阅读说明：本技术 一种羊肺炎支原体、a型羊多杀性巴氏杆菌和d型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗 (Mycoplasma ovipneumoniae, type-A pasteurella multocida and type-D pasteurella multocida triple inactivated vaccine ) 是由 张月梅 赵世华 戴伶俐 王娜 宋越 张帆 周蕾 达来宝力格 刘威 杨斌 柴春霞 于 2020-05-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗,属于疫苗技术领域；所述三联灭活疫苗包括绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液和免疫佐剂。本发明提供的羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗与市售的绵羊肺炎支原体灭活疫苗相比,相应病原的免疫保护力基本相当,但可以达到一针多防、降低成本、减少羊只应激的目的。(The invention provides a mycoplasma hyopneumoniae, A type pasteurella multocida and D type pasteurella multocida triple inactivated vaccine, belonging to the technical field of vaccines; the triple inactivated vaccine comprises an inactivated bacterial liquid of mycoplasma ovipneumoniae MO _ NM01, an inactivated bacterial liquid of A type pasteurella multocida PM-NM1, an inactivated bacterial liquid of D type pasteurella multocida P < -NM2 and an immunologic adjuvant. Compared with the commercial mycoplasma ovipneumoniae inactivated vaccine, the triple inactivated vaccine for mycoplasma ovipneumoniae, the type-A pasteurella multocida and the type-D pasteurella multocida provided by the invention has basically equivalent immune protection of corresponding pathogens, but can achieve the purposes of preventing more diseases with one needle, reducing cost and reducing stress of sheep.)

一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴 氏杆菌三联灭活疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗。

背景技术

羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌是当今危害养羊业最重要的条件致病病原体，常作为羊传染性胸膜肺炎和出血性败血症并发或继发感染病原，严重危害我国乃至世界养羊业的健康可持续发展。

现有技术中预防羊传染性胸膜肺炎的措施主要为接种免疫羊肺炎支原体灭活单苗，但是由于羊肺炎支原体往往与A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌混合感染，而A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌会引起羊多杀性巴氏杆菌病，进而加剧羊传染性胸膜肺炎的发病过程，导致目前市售的绵羊肺炎支原体灭活单疫苗免疫效果不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗，本发明的疫苗对羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌均具有免疫作用，从而起到更加可靠的预防羊传染性胸膜肺炎的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗，包括绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液和免疫佐剂；

所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；

所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的保藏编号为CGMCC No.19798；

所述D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的保藏编号为CGMCC No.19799；

所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)；

所述三联灭活疫苗中绵羊肺炎支原体MO_NM01的菌体浓度为(1～9)×10⁹CCU/mL；

所述三联灭活疫苗中A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的菌体浓度为(1～9)×10⁹CFU/mL；

所述三联灭活疫苗中D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的菌体浓度为(1～9)×10⁹CFU/mL。

优选的，所述免疫佐剂包括弗式佐剂或ISA-201-VG免疫油佐剂。

优选的，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液的总体积和所述免疫佐剂的体积的比例为1：(1～2)。

本发明提供了上述方案所述三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2，分别制备得到绵羊肺炎支原体培养液、A型羊多杀性巴氏杆菌菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌菌液；

2)分别将所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液灭活后混合获得灭活的微生物制剂；

3)将灭活的微生物制剂和免疫佐剂混合，获得三联灭活疫苗。

优选的，步骤2)中所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液的灭活方法为：将所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液和体积百分含量为0.2％～0.5％的甲醛水溶液混合，37℃的条件下灭活48h，灭活期间震荡1～2次。

优选的，步骤2)中所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液的灭活方法为：将所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液分别和体积百分含量为0.5％～1％的甲醛水溶液混合，37℃的条件下灭活48h，灭活期间震荡1～2次。

本发明的有益效果：本发明提供了一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗，包括绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液和免疫佐剂。本发明提供的羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗与市售的绵羊肺炎支原体灭活疫苗相比，相应病原的免疫保护力基本相当，但可以达到一针多防、降低成本、减少羊只应激的目的。

生物保藏信息

绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年5月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的保藏编号为CGMCC No.19798；所述D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的保藏编号为CGMCC No.19799。

具体实施方式

本发明提供了一种羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗，包括绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液和免疫佐剂；

所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；

所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的保藏编号为CGMCC No.19798；

所述D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的保藏编号为CGMCC No.19799；

所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液的体积比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，优选为1：1：1；

