阅读说明：本技术 一种纳米硒的制备方法 (Preparation method of nano-selenium ) 是由 梅运军 张笑迎 刘欢 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种纳米硒的制备方法,所述纳米硒的制备方法包括以下步骤：对枯草芽孢杆菌进行活化,制得枯草芽孢杆菌活化液；将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养,得到发酵培养液；离心收集所述发酵培养液中的沉淀物,并使用氯化钠溶液对所述沉淀物进行重悬,得到重悬液；配制不同浓度的蔗糖储存液,并将所述蔗糖储存液按照浓度从高到低的顺序依次加入到离心管内,添加完毕后在3～5℃下静置10～14h,得到形成有蔗糖浓度梯度的离心管；将所述重悬液加入到所述形成有蔗糖浓度梯度的离心管中,离心并收集沉淀,制得纳米硒。本发明制得的纳米硒粒径在100～200nm范围内,更有利于人吸收。(The invention discloses a preparation method of nano-selenium, which comprises the following steps: activating bacillus subtilis to prepare a bacillus subtilis activation solution; inoculating the bacillus subtilis activation solution into an LB liquid culture medium containing sodium selenite for fermentation culture to obtain a fermentation culture solution; centrifuging and collecting the precipitate in the fermentation culture solution, and carrying out heavy suspension on the precipitate by using a sodium chloride solution to obtain a heavy suspension; preparing sucrose storage solutions with different concentrations, sequentially adding the sucrose storage solutions into a centrifugal tube according to the sequence of the concentration from high to low, and standing for 10-14 h at 3-5 ℃ after the addition is finished to obtain the centrifugal tube with sucrose concentration gradient; and adding the re-suspension into the centrifugal tube with the sucrose concentration gradient, centrifuging and collecting precipitates to obtain the nano-selenium. The particle size of the nano-selenium prepared by the invention is within 100-200 nm, which is more beneficial to human absorption.)

一种纳米硒的制备方法

技术领域

本发明涉及纳米硒制备技术领域，具体涉及一种纳米硒的制备方法。

背景技术

1817年，瑞典化学家从硫酸厂的铅室底部红色粉状物质中发现并命名为硒，从此，人们展开了对硒的广泛研究。硒的价态包括﹣Ⅱ、0、﹢Ⅳ和﹢Ⅵ价，其在环境中以硒酸盐、亚硒酸盐、单质硒和有机硒等多种形式存在。

硒作为人体必须微量元素之一，在生物体内发挥着诸多生物学功能，如抗氧化、保护及修复细胞膜、增强免疫力、增强红细胞的携氧能力、解毒排毒以及防癌等。其中，最主要的生物学功能是抗氧化作用。但是硒在生物体内仅在一个有限的浓度范围内发挥作用，它在生物体内是否处于平衡状态直接影响着生物体的健康，硒过量或缺乏都将引发相关疾病。1988年，中国营养学会针对不同的人群制定了硒摄入量标准。建议对于成年人来说硒的最高摄入量为400μg/d，推荐摄入量为50～250μg/d，儿童为20～50μg/d，普通癌症患者为200～400μg/d。

硒元素的地理分布非常不均匀，全球有四十多个国家和地区属于缺硒地区，中国则是其中之一，中国二十二个省市的部分地区，约七亿人生活在低硒地区，如华北、东北、西北等许多大中城市都处在缺硒区域内。缺硒地区人群的天然食品含硒量一般较低，很难从中达到补硒的目的。服用补硒剂可有效改善缺硒现象。不同化学形态的硒在人体内的吸收利用、生物效应及毒性作用等各方面也不同。所以，补硒产品的开发要特别注意硒产品的化学形态及添加量。目前，全球范围的补硒工作都有所进展，国内外已有多款补硒产品相继问世。常见的补硒产品大致可以分为两种：无机硒类补硒剂以及有机硒类补硒剂。

