阅读说明：本技术 一种寨卡病毒e蛋白结合疫苗及其制备方法 (Zika virus E protein conjugate vaccine and preparation method thereof ) 是由 胡涛 齐金铭 于卫立 申莉娟 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种寨卡病毒E蛋白结合疫苗及其制备方法,具体步骤：1)将β-葡聚糖的邻位羟基氧化为醛基,得到氧化β-葡聚糖；2)加入连接桥化合物,与氧化β-葡聚糖中的醛基反应,得到含连接桥的β-葡聚糖；3)寨卡病毒E蛋白与含连接桥的β-葡聚糖进行反应,纯化得到寨卡病毒E蛋白结合疫苗。该疫苗能诱导产生高水平的细胞免疫应答和体液免疫应答。(The invention discloses a Zika virus E protein conjugate vaccine and a preparation method thereof, and the preparation method comprises the following specific steps: 1) oxidizing the ortho-position hydroxyl of the beta-glucan into aldehyde group to obtain oxidized beta-glucan; 2) adding a connecting bridge compound to react with aldehyde groups in the oxidized beta-glucan to obtain beta-glucan containing connecting bridges; 3) and reacting the Zika virus E protein with beta-glucan containing a connecting bridge, and purifying to obtain the Zika virus E protein conjugate vaccine. The vaccine can induce high-level cellular immune response and humoral immune response.)

一种寨卡病毒E蛋白结合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种基于β-葡聚糖修饰的寨卡病毒重组蛋白结合疫苗。

背景技术

寨卡病毒是一种具有二十面体结构和囊膜的RNA病毒，属于黄病毒属病毒。寨卡病毒经伊蚊传播，能够感染神经细胞，并突破血胎、血眼、血睾和血脑屏障，导致新生儿小头症和成年人格林巴利综合症。近几年来，在中南美洲乃至世界范围内爆发的寨卡疫情出现了不同寻常的严重临床表现。由于我国与寨卡病毒流行地区有着密切的人员往来，寨卡病毒输入性病例的持续发生对我国的公共卫生安全构成了严重的威胁。在全球范围内，目前尚无有效的手段对寨卡病毒病进行防治。即使通过扑灭蚊虫来预防寨卡病毒的感染，在实施过程中也存在着极大的难度，尤其在蚊虫密度高的夏季，根本无法完全防范蚊虫的叮咬。疫苗接种对于传染病的预防和控制起着重要的作用。因此，接种疫苗是预防寨卡病毒病最为经济有效的方法，可以有效遏制寨卡病毒病的传播与流行。

目前在研的寨卡病毒疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、核酸疫苗、腺病毒载体疫苗、嵌合病毒疫苗、重组蛋白疫苗和合成肽疫苗等。减毒活疫苗和灭活疫苗已取得了一些阶段性研究进展。然而，这两类疫苗存在着安全性低、特异性差和成分不明确等问题。例如，寨卡病毒减毒活疫苗存在毒力回复的可能性。DNA疫苗和腺病毒载体疫苗能为灵长类动物提供较好的免疫保护，而且毒副作用小。然而，DNA疫苗进入机体后易被降解，同时还存在被整合到宿主基因组的风险；质粒上的抗生素基因可能会导致宿主细胞出现耐药性，给细菌病的防治带来困难。腺病毒载体本身具有较强的免疫原性，而且靶向性差，限制了腺病毒载体疫苗的临床应用。

基因工程技术的迅速发展促进了重组蛋白疫苗的研发。重组蛋白疫苗因其具有安全性高、成分明确、特异性强和易于制备等优点，已成为疫苗研发的热点之一。E蛋白和prM蛋白是两种主要的寨卡病毒囊膜蛋白，也是寨卡病毒疫苗研发的重要靶点抗原。其中，E蛋白构成病毒颗粒表面的突起，在病毒的吸附、内吞、膜融合和出胞过程中发挥着关键作用。尽管E蛋白是一种理想的寨卡病毒抗原，但其免疫原性弱，激发的抗体和细胞免疫应答不强，不能提供有效且持续的免疫保护。