所述三联灭活疫苗中绵羊肺炎支原体MO_NM01的菌体浓度为(1～9)×10⁹CCU/mL；

所述三联灭活疫苗中A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的菌体浓度为(1～9)×10⁹CFU/mL；

所述三联灭活疫苗中D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的菌体浓度为(1～9)×10⁹CFU/mL。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01和A型及D型多杀性巴氏杆菌是2016～2018间年从内蒙古西部、中部、东北部等地羊场、牧场采集绵羊支原体肺炎病料中分离，经过形态观察、培养特性、生化特性、血清学试验、毒力和免疫原性试验，最终获得的免疫原性和毒力均较好的菌株。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01形态特征为：在40倍放大镜下菌落凸起，呈桑椹状，无脐；支原体固体平板肉眼可见针尖大小圆形小菌落，整体平板菌落细沙状。

在本发明中，所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2A于固体平板培养基上呈圆形透明，有浅蓝色金属光泽小菌落。

在本发明中，所述免疫佐剂包括弗式佐剂或ISA-201-VG免疫油佐剂(购自于法国SEPPIC品牌)。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的灭活菌液的总体积和所述免疫佐剂的体积的比例优选为1：(1～2)。

本发明提供了上述方案所述三联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别培养绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2，分别制备得到绵羊肺炎支原体培养液、A型羊多杀性巴氏杆菌菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌菌液；

2)分别将所述绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液灭活后混合获得灭活的微生物制剂；

3)将灭活的微生物制剂和免疫佐剂混合，获得三联灭活疫苗。

本发明首先分别培养绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2，分别制备得到绵羊肺炎支原体培养液、A型羊多杀性巴氏杆菌菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌菌液。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液的制备方法独立优选的包括一级种子繁殖、二级种子繁殖和发酵培养。

在本发明中，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液的制备方法优选包括以下步骤：

S1.将绵羊肺炎支原体MO_NM01接种于支原体固体培养基，于37℃条件下培养72～96h，挑取单菌落接种于改良KM2液体培养基中，于37℃条件下培养45～50h，得到绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子；

S2.将步骤S1制备得到的绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子按1％的体积比接入改良KM2液体培养基中，于37℃条件下培养45～50h，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子；

S3.将步骤S2得到绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子按1％体积比接种到改良KM2液体培养基中，于37℃条件下培养45～50h，得到绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液。

本发明首先将绵羊肺炎支原体MO_NM01接种于支原体固体培养基，于37℃条件下培养72～96h，优选为80h，挑取单菌落接种于改良KM2液体培养基中，于37℃条件下培养45～50h，优选为48h，得到绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子；所述接种的方式优选为划线接种。

在本发明中，所述支原体固体培养基以1L计，优选包括以下组分：Pplo肉汤21g、葡萄糖5g、酵母粉5g、质量百分含量为1％的醋酸铊10mL和余量的水；本发明对所述支原体固体培养基的制备方法没有特殊限制，将原料混合均匀后，于116℃灭菌20min，得到支原体固体培养基。

在本发明中，所述改良KM2液体培养基优选包括以下浓度的组分：1640细胞培养液500ml/L、质量百分含量为1.7％的水解乳蛋白Hanks液300ml/L、质量百分含量为25％的酵母液20ml/L、马血清200ml/L、20万国际单位的青霉素2mL、质量百分含量为1％的醋酸铊14mL/L、质量百分含量为0.4％的酚红5mL/L、葡萄糖4g/L和丙酮酸钠2g/L；pH值优选为7.6～7.8。本发明对所述改良KM2液体培养基的制备方法没有特殊限制，将原料混合均匀后，调整pH为7.6～7.8，经0.22μm滤器过滤，得到改良KM2液体培养基；用于调整pH的试剂优选为1mol/LNaOH水溶液。

得到绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子后，本发明将制备得到的绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子按1％的体积比接入改良KM2液体培养基中，于37℃条件下培养45～50h，优选为48h，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子。

得到绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子后，本发明将得到绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子按1％体积比接种到改良KM2液体培养基中，于37℃条件下培养45～50h，优选为48h，得到绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液。

在本发明中，所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液的制备方法优选的采用以下方法制备得到：

P1.将A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2分别划线接种于含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，于37℃条件下培养16～20h，挑取单菌落接种于含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37℃条件下培养16～20h，分别得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子；

P2.将所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子按1％的体积比分别接入含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37℃条件下培养16～20h，优选为18h，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子；

P3.将所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子按1％的体积比分别接入含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37℃条件下培养16～20h，优选为18h，分别得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液。