有机硒类补硒品相对于无机硒来说其生物活性和毒性有很大的改善，但其仍然面临诸多问题，纳米尺寸的单质硒的出现为硒类产品开发带来了希望。普通零价态的硒以黑色、灰色粉末状存在，无生物活性；而纳米尺度的硒为红色，在水中形成红亮透明胶体，具有生物活性。鉴于纳米硒比其他形式的硒具有更高的生物活性和更低的毒性，使其在医药保健品市场上具有更大的吸引力与竞争力，可以预料，纳米硒将具有强大的发展潜力和应用前景。但是现有制备纳米硒的技术所获得的纳米硒还存在粒径分布范围过宽，其中的大颗粒纳米硒不利于人体吸收的问题，有待进一步的改进。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种纳米硒的制备方法，旨在提供一种更利于人体吸收的纳米硒的制备方法。

为实现上述目的，本发明提出一种纳米硒的制备方法，包括以下步骤：

对枯草芽孢杆菌进行活化，制得枯草芽孢杆菌活化液；

将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养，得到发酵培养液；

离心收集所述发酵培养液中的沉淀物，并使用氯化钠溶液对所述沉淀物进行重悬，得到重悬液；

配制不同浓度的蔗糖储存液，并将所述蔗糖储存液按照浓度从高到低的顺序依次加入到离心管内，添加完毕后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有蔗糖浓度梯度的离心管；

将所述重悬液加入到所述形成有蔗糖浓度梯度的离心管中，离心并收集沉淀，制得纳米硒。

可选地，对枯草芽孢杆菌进行活化，制得枯草芽孢杆菌活化液的步骤，包括：

从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌的单菌落至LB液体培养基中，培养获得枯草芽孢杆菌活化液，其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168菌株。

可选地，将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养，得到发酵培养液的步骤中：

所述含有亚硒酸钠的LB液体培养基中，亚硒酸钠的浓度为1～5mmol/L。

可选地，将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养，得到发酵培养液的步骤中：

所述含有亚硒酸钠的LB液体培养基中还含有丁硫氨酸亚砜亚胺，所述丁硫氨酸亚砜亚胺的浓度为0.01～0.5mol/L。

可选地，将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养，得到发酵培养液的步骤中：

所述枯草芽孢杆菌活化液的体积为所述含有亚硒酸钠的LB液体培养基体积的1～3％。

可选地，将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养，得到发酵培养液的步骤中：

所述发酵培养时的培养转速为150～200r/min，培养温度为30～37℃，培养时间为36～72h。

可选地，离心收集所述发酵培养液中的沉淀物，并使用氯化钠溶液对所述沉淀物进行重悬，得到重悬液的步骤中：

所述离心时的离心力为6500～7500g，离心时间为25～35min。

可选地，离心收集所述发酵培养液中的沉淀物，并使用氯化钠溶液对所述沉淀物进行重悬，得到重悬液的步骤中：

每50mL的发酵培养液离心后所得到的所述沉淀物，对应使用2～3mL的氯化钠溶液进行重悬，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.9％。

可选地，配制不同浓度的蔗糖储存液，并将所述蔗糖储存液按照浓度从高到低的顺序依次加入到离心管内，添加完毕后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有蔗糖浓度梯度的离心管的步骤，包括：

按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到不同浓度的蔗糖储存液；

将所述蔗糖储存液按照等体积的添加量、且浓度从高到低的顺序依次加入到离心管中，添加完毕后将离心管在3～5℃下静置10～14h，得到形成有蔗糖浓度梯度的离心管。

可选地，将所述重悬液加入到所述形成有蔗糖浓度梯度的离心管中，离心并收集沉淀，制得纳米硒的步骤中：

所述离心时的离心力为10000～12000g，离心时间为25～35min。

本发明提供的技术方案中，将枯草芽孢杆菌活化后接种至含有亚硒酸钠的LB培养基中发酵制备纳米硒，再配制不同浓度梯度的蔗糖储存液，利用浓度梯度离心的方式对纳米硒进行纯化，最终所制得的纳米硒粒径在100～200nm范围内，更有利于人吸收。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的纳米硒的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为实施例6制备的纳米硒的电镜观测结果图；