疫苗佐剂能够非特异性地增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型。铝佐剂是一种目前使用最广泛的疫苗佐剂，能显著增强机体的体液免疫应答。然而，铝佐剂不能刺激机体产生较强的细胞免疫应答，而且易导致接种部位产生病理反应。此外，MF59、AS03、Virosome和AS04等疫苗佐剂也被批准使用，但这些疫苗佐剂都存在一定的毒副作用。多糖佐剂因其来源天然、可生物降解、生物安全性好等优点，在近年来的疫苗佐剂研究中越来越受到重视和青睐。其中，β-葡聚糖是真菌细胞壁的一种主要组成部分，具有免疫调节和免疫增强作用。β-葡聚糖是葡萄糖以β-(1→3)糖苷键形成的多糖，能识别巨噬细胞表面的多糖受体(如CR3和Dectin-1)，激活免疫细胞(如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和中性粒白细胞)，促进细胞因子(如γ-干扰素、IL-2、IL-5和IL-10)的分泌，并提高机体的免疫应答水平。

抗原递送系统可将疫苗佐剂与抗原递送到机体的免疫细胞(如抗原提呈细胞)，从而提高抗原的免疫原性。例如，纳米颗粒通过装载抗原和佐剂形成纳米颗粒疫苗，在小鼠体内表现出很强的免疫应答反应。然而，纳米颗粒材料(如碳纳米管和金纳米颗粒)的水溶性差、不易降解、具有长期毒性，而且不易规模化生产，这些缺点限制了纳米颗粒疫苗的临床应用。共价结合使疫苗佐剂与抗原结合形成抗原递送系统，能将两者同时递送到免疫细胞，并由免疫细胞识别、摄取和提呈，从而刺激机体产生强烈的免疫应答反应。基于佐剂共价结合的重组蛋白疫苗(即重组蛋白结合疫苗)具有水溶性好、易降解、毒性低和易于规模化生产的特点。通过选择合适的抗原、疫苗佐剂和共价结合方法，可望开发出高效的寨卡病毒重组蛋白结合疫苗。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于β-葡聚糖修饰的寨卡病毒E蛋白结合疫苗，该疫苗到达细胞内以后逐步将β-葡聚糖与E蛋白分开，避免β-葡聚糖屏蔽E蛋白的抗原表位，同时也避免E蛋白屏蔽β-葡聚糖的佐剂活性位点，从而刺激机体产生较高水平的细胞免疫应答和体液免疫应答。

为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种寨卡病毒E蛋白结合疫苗，β-葡聚糖与寨卡病毒E蛋白通过连接桥共价结合。

优选地，所述连接桥为含二硫键和腙键的连接桥或含马来酰亚胺基团的连接桥。

进一步优选地，所述含二硫键和腙键的连接桥的化学结构为：所述含马来酰亚胺基团的连接桥的化学结构为：

本发明还提供了上述一种寨卡病毒E蛋白结合疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将β-葡聚糖的邻位羟基氧化为醛基，得到氧化β-葡聚糖；

2)加入连接桥化合物，与氧化β-葡聚糖中的醛基反应，得到含连接桥的β-葡聚糖；

3)寨卡病毒E蛋白与含连接桥的β-葡聚糖进行反应，纯化得到寨卡病毒E蛋白结合疫苗。

优选地，步骤2)中，所述连接桥化合物为氨基乙基-马来酰亚胺酯或二硫吡啶丙酰肼。

优选地，步骤2)中，氧化β-葡聚糖的浓度为1-5mg/ml，连接桥化合物的浓度为0.1-0.5mg/ml，连接桥化合物与氧化β-葡聚糖的质量比为1-10，反应pH值为6.0-8.0，反应在2-40℃下进行1-24小时。

优选地，步骤3)中，寨卡病毒E蛋白的浓度为0.1-2.0mg/mL，含连接桥的β-葡聚糖的浓度为0.5-5.0mg/mL，含连接桥的β-葡聚糖与寨卡病毒E蛋白的质量比为0.5-20.0，反应pH值为6.0-8.0，反应在2-8℃下进行1-24小时。

优选地，所述寨卡病毒E蛋白采用以下方法制备：

i)将寨卡病毒E蛋白基因进行PCR扩增，并经双酶切后插入到表达载体的多克隆位点，构建重组载体；

ii)将重组载体在大肠杆菌中表达E蛋白，对大肠杆菌中的包涵体进行复性与分离纯化，得到寨卡病毒E蛋白。

进一步优选地，步骤i)包括以下步骤：

根据GenBank中寨卡病毒BeH818995株的囊膜蛋白的基因序列，Genebank序号为KU365777，在E蛋白基因序列源的C末端融合6个组氨酸残基，进行全基因合成；将合成基因序列克隆至pET21a表达载体中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞top10中，构建重组载体pET21a-E。