本发明首先将A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2分别划线接种于含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，于37℃条件下培养16～20h，优选为18h，挑取单菌落接种于含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37℃条件下培养16～20h，优选为18h，分别得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子。

在本发明中，所述胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)优选的包括以下组分：胰酪蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、氯化钠5g、琼脂15g和纯化水1000ml，25℃的pH值优选为7.1～7.5，更优选为7.3；所述胰蛋白胨大豆琼脂培养基优选的采用以下方法制备得到：取胰酪蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠和纯化水混合，混合，调节pH值在25℃的pH为7.1～7.5，加入琼脂，加热融化后，灭菌，得到胰蛋白胨大豆琼脂培养基；所述胰蛋白胨大豆琼脂培养基和体积百分含量为5％马血清混合，得到含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆琼脂培养基；所述混合的温度优选为60℃。

在本发明中，所述胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)优选的包括以下组分：胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、D-葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g、磷酸氢二钾2.5g和纯化水；所述胰酪蛋白胨、大豆蛋白胨、D-葡萄糖、氯化钠和磷酸氢二钾的总质量和纯化水的体积的比例为30g：1000ml；所述胰蛋白胨大豆肉汤的pH值优选为7.1～7.5，优选为7.3；本发明对所述胰蛋白胨大豆肉汤的制备方法没有特殊限制，将原料混合后，调节pH值至7.1～7.5，121℃灭菌15min，冷却至60℃和体积百分含量为5％马血清混合，得到含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤。

得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子后，本发明将所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子按1％的体积比分别接入含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37℃条件下培养16～20h，优选为18h，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子。

得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子后，本发明将A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子按1％的体积比分别接入含有体积百分含量为5％马血清的胰蛋白胨大豆肉汤中，于37℃条件下培养16～20h，优选为18h，分别得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液。

得到绵羊肺炎支原体培养液、A型羊多杀性巴氏杆菌菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌菌液后，本发明分别将所述绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液灭活后混合获得灭活的微生物制剂。在本发明中，所述绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液的灭活方法优选为：将所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的灭活菌液和体积百分含量为0.2％～0.5％的甲醛水溶液混合，37℃的条件下灭活48h，灭活期间震荡1～2次。

在本发明中，所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液的灭活方法为：将所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的灭活菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液分别和体积百分含量为0.5％～1％的甲醛水溶液混合，37℃的条件下灭活48h，灭活期间震荡1～2次。

所述灭活后，本发明优选的还包括取样，按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，无细菌生长为合格。如果不合格则继续灭活。

本发明对所述绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液灭活后，优选的还包括对每种灭活液分别进行浓缩，至灭活后的绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液中绵羊肺炎支原体MO_NM01的浓度为(1～9)×10⁹CCU/mL、灭活后的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液中A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的浓度为(1～9)×10⁹CFU/mL、灭活后的D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2中D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的浓度为(1～9)×10⁹CFU/mL。

在本发明中，所述浓缩的方式优选为离心后重悬。

得到灭活的微生物制剂后，本发明将灭活的微生物制剂和免疫佐剂混合，混合体积比例为1：1，获得三联灭活疫苗；本发明对所述混合的方式没有特殊限制，以混合均匀为准。

本发明具体实施过程中，将等体积、浓度为2×10⁹CFU/mL的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液混合后，进行离心，获得沉淀，用相同体积且浓度为2×10⁹CCU/mL的绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液重悬上述两种巴氏杆菌的沉淀，得到的重悬液中两种巴氏杆菌菌液的浓度还分别是2×10⁹CFU/ml；然后加入和重悬液体积相同的免疫佐剂，获得三联灭活疫苗；所述三联灭活疫苗中绵羊肺炎支原体MO_NM01的菌体浓度为1×10⁹CCU/mL，A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的菌体浓度为1×10⁹CFU/mL，D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的菌体浓度为1×10⁹CFU/mL。

本发明对上述方案中混合的步骤没有特殊限定，以混合均匀为准。

本发明所述三联灭活疫苗的使用方法优选的包括以下步骤：将所述三联灭活疫苗肌肉注射断奶羔羊，每头注射2～3mL，2～3周后，以相同方法及相同剂量进行二免；所述断奶羔羊的周龄龄优选为4～6周龄；所述断奶羔羊的品种优选的包括绵羊和山羊。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中采用的培养基的配方如下所示：

1、改良KM2液体培养基

配方：(g/L)