图3为对比例1制备的纳米硒的电镜观测结果图；

图4为对比例2制备的纳米硒的电镜观测结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

有机硒类补硒品相对于无机硒来说其生物活性和毒性有很大的改善，但其仍然面临诸多问题，纳米尺寸的单质硒的出现为硒类产品开发带来了希望。普通零价态的硒以黑色、灰色粉末状存在，无生物活性；而纳米尺度的硒为红色，在水中形成红亮透明胶体，具有生物活性。鉴于纳米硒比其他形式的硒具有更高的生物活性和更低的毒性，使其在医药保健品市场上具有更大的吸引力与竞争力，可以预料，纳米硒将具有强大的发展潜力和应用前景。但是现有制备纳米硒的技术所获得的纳米硒还存在粒径分布范围过宽，其中的大颗粒纳米硒不利于人体吸收的问题，有待进一步的改进。

鉴于此，本发明提出一种纳米硒的制备方法，通过对纳米硒的制备方法进行改进，制得粒径分布在100～200nm范围内的纳米硒，更利于人体吸收，图1所示为本发明提供的纳米硒的制备方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述纳米硒的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、对枯草芽孢杆菌进行活化，制得枯草芽孢杆菌活化液；

在本实施例中，对枯草芽孢杆菌进行活化的具体步骤包括：从LB固体培养基(LB培养基的全称为Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤培养基，分为固体培养基和液体培养基)上挑选枯草芽孢杆菌的单菌落至LB液体培养基中，培养获得枯草芽孢杆菌活化液，其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168菌株，该菌株为模式菌株，可直接经市售购得，更进一步地，活化培养的培养条件为：摇床转速150～200r/min、培养温度30～37℃、培养时间8～12h。

步骤S20、将所述枯草芽孢杆菌活化液接种到含有亚硒酸钠的LB液体培养基中进行发酵培养，得到发酵培养液；

所述亚硒酸钠的作用是作为制备纳米硒的硒源，经过枯草芽孢杆菌的发酵培养过程后转化为纳米硒，在本实施例中，所述含有亚硒酸钠的LB液体培养基中，亚硒酸钠的浓度为1～5mmol/L。所述亚硒酸钠可以一次性全部加入所述LB液体培养基中，也可以分多次添加，在本实施例中优选为多次添加，且其终浓度在2～3mmol/L范围内有助于获得粒径分布均匀的的纳米硒，同时还能保障较高的亚硒酸钠转化率。

作为本实施例的一个优选实施方式，所述含有亚硒酸钠的LB液体培养基中还含有丁硫氨酸亚砜亚胺，通过丁硫氨酸亚砜亚胺的添加，抑制发酵液中例如谷氨酸半胱氨酸合成酶等酶的活性，进而抑制纳米硒的合成，起到防止纳米硒团聚的作用，从而避免大颗粒纳米硒的生成，缩小了制备所得的纳米硒的粒径分布范围，使得生成的纳米硒的粒径均分布在100～200nm，更利于人体的吸收。其中，所述丁硫氨酸亚砜亚胺在所述LB液体培养基中的浓度为0.01～0.5mol/L，在此浓度范围内，既能有效防止纳米硒团聚的作用，又能保障100～200nm粒径范围内的纳米硒正常生成。

进一步地，在本实施例中，所述枯草芽孢杆菌的进行发酵培养时的接种量为：所述枯草芽孢杆菌活化液的体积为所述含有亚硒酸钠的LB液体培养基体积的1～3％，更优选为2％。在所述发酵培养过程中，所述亚硒酸钠在枯草芽孢杆菌的发酵作用下转化生成纳米硒，更进一步地，所述发酵培养时的培养条件为：摇床转速为150～200r/min，培养温度为30～37℃，培养时间为36～72h。