进一步优选地，步骤ii)包括以下步骤：

将重组载体pET21a-E转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定；活化菌体，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，振荡培养后离心收集菌体；菌体重悬于缓冲液中，于冰浴下超声破碎菌体，离心收集包涵体；用包涵体洗涤液洗涤三次后用包涵体溶解液于37℃水浴中溶解，然后在4℃下进行稀释复性；将低浓度的蛋白复性液用Ni Sepharose Fast Flow亲和层析柱进行纯化，收集对应于寨卡病毒E蛋白的洗脱峰。

本发明所提供的一种基于β-葡聚糖修饰的寨卡病毒E蛋白结合疫苗，通过化学修饰的方法，以腙键及二硫键为连接桥，将β-葡聚糖与寨卡病毒E蛋白共价结合，组成一种寨卡病毒E蛋白结合疫苗。

本发明涉及一种寨卡病毒E蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取E蛋白基因序列，构建pET-21a(+)质粒载体，并转化到大肠杆菌感受态细胞中。通过涂布平板法筛选出含E蛋白基因的菌株。将筛选出的菌株扩大培养，诱导表达后，低速离心，收集菌体。

(2)重悬菌体，搅拌均匀后使用超声波细胞破碎仪破碎菌体。超声结束后，通过离心分离的方式将包涵体与上清分开。取包涵体，洗涤后，加入包涵体溶解液，经水浴处理后得到包涵体变性液。将包涵体变性液逐滴滴入10倍体积的包涵体复性液中。最后在4℃条件下搅拌复性过夜。

(3)E蛋白复性液通过Ni Sepharose Fast Flow亲和层析法进行分离纯化，除去杂质蛋白，得到高纯度的E蛋白。

本发明涉及一种寨卡病毒E蛋白结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)E蛋白带有半胱氨酸残基，位于蛋白分子的表面；半胱氨酸的巯基可用于共价结合β-葡聚糖。用高碘酸钠氧化β-葡聚糖；按照一定的比例加入氨基乙基-马来酰亚胺酯；氨基乙基-马来酰亚胺酯的氨基在氰基硼氢化钠的还原作用下与β-葡聚糖的醛基反应；按照一定的比例加入E蛋白，E蛋白的巯基与β-葡聚糖的马来酰亚胺酯反应，生成不带二硫键和腙键的结合疫苗(E-PS-1)。

(2)用高碘酸钠氧化β-葡聚糖；按照一定的比例加入二硫吡啶丙酰肼；二硫吡啶丙酰肼的酰肼基团与β-葡聚糖的醛基反应生成腙键；按照一定的比例加入E蛋白，E蛋白的巯基与β-葡聚糖的二硫键反应，生成带二硫键和腙键的结合疫苗(E-PS-2)。

(3)由Superdex 200凝胶过滤柱纯化含有E-PS-1的反应混合物或含有E-PS-2的反应混合物。上样后经洗脱后出现了两个洗脱峰。小洗脱峰对应于结合程度较高的结合物。大洗脱峰对应于E-PS-1或E-PS-2。收集E-PS-1或E-PS-2对应的洗脱峰，即得到寨卡病毒E蛋白结合疫苗。

更具体地，一种寨卡病毒E蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)根据GenBank中寨卡病毒BeH818995株的囊膜蛋白(Genebank序号：KU365777)的基因序列，在E蛋白基因序列源(1-409氨基酸残基)的C末端融合6个组氨酸残基，进行全基因合成；

(2)将合成基因序列克隆至pET21a表达载体中，然后转化至大肠杆菌感受态细胞top10中，构建重组载体pET21a-E；

(3)将重组载体pET21a-E转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，菌落PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定；

(4)活化菌体，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，振荡培养后离心收集菌体；

(5)菌体重悬于缓冲液中，于冰浴下超声破碎菌体，离心收集包涵体；

(6)菌体超声破碎后离心收集包涵体，用包涵体洗涤液洗涤三次后用包涵体溶解液于37℃水浴中溶解，然后在4℃下进行稀释复性；

(7)将低浓度的蛋白复性液用Ni Sepharose Fast Flow亲和层析柱进行纯化，收集对应于E蛋白的洗脱峰。

一种将β-葡聚糖与寨卡病毒E蛋白共价结合的方法，其步骤包括：

(1)用高碘酸钠氧化β-葡聚糖，将β-葡聚糖的邻位羟基氧化为醛基；

(2)加入氨基乙基-马来酰亚胺酯，与β-葡聚糖的醛基反应，将马来酰亚胺基团引入β-葡聚糖，氧化β-葡聚糖的浓度为1-5mg/ml，氨基乙基-马来酰亚胺酯的浓度为0.1-0.5mg/ml，氨基乙基-马来酰亚胺酯与氧化β-葡聚糖的质量比为1-10，反应pH值为6.0-8.0，反应在2-40℃下进行1-24小时；