以上成分用1mol/LNaOH水溶液调整pH到7.6～7.8，经0.22μm滤器过滤后，置4℃冰箱备用。

2、支原体固体培养基

配方：(g/L)

上述成分混合后加热溶解，定量分装，以116℃灭菌20分钟后置于4℃冰箱备用。将100mL固体培养基加热溶解，当温度降到55～60℃时，倾注约20ml至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。

3、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)+5％马血清

配方：(g/L)

取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节pH值使灭菌后在25℃的pH为7.3±0.2，加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60℃，加入终浓度5％的马血清，在无菌操作要求下倾注约20ml至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。

平皿培养及保存：制备好的培养基平皿宜在2℃～8℃保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。

4、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)+5％马血清

配方：(g/L)

用1000ml去离子水溶解30g培养基粉末。调节pH至7.3。TSB培养基灭菌条件是，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却后加入终浓度终浓度5％的马血清。

本发明实施例采用的菌株如下：

绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1、D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述绵羊肺炎支原体MO_NM01的保藏编号为CGMCC No.19698；所述A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的保藏编号为CGMCCNo.19798；所述D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的保藏编号为CGMCC No.19799。

实施例1绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌“ISA-201-VG”复方油佐剂三联灭活疫苗配制

一、绵羊肺炎支原体MO_NM01生产菌种制备

1生产菌种制备

1.1一级种子繁殖

将绵羊肺炎支原体MO_NM01冻干菌种，划线接种于支原体固体培养基平板上，37℃培养72h，挑取单菌落于改良KM2液体培养基中，37℃培养48h，得到绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子。

1.2二级种子繁殖

将制备得到的绵羊肺炎支原体MO_NM01一级种子按1％的体积比接入改良KM2液体培养基中，37℃培养48h，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后作为绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子；

2抗原制备

2.1菌液制备

将鉴定合格的绵羊肺炎支原体MO_NM01二级种子按1％体积比接种到改良KM2液体培养基中，37℃培养48h，得到绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液。

将2.1制得的绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液分别进行纯粹性检验及活菌计数结果，按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果纯粹则为合格。

2.2抗原灭活

将检验合格的绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液，按菌液总量的1％加入体积百分含量为0.2％的甲醛水溶液，混匀后置于37℃放置48h，期间振摇1次，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，无细菌生长。

2.3抗原浓缩

将检验合格的绵羊肺炎支原体MO_NM01灭活抗原经离心浓缩后重悬，根据灭活前活菌计数结果用PBS将灭活抗原浓度调整为2×10⁹CCU/mL。取样做无菌检验，无细菌生长。

二、A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2生产菌种制备

1生产菌种制备

1.1一级种子繁殖

将A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2冻干菌种，分别划线接种于TSA+5％马血清平板上，37℃培养16～20h，挑取单菌落于TSB+5％马血清液体培养基中，37℃培养16～20h，分别得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子。

1.2二级种子繁殖

将制备得到的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1一级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2一级种子按1％的体积比接入TSB+5％马血清培养基中，37℃培养16～20h，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，合格后分别作为A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子；

2抗原制备

2.1菌液制备

将鉴定合格的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1二级种子和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2二级种子按1％体积比接种到TSB+5％马血清培养基中，37℃培养16～20h，将鉴定合格的二级种子按1％体积比接种到TSB+5％马血清培养基中，37℃培养16～20h，分别分别得到A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液。

将2.1制得的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液分别进行纯粹性检验及活菌计数结果，按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果纯粹则为合格。

2.2抗原灭活

将检验合格的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液，按菌液总量的1％加入体积百分含量为0.5％的甲醛水溶液混合，混匀后置于37℃放置48h，期间振摇1次，灭活后取样，按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，无细菌生长。

2.3抗原浓缩

将检验合格的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2灭活抗原分别经离心浓缩后，根据灭活前活菌计数结果用PBS将灭活抗原浓度调整为2×10⁹CFU/mL。取样做无菌检验，无细菌生长。

三、配苗

1、将等体积、浓度为2×10⁹CFU/mL的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液混合后，进行离心，获得沉淀，用相同体积且浓度为2×10⁹CCU/mL的绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液重悬上述两种巴氏杆菌的沉淀，得到的重悬液中两种巴氏杆菌菌液的浓度还分别是2×10⁹CFU/ml；然后加入和重悬液体积相同的ISA-201-VG免疫油 佐剂，获得三联灭活疫苗；所述三联灭活疫苗中绵羊肺炎支原体MO_NM01的菌体浓度为1×10⁹CCU/mL，A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的菌体浓度为1×10⁹CFU/mL，D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的菌体浓度为1×10⁹CFU/mL。