步骤S30、离心收集所述发酵培养液中的沉淀物，并使用氯化钠溶液对所述沉淀物进行重悬，得到重悬液；

发酵培养完毕后，对获得的发酵培养液进行离心，在6500～7500g的离心力作用下离心25～35min，然后收集沉淀物，再使用氯化钠溶液对得到的沉淀物进行重悬，得到重悬液。进一步地，在进行重悬时，所述氯化钠容易的使用量为：每50mL的发酵培养液离心后所得到的所述沉淀物，对应使用2～3mL的氯化钠溶液进行重悬，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.9％。

步骤S40、配制不同浓度的蔗糖储存液，并将所述蔗糖储存液按照浓度从高到低的顺序依次加入到离心管内，添加完毕后在3～5℃下静置10～14h，得到形成有蔗糖浓度梯度的离心管；

在本实施例中，所述不同浓度的蔗糖储存液包括按10％的浓度梯度配制的10％～60％(质量体积比，m/v)的蔗糖水溶液，具体地，步骤S40包括：

步骤S41、按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到不同浓度的蔗糖储存液；

步骤S42、将所述蔗糖储存液按照等体积的添加量、且浓度从高到低的顺序依次加入到离心管中，添加完毕后将离心管在3～5℃下静置10～14h，得到形成有蔗糖浓度梯度的离心管。

按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，再加入浓度40％的蔗糖存储液，再加入浓度30％的蔗糖存储液，再加入浓度20％的蔗糖存储液，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为3～5℃的冰箱中，静置10～14h形成蔗糖浓度梯度。

步骤S50、将所述重悬液加入到所述形成有蔗糖浓度梯度的离心管中，离心并收集沉淀，制得纳米硒。

获得形成有蔗糖浓度梯度的离心管后，将上述得到的上述重悬液顺着离心管的管壁缓慢添加至离心管中，通过蔗糖浓度梯度离心的方式对发酵培养过程中生成的纳米硒进行纯化，能够使得纯化所得的纳米硒不含有细胞及细胞碎片，且粒径分布在100～200nm之间。具体地，所述离心时的离心力为10000～12000g，离心时间为25～35min，离心完毕后收集离心管底部的沉淀，即得到纳米硒。

本发明提供的技术方案中，将枯草芽孢杆菌活化后接种至含有亚硒酸钠的LB培养基中发酵制备纳米硒，再配制不同浓度梯度的蔗糖储存液，利用浓度梯度离心的方式对纳米硒进行纯化，最终所制得的纳米硒不会出现团聚，也不含有细胞及细胞碎片，粒径均匀分布在100～200nm的范围内，更有利于人吸收，而且亚硒酸钠具有较高的转化率，转化率达到76.2～92.5％。综合上述各项影响因素，通过本发明提供的方法制备纳米硒的最佳条件为：在步骤S20中的LB液体培养基中添加丁硫氨酸亚砜亚胺，其浓度为0.01～0.1mmol/L，亚硒酸钠分多次添加，其终浓度为2～3mmol/L，发酵培养时间为48～72h。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌168菌株的单菌落至LB液体培养基中，在180r/min、30℃的条件下培养10h，获得枯草芽孢杆菌活化液；

(2)按照2％(体积百分比，v/v)的接种量，将得到的枯草芽孢杆菌活化液接种至含有亚硒酸钠的LB液体培养基(亚硒酸钠的浓度为1mmol/L)中，在180r/min、30℃的条件下发酵培养42h，得到发酵培养液；

(3)对得到的发酵培养液进行离心，在7000g下离心30min，收集沉淀物，每50mL的发酵培养液经过离心所得的沉淀物使用2mL的质量浓度0.9％的氯化钠溶液重悬，得到重悬液；

(4)按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，以此类推，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为4℃的冰箱中，静置12h形成蔗糖浓度梯度。