(3)加入E蛋白，E蛋白的巯基与β-葡聚糖的马来酰亚胺酯反应，生成不带二硫键和腙键的结合疫苗(E-PS-1)，E蛋白的浓度为0.1-2.0mg/mL，β-葡聚糖的浓度为0.5-5.0mg/mL，β-葡聚糖与E蛋白的质量比为0.5-20.0，反应pH值为6.0-8.0，反应在2-8℃下进行1-24小时；

(4)由Superdex 200凝胶过滤柱纯化该结合疫苗。

另一种将β-葡聚糖与寨卡病毒E蛋白共价结合的方法，其步骤包括：

(1)用高碘酸钠氧化β-葡聚糖，将β-葡聚糖的邻位羟基氧化为醛基；

(2)加入二硫吡啶丙酰肼，与β-葡聚糖的醛基反应，将二硫键和腙键引入β-葡聚糖，氧化β-葡聚糖的浓度为1-5mg/ml，二硫吡啶丙酰肼的浓度为0.1-0.5mg/ml，二硫吡啶丙酰肼与氧化β-葡聚糖的质量比为1-10，反应pH值为6.0-8.0，反应在2-40℃下进行1-24小时；

(3)加入E蛋白，其巯基与β-葡聚糖的二硫键反应，生成带二硫键和腙键的结合疫苗(E-PS-2)，E蛋白的浓度为0.1-2.0mg/mL，β-葡聚糖的浓度为0.5-5.0mg/mL，β-葡聚糖与E蛋白的质量比为0.5-20.0，反应pH值为6.0-8.0，反应在2-8℃下进行1-24小时；

(4)由Superdex 200凝胶过滤柱纯化该结合疫苗。

本发明以E蛋白为抗原，以β-葡聚糖为疫苗佐剂，通过两者的共价结合构建一种基于β-葡聚糖修饰的寨卡病毒E蛋白结合疫苗。该疫苗能诱导产生高水平的细胞免疫应答和体液免疫应答。其中，共价结合β-葡聚糖预计可延长E蛋白在体内的停留时间，增加疫苗与免疫细胞的作用时间；共价结合可将两者同步递送到免疫细胞，并被免疫细胞识别和摄取。然而，这种结合方式还会存在以下问题：(1)β-葡聚糖会屏蔽E蛋白的抗原表位；(2)E蛋白也会屏蔽β-葡聚糖的佐剂活性位点；(3)E蛋白的抗原表位能帮助β-葡聚糖特异性的B细胞激活T辅助细胞，产生β-葡聚糖特异性抗体。因此，本发明进一步的以二硫键和腙键为连接桥，将β-葡聚糖与E蛋白共价结合起来，构建一种寨卡病毒重组蛋白结合疫苗。该结合疫苗的二硫键和腙键在免疫细胞内可以通过水解的方式解决上述3个问题。

相对于现有技术，本发明的优点在于：

本发明疫苗的设计理念具有创新性。β-葡聚糖作为寨卡病毒E蛋白结合疫苗的佐剂，具有原创性；疫苗以二硫键和腙键为连接桥，这种结合方式使得疫苗在作用机制上有别于传统的重组蛋白结合疫苗，具有新颖性和有效性。

本发明的疫苗技术具有很强的通用性，可用于开发其它病毒的重组蛋白结合疫苗。近年来，病毒、细菌等病原体所引发的传染性疾病在我国呈现加剧之势。传统疫苗不足以应对传染性疾病的挑战。因此，国家急需储备通用性强的疫苗技术来应对可能出现的公共卫生突发事件。本发明的疫苗技术适用于其它病毒疫苗的研究，能为预防病毒性疾病提供一种可行的解决方案。例如，新冠病毒的S蛋白和β-葡聚糖通过二硫键与腙键共价结合，可用于预防新冠病毒的感染。