2、无菌检验

取上述配制疫苗按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无细菌生长。

3、分装

定量分装，加塞，密封，2～8℃保存。

实施例2绵羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌弗式佐剂三联灭活疫苗配制

1、将实施例1中获得的等体积、浓度为2×10⁹CFU/mL的A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1菌液和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2菌液混合后，进行离心，获得沉淀，用相同体积且浓度为2×10⁹CCU/mL的绵羊肺炎支原体MO_NM01菌液重悬上述两种巴氏杆菌的沉淀，得到的重悬液中两种巴氏杆菌菌液的浓度还分别是2×10⁹CFU/ml；然后加入和重悬液体积相同的弗氏佐剂，获得三联灭活疫苗；所述三联灭活疫苗中绵羊肺炎支原体MO_NM01的菌体浓度为1×10⁹CCU/mL，A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1的菌体浓度为1×10⁹CFU/mL，D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2的菌体浓度为1×10⁹CFU/mL。

2、无菌检验

取上述配制疫苗按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，无细菌生长。

3、分装

定量分装，加塞，密封，2～8℃保存。

实施例3：实施例1～2制备的三联灭活疫苗的安全性研究

取实施例1制备的“绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌‘ISA-201-VG’复方油佐剂三联灭活疫苗”和实施例2制备的“绵羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌弗式佐剂三联灭活疫苗”分别肌肉注射4～6周龄健康易感断奶羔羊，每头2mL，每种疫苗注射5头，对照组(空白对照)5头，2周后，以相同方法及相同剂量进行二免，观察2周，无局部或全身不良反应且全部健康。结果见表1。

表1安全性研究结果

安全性试验结果显示：对照组所有羊只均未出现任何不良反应；绵羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌优选新型“ISA-201-VG”复方油佐剂三联灭活疫苗配制安全，绵羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌弗式佐剂三联灭活疫苗配制对羔羊安全。

实施例3：实施例1～2制备的三联灭活疫苗的疫苗效力研究

1试验设计

1.1疫苗免疫

取实施例1制备的“绵羊肺炎支原体MO_NM01、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌‘ISA-201-VG’复方油佐剂三联灭活疫苗”和实施例2制备的“绵羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌弗式佐剂三联灭活疫苗”，各种疫苗肌肉注射4～6周龄健康易感断奶羔羊，每头2mL，每组15头，首免3周后二免，免疫剂量同一免。同时每组疫苗设15头作为对照，不进行免疫。

购买市售的绵羊肺炎支原体MOGH3-3株，购自山东泰丰生物制品有限公司，批号20170701；上述购买的疫苗分别按其免疫方法及免疫剂量注射**周龄健康易感断奶羔羊。

表2疫苗免疫分组

1.2攻毒

免疫后5周，绵羊肺炎支原体采用气管注射攻毒，攻毒用强毒株：(绵羊肺炎支原体MO_NM01)气管注射5mL/头(100MID)；A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌采用气管注射攻毒，攻毒用强毒株：(A型羊多杀性巴氏杆菌PM-NM1和D型羊多杀性巴氏杆菌P<-NM2)气管注射5mL/头(100MID)；攻毒分组如下表3。

表3攻毒分组

1.2效力检验结果

绵羊肺炎支原体攻毒后观察4个月，记录免疫组与对照组临床症状及死亡头数；A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌和攻毒后观察3个月，记录免疫组与对照组临床症状及死亡头数，临床症状表现为羊出现咳嗽。结果见下表。

表4效力检验结果

结果显示：支原体攻毒组，其中解剖后免疫组保护率60％～80％(4/5、3/5、3/5)，对照组无保护，羊肺部均有病变，发病率均为100％(5/5、5/5、5/5)，巴氏杆菌攻毒组，其中解剖后发现免疫组保护率60％～80％(4/5、3/5；4/5、3/5)对照组基本无保护，未保护羊死亡，死亡率80％～100％(4/5、5/5；4/5、5/5)；羊肺炎支原体、A型羊多杀性巴氏杆菌和D型羊多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗与市售的绵羊肺炎支原体相比，相应病原的免疫保护力基本相当，但可以达到一针多防、降低成本、减少羊只应激的目的。同时，两种不同佐剂相比，ISA-201-VG”复方油佐剂三联疫苗的保护率高于弗式佐剂三联灭活疫苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。