(5)将步骤(3)制得的重悬液顺着离心管管壁缓慢添加至步骤(4)得到的形成蔗糖浓度梯度的离心管中，在11000g下离心30min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠的转化率为92.5％，纳米硒生成正常，粒径在100～200nm。

实施例2

(1)从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌168菌株的单菌落至LB液体培养基中，在150r/min、33℃的条件下培养8h，获得枯草芽孢杆菌活化液；

(2)按照1％(体积百分比，v/v)的接种量，将得到的枯草芽孢杆菌活化液接种至含有亚硒酸钠的LB液体培养基(亚硒酸钠的浓度为4mmol/L)中，在150r/min、33℃的条件下发酵培养48h，得到发酵培养液；

(3)对得到的发酵培养液进行离心，在6500g下离心35min，收集沉淀物，每50mL的发酵培养液经过离心所得的沉淀物使用3mL的质量浓度0.9％的氯化钠溶液重悬，得到重悬液；

(4)按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，以此类推，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为3℃的冰箱中，静置14h形成蔗糖浓度梯度。

(5)将步骤(3)制得的重悬液顺着离心管管壁缓慢添加至步骤(4)得到的形成蔗糖浓度梯度的离心管中，在10000g下离心35min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠的转化率为82.5％，纳米硒生成正常，粒径在100～200nm。

实施例3

(1)从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌168菌株的单菌落至LB液体培养基中，在150～200r/min、30～37℃的条件下培养8～12h，获得枯草芽孢杆菌活化液；

(2)按照3％(体积百分比，v/v)的接种量，将得到的枯草芽孢杆菌活化液接种至含有亚硒酸钠的LB液体培养基(亚硒酸钠的浓度为3mmol/L，LB液体培养基中还添加有浓度0.05mmol/L的丁硫氨酸亚砜亚胺)中，在200r/min、35℃的条件下发酵培养60h，得到发酵培养液；

(3)对得到的发酵培养液进行离心，在7500g下离心25min，收集沉淀物，每50mL的发酵培养液经过离心所得的沉淀物使用2mL的质量浓度0.9％的氯化钠溶液重悬，得到重悬液；

(4)按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，以此类推，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为5℃的冰箱中，静置10h形成蔗糖浓度梯度。

(5)将步骤(3)制得的重悬液顺着离心管管壁缓慢添加至步骤(4)得到的形成蔗糖浓度梯度的离心管中，在12000g下离心25min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠的转化率为87.3％，纳米硒生成正常，粒径在100～200nm。

实施例4

(1)从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌168菌株的单菌落至LB液体培养基中，在160r/min、37℃的条件下培养9h，获得枯草芽孢杆菌活化液；

(2)按照1.5％(体积百分比，v/v)的接种量，将得到的枯草芽孢杆菌活化液接种至含有亚硒酸钠的LB液体培养基(亚硒酸钠的浓度为5mmol/L，LB液体培养基中还添加有浓度0.2mmol/L的丁硫氨酸亚砜亚胺)中，在160r/min、37℃的条件下发酵培养72h，得到发酵培养液；

(3)对得到的发酵培养液进行离心，在6800g下离心33min，收集沉淀物，每50mL的发酵培养液经过离心所得的沉淀物使用2.5mL的质量浓度0.9％的氯化钠溶液重悬，得到重悬液；

(4)按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，以此类推，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为4℃的冰箱中，静置11h形成蔗糖浓度梯度。

(5)将步骤(3)制得的重悬液顺着离心管管壁缓慢添加至步骤(4)得到的形成蔗糖浓度梯度的离心管中，在11500g下离心27min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠的转化率为83.6％，纳米硒生成正常，粒径在100～200nm。

实施例5

(1)从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌168菌株的单菌落至LB液体培养基中，在170r/min、32℃的条件下培养11h，获得枯草芽孢杆菌活化液；