本发明所制备的结合疫苗E-PS-1，但该疫苗还存在一定的缺点，比如重组蛋白结合疫苗的抗原与佐剂在细胞内不会解离，β-葡聚糖会屏蔽E蛋白的抗原表位，E蛋白也会屏蔽β-葡聚糖的佐剂活性位点，这些相互作用限制了结合疫苗免疫原性的提高；因此，本发明进一步的采用了含二硫键和腙键的连接桥共价结合E蛋白与β-葡聚糖，细胞内的谷胱甘肽和微酸环境能分别断裂二硫键和腙键，使得E蛋白和β-葡聚糖充分解离，避免了这些相互作用，从而刺激机体产生更强的免疫反应。

二硫键和腙键降低了β-葡聚糖特异性抗体的产生。β-葡聚糖与E蛋白共价结合，会增强E蛋白的免疫原性；但同时E蛋白的抗原表位能够帮助β-葡聚糖特异性的B细胞激活T-辅助细胞，产生β-葡聚糖特异性的抗体，从而影响疫苗的免疫活性，并产生一定的毒负作用。针对这一问题，E蛋白和β-葡聚糖之间的二硫键和腙键将两者在细胞内充分解离，使得β-葡聚糖特异性B细胞激活T-辅助细胞的能力大幅度下降，从而避免或大幅降低β-葡聚糖特异性抗体的产生。

附图说明

图1E蛋白的分离纯化，左图为Ni Sepharose Fast Flow(5mL)纯化含有E蛋白的包涵体复性液的色谱图，右图为SDS-PAGE电泳鉴定纯化的E蛋白，第1泳道为标准蛋白，第2泳道为E蛋白；

图2E-PS-1的制备反应示意图；

图3E-PS-2的制备反应示意图；

图4E-PS-1和E-PS-2的分离纯化。由Superdex 200凝胶过滤柱(1.6cm×60cm)纯化含有E-PS-1(左图)和E-PS-2(右图)的反应混合液，流动相为PBS缓冲液(pH7.4)，流速2.0毫升/分钟，检测波长为280纳米；

图5凝胶过滤柱分析E-PS-1和E-PS-2的纯度。由分析型Superdex 200凝胶过滤柱(1cm×30cm)进行检测，流动相为PBS缓冲液(pH 7.4)，流速0.5毫升/分钟，检测波长为280纳米；

图6圆二色光谱分析E-PS-1和E-PS-2的结构，蛋白浓度为0.1mg/mL，缓冲体系为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)；

图7内源荧光光谱分析E-PS-1和E-PS-2的结构。蛋白浓度为0.1mg/mL，缓冲体系为20mM磷酸缓冲液(pH 7.4)，激发波长为280nm，发射波长的扫描范围为300-400nm；

图8红外光谱分析E-PS-1和E-PS-2的结构；

图9E-PS-1和E-PS-2免疫BALB/c小鼠后的E蛋白特异性抗体反应，抗体滴度由ELISA法测定，每组6只小鼠；

图10E-PS-1和E-PS-2免疫BALB/c小鼠后的β-葡聚糖特异性抗体反应，抗体滴度由ELISA法测定，每组6只小鼠；

图11ELISA法测定E-PS-1和E-PS-2的抗原性，(■)为E蛋白组、(●)为E-PS-2组、(Δ)为二硫苏糖醇处理的E-PS组；

图12E-PS-1和E-PS-2免疫BALB/c小鼠后刺激产生的细胞因子，图a为测定IFN-γ的浓度；图b为测定IL-2的浓度；图c为测定IL-10的浓度；图d为测定TNF-α的浓度，细胞因子的ELISA法测定，每组6只小鼠；

图13E-PS-1和E-PS-2在大鼠体内的代谢变化。

具体实施方式

本说明书中公开得任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或者类似特征中的一个例子而已。所述仅仅是为了帮助理解本发明，不应该视为对本发明的具体限制。

下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1：E蛋白的表达与纯化

E蛋白的基因序列源自寨卡病毒BeH818995株的囊膜蛋白(Genebank序号：KU365777)；在E蛋白基因序列源(1-409氨基酸残基)的C末端融合6个组氨酸残基。将合成基因序列后其克隆至pET21a表达载体中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行高效表达。由限制性酶切和DNA序列分析来确定合成的DNA序列。活化表达E蛋白的大肠杆菌菌体，按1％的比例接种到200ml LB培养基，振荡培养至OD₆₀₀等于0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于37℃下诱导3～4小时。于4℃和10000rpm离心10分钟，收集菌体，重悬于50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)。于冰浴下进行超声破碎1小时(240W，超声2秒，停5秒)。然后于4℃和10000rpm离心30分钟，收集沉淀，即包涵体。

