆菌。
3、提取拟南芥的原生质体细胞，然后将35S-CsSTK-eGFP融合表达载体和pGII-eGFP空载体分别导入拟南芥原生质体中，在激光共聚焦显微镜下，观察35S-CsSTK-eGFP融合表达蛋白的亚细胞定位情况。
结果显示，pGII-eGFP蛋白在细胞各部位都呈现荧光信号，而35S-CsSTK-eGFP融合表达蛋白仅在细胞膜上出现绿色荧光信号(图12)。说明CsSTK是细胞膜定位蛋白，在细胞膜上行使主效功能。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 黄瓜CsSTK基因、蛋白、表达载体及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcaaagg ttcttgcagc aatattagga ggttctgcag gagccgtggc attggtggga 60
ttgattatta tacttttaag attcttagca cgctcgagaa acactgcaag aacttccgag 120
actggctctt ctgatccatc tgttcaagtg ggaaggcatg ttggtattga attgactcta 180
cgagatgcta ggcgttttga gatggcagag ttggtgttgg ccactaatga tttcagcgac 240
aagaacttga ttggagaagg gaaatttggg gaggtctata agggtatgct tcaggatgga 300
atgttcgtcg ctataaaaaa gcggcatgga gcgcctagtc aggatttcgt agatgaggta 360
cactacctct cgtctattca gcatcgaaat ctcgtgactc ttttgggcta ctgccaggaa 420
aataatctac agtttctcat ctttgattat atacccaacg gaagtgtttc tagccacata 480
tatggcactg agcagcgttc ggctgagaag ctggagttca agatcagact ctcaatagct 540
ctgggggcag ctaaaggtct gtcacatctt cactccatga gccctcgttt gacacacaga 600
aacttcaaga catccaacgt tcttgtagat gagaatttta tagctaaagt ggcagatgca 660
ggacttcaca atgtcatgcg aagatttgac gtttcagaat catcgtcccg agcaacagca 720
gatgagatat ttcttgcacc tgaggtaaaa gagtttcgac aattttccga gaaaagtgac 780
gtatatagtt tcggcgtatt ccttttggag ttggtaagcg gtcaaaaagc gactgatgca 840
cctgtttcca atcccaatta tactctggtg gactggatac aaaacaatca gagaaagagc 900
gatattggta gcattacgga tccaaggtta gggaagagct tcactgagga aggtatgggt 960
gaactaatgg atttgatact tcaatgcgtc gaatattcaa gcgagaggcg tccagtgatg 1020
agctacgtgg tgacagagct ggaaaggata ctggagaaag agatgaactt aacaacagtg 1080
atgggagaag gaagcccaac tgttactctt gggagtcagt tgttcaaaac cacaaagtaa 1140
<210> 2
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Lys Val Leu Ala Ala Ile Leu Gly Gly Ser Ala Gly Ala Val
1 5 10 15
Ala Leu Val Gly Leu Ile Ile Ile Leu Leu Arg Phe Leu Ala Arg Ser
20 25 30
Arg Asn Thr Ala Arg Thr Ser Glu Thr Gly Ser Ser Asp Pro Ser Val
35 40 45
Gln Val Gly Arg His Val Gly Ile Glu Leu Thr Leu Arg Asp Ala Arg
50 55 60
Arg Phe Glu Met Ala Glu Leu Val Leu Ala Thr Asn Asp Phe Ser Asp
65 70 75 80
Lys Asn Leu Ile Gly Glu Gly Lys Phe Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met
85 90 95
Leu Gln Asp Gly Met Phe Val Ala Ile Lys Lys Arg His Gly Ala Pro
100 105 110
Ser Gln Asp Phe Val Asp Glu Val His Tyr Leu Ser Ser Ile Gln His
115 120 125
Arg Asn Leu Val Thr Leu Leu Gly Tyr Cys Gln Glu Asn Asn Leu Gln
130 135 140
Phe Leu Ile Phe Asp Tyr Ile Pro Asn Gly Ser Val Ser Ser His Ile
145 150 155 160
Tyr Gly Thr Glu Gln Arg Ser Ala Glu Lys Leu Glu Phe Lys Ile Arg
165 170 175
Leu Ser Ile Ala Leu Gly Ala Ala Lys Gly Leu Ser His Leu His Ser
180 185 190
Met Ser Pro Arg Leu Thr His Arg Asn Phe Lys Thr Ser Asn Val Leu
195 200 205
Val Asp Glu Asn Phe Ile Ala Lys Val Ala Asp Ala Gly Leu His Asn
210 215 220
Val Met Arg Arg Phe Asp Val Ser Glu Ser Ser Ser Arg Ala Thr Ala
225 230 235 240
Asp Glu Ile Phe Leu Ala Pro Glu Val Lys Glu Phe Arg Gln Phe Ser
245 250 255
Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Phe Leu Leu Glu Leu Val
260 265 270
Ser Gly Gln Lys Ala Thr Asp Ala Pro Val Ser Asn Pro Asn Tyr Thr
275 280 285
Leu Val Asp Trp Ile Gln Asn Asn Gln Arg Lys Ser Asp Ile Gly Ser
290 295 300
Ile Thr Asp Pro Arg Leu Gly Lys Ser Phe Thr Glu Glu Gly Met Gly
305 310 315 320
Glu Leu Met Asp Leu Ile Leu Gln Cys Val Glu Tyr Ser Ser Glu Arg
325 330 335
Arg Pro Val Met Ser Tyr Val Val Thr Glu Leu Glu Arg Ile Leu Glu
340 345 350
Lys Glu Met Asn Leu Thr Thr Val Met Gly Glu Gly Ser Pro Thr Val
355 360 365
Thr Leu Gly Ser Gln Leu Phe Lys Thr Thr Lys
370 375