(2)按照2.5％(体积百分比，v/v)的接种量，将得到的枯草芽孢杆菌活化液接种至含有亚硒酸钠的LB培养基(亚硒酸钠的浓度为3mmol/L，LB液体培养基中还添加有浓度0.5mmol/L的丁硫氨酸亚砜亚胺)中，在170r/min、32℃的条件下发酵培养54h，得到发酵培养液；

(3)对得到的发酵培养液进行离心，在7200g下离心28min，收集沉淀物，每50mL的发酵培养液经过离心所得的沉淀物使用2mL的质量浓度0.9％的氯化钠溶液重悬，得到重悬液；

(4)按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，以此类推，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为4℃的冰箱中，静置13h形成蔗糖浓度梯度。

(5)将步骤(3)制得的重悬液顺着离心管管壁缓慢添加至步骤(4)得到的形成蔗糖浓度梯度的离心管中，在10000g下离心32min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠的转化率为76.2％，纳米硒生成正常，粒径在100～200nm。

实施例6

(1)从LB固体培养基上挑选枯草芽孢杆菌168菌株的单菌落至LB液体培养基中，在180r/min、30℃的条件下培养10h，获得枯草芽孢杆菌活化液；

(2)按照2％(体积百分比，v/v)的接种量，将得到的枯草芽孢杆菌活化液接种至含有亚硒酸钠的LB培养基(亚硒酸钠分多次添加，终浓度为2～3mmol/L，LB液体培养基中还添加有浓度0.1mmol/L的丁硫氨酸亚砜亚胺)中，在180r/min、30℃的条件下发酵培养66h，得到发酵培养液；

(3)对得到的发酵培养液进行离心，在7000g下离心30min，收集沉淀物，每50mL的发酵培养液经过离心所得的沉淀物使用2mL的质量浓度0.9％的氯化钠溶液重悬，得到重悬液；

(4)按照每100mL水中对应加入10g、20g、30g、40g、50g、60g蔗糖的比例，分别配制得到浓度梯度为10％、20％、30％、40％、50％和60％的蔗糖储存液，使用时按照等体积的添加量，先向离心管底部加入浓度60％的蔗糖存储液，然后加入浓度50％的蔗糖存储液，以此类推，最后加入浓度10％的蔗糖存储液，然后将离心管放入温度设置为4℃的冰箱中，静置12h形成蔗糖浓度梯度。

(5)将步骤(3)制得的重悬液顺着离心管管壁缓慢添加至步骤(4)得到的形成蔗糖浓度梯度的离心管中，在10000g下离心30min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠的转化率为89.7％，纳米硒生成正常，粒径在100～200nm。

对比例1

步骤与实施例2相同，不同之处在于，步骤(2)中的LB液体培养基中亚硒酸钠的浓度大于5mmol/L，且未添加丁硫氨酸亚砜亚胺。

对比例2

步骤与实施例6相同，不同之处在于，步骤(3)获得重悬液后，直接对该重悬液进行离心处理，在10000g下离心30min，收集底部沉淀，得到纳米硒。

亚硒酸钠转化率为89.1％，纳米硒粒径大部分分布在100～200nm。

使用扫描电镜观察实施例6、对比例1和对比例2制得的纳米硒，观察结果分别如图2、图3和图4所示，需要说明的是，由于实施例1至实施例6中纳米硒均为正常生成，且粒径均分布在100～200nm，因此经过电镜观察所得的结果基本一致，故此处仅以实施例6的观测结果为例，与对比例1和对比例2进行对比。

从图2至图4可以看出，采用本发明实施例提供的方法制备纳米硒，纳米硒生成正常，粒径均匀分布在100～200nm范围内，有利于纳米硒的人体吸收；对比例1中虽然大部分纳米硒的粒径分布在100～200nm之间，但是出现了部分较大的颗粒团聚(图3中箭头所示为纳米硒发生团聚)，不利于人体吸收；对比例2中则出现了生成的纳米硒附着在细胞表面(图4中长箭头所示为细胞，短箭头所示为纳米硒颗粒)的情况，也即，制得的纳米硒含有细胞培养物，不符合使用需求。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。