用包涵体洗涤液洗涤3次，然后用包涵体溶解液于37℃水浴中溶解2小时。将蛋白浓度调整为1.0mg/mL，最后在4℃条件下逐滴加入到包涵体复性液中，蛋白终浓度为0.1mg/mL，于4℃下复性过夜。其中，包涵体洗涤液为50mM Tris-HCl(含1M NaCl和2M尿素，pH8.0)；包涵体溶解液为50mM Tris-HCl(含1mM EDTA、15mM DTT和8M尿素，pH 8.0)；包涵体复性液为100mM Tris-HCl(含0.18mM EDTA，4mM L-精氨酸，0.9mM还原型谷胱甘肽，0.18mM氧化型谷胱甘肽和2M尿素，pH 8.0)。

由Ni Sepharose Fast Flow亲和层析柱(5mL)对复性的E蛋白进行分离纯化。层析柱由含0.5M NaCl和20mM咪唑的20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.2，A液)洗脱5个柱体积。将样品装载到层析柱上，用含有0-0.5M咪唑的A液梯度洗脱10个柱体积。如图1(左图)所示，经梯度洗脱后出现了两个分开的洗脱峰。收集E蛋白对应的洗脱峰(即第2个洗脱峰)，浓缩后于-80℃保存。如图1(右图)所示，SDS-PAGE电泳结果表明纯化的E蛋白为单点电泳纯，对应的分子量约为46kDa。

实施例2：疫苗的制备与纯化

(1)E-PS-1的制备

E蛋白带有半胱氨酸残基，位于E蛋白分子的表面；半胱氨酸的巯基可用于共价结合β-葡聚糖。如图2示，将高碘酸钠溶于体积为5mL的50mM醋酸缓冲液(pH5.6)中，使其终浓度为40mM。将β-葡聚糖(PS-OH)溶于体积为5m1的50mM醋酸缓冲液(pH 5.6)中，使其终浓度为10mg/mL。将两者混合，于室温下避光放置20分钟。随后，用PBS缓冲液(pH 7.4)透析除去未反应的高碘酸钠。浓度为2mg/mL的氧化β-葡聚糖(5mL)与浓度为0.2mg/mL的氨基乙基-马来酰亚胺酯(5mL)在PBS缓冲液(pH 7.4)中反应过夜，反应温度为4℃。用PBS缓冲液(pH7.4)透析除去未反应的氨基乙基-马来酰亚胺酯。随后，加入浓度为0.5mg/mL的E蛋白(2mL)，于4℃下反应过夜。E蛋白的巯基与β-葡聚糖的马来酰亚胺酯反应，生成不带二硫键和腙键的结合疫苗(E-PS-1)。

(2)E-PS-2的制备

如图3所示，浓度为2mg/mL的氧化β-葡聚糖(5mL)与浓度为0.2mg/mL的二硫吡啶丙酰肼(PDPH，5mL)在PBS缓冲液(pH 7.4)中反应过夜，反应温度为4℃。用PBS缓冲液(pH 7.4)透析除去未反应的二硫吡啶丙酰肼。随后，加入浓度为0.5mg/mL的E蛋白(2mL)，于4℃下反应过夜。E蛋白的巯基与β-葡聚糖的二硫键反应，生成带二硫键和腙键的结合疫苗(E-PS-2)。

(3)E-PS-1和E-PS-2的分离纯化

由Superdex 200凝胶过滤柱(1.6cm×60cm)纯化含有E-PS-1的反应混合物或E-PS-2的反应混合物。如图4(左图)所示，将含有E-PS-1的反应混合物装载到层析柱上，经洗脱后出现了两个洗脱峰。小洗脱峰的出峰体积为45.1mL，对应于结合程度较高的结合物。大洗脱峰的出峰体积为68.3mL，对应于结合程度较低的结合物，即E-PS-1。如箭头所示收集E-PS-1，获得高纯度的E-PS-1，浓缩后于-80℃保存。如图4(右图)所示，将含有E-PS-2的反应混合物装载到层析柱上，经洗脱后也出现了两个洗脱峰。如箭头所示收集E-PS-2，获得高纯度的E-PS-2，浓缩后于-80℃保存。

实施例3：凝胶过滤分析疫苗的纯度

将E-PS-1和E-PS-2用分析型Superdex 200凝胶过滤柱(1.0cm×30cm)进行鉴定，洗脱液为PBS缓冲液(pH 7.4)，流速为0.5mL/min。如图5所示，E蛋白、E-PS-1和E-PS-2均呈现出一条单一的洗脱峰。与E蛋白的洗脱峰(15.4mL)相比，E-PS-1和E-PS-2的出峰时间均明显提前。这表明与β-葡聚糖的共价结合显著增强了E蛋白的水化体积。E-PS-1和E-PS-2的出峰时间均为7.7mL，表明以腙键和二硫键作为连接桥未改变结合物的水化体积。

实施例4：圆二色光谱分析疫苗的结构

圆二色光谱分析E-PS-1和E-PS-2中E蛋白的二级结构。如图6所示，E-PS-1、E-PS-2与E蛋白的远紫外圆二色光谱几乎重合，仅有细微的差别，而且三种样品均含有丰富的α螺旋和β折叠结构。这表明β-葡聚糖的共价结合和腙键、二硫键作为连接桥均未改变E蛋白的二级结构。

实施例5：内源荧光光谱分析疫苗的结构

如图7所示，E蛋白经280nm激发时，能在337nm处产生最高的荧光发射强度。与E蛋白相比，E-PS-1在337nm处的最高荧光强度有小幅下降。这表明β-葡聚糖的共价结合仅轻微影响了E蛋白的三级结构。然而，E-PS-2的荧光强度要远远低于E蛋白。由于E-PS-2带有二硫键，而E蛋白的色氨酸能将电子传递给二硫键，这使得二硫键起到了荧光淬灭剂的作用，降低了E-PS-2的荧光强度。

实施例6：红外光谱分析疫苗的结构

如图8所示，E蛋白、β-葡聚糖、E-PS-1和E-PS-2均在1100cm^-1(C-O键拉伸)、952cm^-1(O-H键摇摆)、2925cm^-1(-CH₂键非对称拉伸)和2851cm^-1(-CH₂键对称拉伸)展现出特征峰。β-葡聚糖在3400cm^-1处的特征峰是由O-H键拉伸引起，而E蛋白在3400cm^-1处的特征峰是由其氨基的N-H键拉伸引起。E-PS-1和E-PS-2光吸收值要高于E蛋白和β-葡聚糖，这是由E蛋白与β-葡聚糖共价结合产生的。E蛋白在2590cm^-1处由1个较弱的吸收峰，是由S-H键拉伸引起。相比之下，E-PS-1和E-PS-2没有该吸收峰。这表明E蛋白与β-葡聚糖的共价结合是通过E蛋白的巯基进行的。

实施例7：测定疫苗诱导的E蛋白特异性抗体水平

选取24只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分为4组，即PBS组、E蛋白组、E-PS-1组和E-PS-1组，每组6只小鼠。以皮下注射的方式，每只小鼠的注射体积为0.2mL。PBS组仅注射PBS缓冲液(pH 7.4)，其它3组注射相对应的样品。对应样品的E蛋白浓度为50μg/mL。分别于第0、7、14和21天注射，共注射四次。第2、3、4次注射前(即第7、14、21天)分别从眼眶取血，第28天摘眼球取血。离心收集血清，于-80℃保存备用。用ELISA法检测小鼠抗血清中抗E蛋白的IgG滴度。

如图9所示，PBS组的E蛋白特异性IgG滴度几乎不能检测。E蛋白组的E蛋白特异性IgG滴度在前3针(7天、14天和21天)的水平很低，在第4针(28天)的滴度达到1.2×10⁴。E-PS-1组的E蛋白特异性IgG滴度在第7天达到5.2×10²，随后持续增加。其中，在第14天达到2.6×10³，第21天达到1.2×10⁴，第28天达到1.3×10⁵。这表明E蛋白与β-葡聚糖的共价结合显著增强了机体对E蛋白的抗体应答水平。E-PS-2组的抗E蛋白IgG滴度在第7天达到8.0×10²，随后持续增加。其中，在第14天达到3.3×10³，第21天达到5.8×10⁴，第28天达到3.3×10⁵。这表明以腙键和二硫键作为E蛋白与β-葡聚糖的连接桥，可以进一步增强E蛋白的抗体应答水平。

实施例8：测定疫苗诱导的β-葡聚糖特异性抗体水平

如图10所示，PBS组和E蛋白组的β-葡聚糖特异性IgG滴度几乎不能检测。E-PS-1组的β-葡聚糖特异性IgG滴度达到1.5×10³。这表明E蛋白与β-葡聚糖的共价结合能刺激机体产生一定水平的β-葡聚糖特异性抗体。相比之下，E-PS-2组的β-葡聚糖特异性IgG滴度仅为2.0×10²。这表明以腙键和二硫键作为连接桥，可以大幅降低β-葡聚糖特异性抗体的产生。

实施例9：测定疫苗的抗原性

二硫苏糖醇(DTT)可用于还原E-PS-2的二硫键。将E-PS-2与DTT按照摩尔比为1:10的比例混合。将E蛋白、E-PS-2和DTT处理的E-PS-2稀释至1ng/mL-16μg/mL的浓度范围。将上述E蛋白组抗血清稀释500倍，取100μL与50μL稀释的样品混合，于37℃孵育1小时，随后由ELISA法进行检测。如图11所示，E-PS-2孵育的抗血清的光吸收值要显著高于E蛋白。这表明β-葡聚糖的共价偶联能屏蔽E蛋白的部分抗原表位，使得E-PS-2不能有效与抗血清中E蛋白特异性抗体进行结合。DTT处理后，E-PS-2孵育的抗血清的光吸收值与E蛋白相当。这说明DTT处理能使β-葡聚糖和E蛋白解离，从而恢复E蛋白的抗原性，进而有效地结合抗血清中E蛋白特异性抗体。

实施例10：测定疫苗诱导的细胞免疫水平

第28天取小鼠的新鲜脾脏，研磨分离出脾脏细胞进行细胞培养。在细胞数目达到5×10⁶后，用20μg/ml的免疫原蛋白E刺激72个小时，离心收集上清。用IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α细胞因子ELISA检测试剂盒，测定细胞培养上清中的IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α水平。如图12所示，PBS组产生了较低水平的细胞因子。与PBS组相比，E蛋白组的IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α水平均有一定程度的增加。与E蛋白组相比，E-PS-1组的IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α水平分别增加了5.5、4.5、1.3和0.9倍。这表明E蛋白与β-葡聚糖的共价偶联显著增强了机体对E蛋白的Th1型和Th2型细胞免疫应答的水平。与E蛋白组相比，E-PS-2组的IFN-γ、IL-2、IL-10和TNF-α水平分别增加了13.3、7.2、3.3和1.7倍。这表明以腙键和二硫键作为连接桥，可以进一步增强E蛋白的Th1型和Th2型细胞免疫应答的水平。

实施例11：疫苗的药代动力学测定

取雄性SD大鼠15只，随机分为3组(7-8周，平均体重250克左右)，即E蛋白组、E-PS-1和E-PS-2组，每组5只大鼠。皮下给药，每只大鼠的注射剂量为1.0mg E蛋白/kg大鼠，分别于给药后1、2、4、8、24、48、72和120小时取血。血浆中的E蛋白浓度由双抗夹心ELISA法测定。如图13所示，E蛋白组的E蛋白浓度在皮下给药1小时后达到最高值，随后快速下降。E-PS-1组和E-PS-2组的E蛋白浓度在皮下给药2小时后达到最高值，随后的下降速度要低于E蛋白组。E蛋白组的血浆半衰期(T_1/2)为11.4±2.3小时，血浆峰值浓度(C_max)为4.5±0.2μg mL^-1，曲线下峰面积(AUC_0-120h)为22.5μg h mL^-1。E-PS-1组的血浆半衰期(T_1/2)为31.9±7.5小时，血浆峰值浓度(C_max)为4.4±0.2μg mL^-1，曲线下峰面积(AUC_0-120h)为88.3μg h mL^-1。E-PS-2组的血浆半衰期(T_1/2)为37.5±8.0小时，血浆峰值浓度(C_max)为4.7±0.4μg mL^-1，曲线下峰面积(AUC_0-120h)为105.2μg h mL^-1。这表明E蛋白与β-葡聚糖共价结合后，E蛋白的分子半径增加，可减少肾小球对偶联物的过滤作用，延长疫苗的半衰期，使抗原可以持续地刺激免疫系统，增强机体对疫苗的免疫应答。此外，腙键和二硫键作为连接桥，并未显著影响结合物的药代动力学特性。

本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。

本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。