具体实施方式

为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。

在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为伪(或不存在)、A为伪(或不存在)且B为真(或存在)、A和B均为真(或存在)。此外，在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由…所组成”及“实质上由…所组成”等封闭式或半封闭式连接词。

在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。

若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。

在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。

在本文中，对于使用马库什群组(Markush group)或选项式用语以描述本发明特征或实例的情形，本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或任何个别要素亦可用于描述本发明。举例而言，若X描述成“选自于由X₁、X₂及X₃所组成的群组”，亦表示已经完全描述出X为X₁的主张与X为X₁及/或X₂的主张。再者，对于使用马库什群组或选项式用语以描述本发明的特征或实例的情况，本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或个别要素的任何组合亦可用于描述本发明。据此，举例而言，若X描述成“选自于由X₁、X₂及X₃所组成的群组”，且Y描述成“选自于由Y₁、Y₂及Y₃所组成的群组”，则表示已经完全描述出X为X₁或X₂或X₃而Y为Y₁或Y₂或Y₃的主张。

以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。

根据本公开的一个实施方式，其提供了一种对广藿香油的质量检测方法，包括以下步骤：

S1：使用GC-MS测量广藿香油的图谱；

S2：将步骤S1中的图谱根据GC-MS NIST数据库进行匹配以得到特征峰的定性归属信息；

S3：根据步骤S1中的图谱结合步骤S2中的定性归属信息，在步骤S1中的图谱中，检测对应于刺蕊草烯、δ-愈创木烯、广藿香醇及广藿香酮的峰的峰面积，若其峰面积总和占比大于70％，则表明所述广藿香油的质量合格。

本公开的发明人发现，广藿香油的药效与上述四种特定成分的含量密切相关。因此，通过控制上述四种特定成分的峰面积可以准确控制广藿香油的质量。

根据本公开的另一个实施方式，其中

在上述步骤S3中，若对应于刺蕊草烯、δ-愈创木烯、广藿香醇及广藿香酮的峰的峰面积总和占比大于70％，且广藿香醇相对峰面积大于30％，则表明所述广藿香油的质量合格。

本公开的发明人发现，广藿香油的药效同时还与广藿香醇的含量密切相关。因此，通过控制广藿香醇相对峰面积可以准确控制广藿香油的质量。

根据本公开的另一个实施方式，其中

在步骤S1中具体包括：移取广藿香油样品，加入正己烷，摇匀，得供试品溶液；

色谱条件如下：色谱柱为Agilent HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；程序升温为70℃以3℃/min升至150℃，再以2℃/min升至170℃，再以5℃/min升至230℃，保持11min；检测器为MS；进样口温度为230℃；检测器温度为250℃；载气为He；柱流速设为1mL/min；进样量为1μL；分流比为50:1；扫描类型为SCAN；SCAN模式分子量范围为50-550。

通过使用上述特定方法和条件，可以准确地得到所需的峰面积参数，从而准确地检测广藿香油的质量。

根据本公开的另一个实施方式，其提供了一种对广藿香油的质量检测方法，包括以下步骤：

S1’：使用GC-FID测量广藿香油的图谱；

S2’：将步骤S1’中的图谱以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，设定S1色谱图为参照色谱图，对保留时间的色谱峰进行多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱；

S3’：根据步骤S1’中的图谱结合步骤S2’中的对照指纹图谱，用内标法定量地得到广藿香醇和广藿香酮的比例范围，若所述广藿香醇和广藿香酮的比例范围在14:1～35:1的范围内，则表明所述广藿香油的质量合格。

本公开的发明人发现，广藿香油的药效与广藿香醇和广藿香酮的比例密切相关，而且，GC-FID可以更简单地得到广藿香油中特定成分的比例。因此，通过控制上述广藿香醇和广藿香酮的比例可以准确控制广藿香油的质量。

根据本公开的另一个实施方式，其中

在使用GC-FID的方法的步骤S3’中，若所述广藿香醇和广藿香酮的比例范围在28:1～32:1的范围内，则表明所述广藿香油的质量合格。

广藿香醇和广藿香酮的比例在上述范围内时。上述广藿香油的质量更加优异。

根据本公开的另一个实施方式，其中

在步骤S1’中具体包括：将广藿香油加入正己烷，摇匀，得待测溶液；

色谱条件为：

色谱柱：安捷伦HP-5，30m×0.32mm×0.25μm；程序升温：70℃以2℃/min升至150℃，再以2℃/min升至170℃，再以5℃/min升至230℃，保持11min；检测器：FID；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：He；柱流速：1mL/min；进样量：1μL；分流比：50:1。

通过使用上述特定方法和条件，可以准确地得到所需的特定成分的比例参数，从而准确地检测广藿香油的质量。

根据本公开的另一个实施方式，其提供了一种广藿香油包合物，其中，

所述广藿香油包合物由羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精包合载体联用配方组成，

所述广藿香油：羟丙基-β-环糊精：磺丁基-β-环糊精混合的质量比例为1:5:0.1～1:5:5。

将羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精联用制备包合物，有助于提高包合率以及稳定性。

根据本公开的另一个实施方式，其提供了制备根据权利要求7所述的广藿香油包合物的方法，该方法包括：

将广藿香挥发油与无水乙醇配制成1:2的广藿香挥发油溶液，将羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精混合，用水配成饱和溶液，在常温下将广藿香油慢速滴加到环糊精饱和溶液中，持续搅拌包合，然后低温放置，抽滤，静置，冷冻干燥，得包合物。

通过上述方法，可以以简单的步骤有效地制备所述广藿香油包合物。

根据本公开的另一个实施方式，其提供了一种广藿香油干混悬剂，其中，该干混悬剂中广藿香油质量分数为5～15％，

填充剂为可溶性淀粉、糊精、乳糖等中的一种或几种，质量分数为70～90％，助悬剂选用卡波姆940、琼脂、黄原胶、羧甲基纤维素钠中的一种或几种，质量分数为1-8％，表面活性剂选用吐温80、吐温20、吐温85、司盘20中的一种或几种，质量分数为1％～10％。

通过使用上述广藿香油干混悬剂，可以解决挥发油的溶解性问题，还可缓解疾病胀气导致的不适，适合用于消化道口服药物处方。

根据本公开的另一个实施方式，其提供了根据权利要求9所述的广藿香油干混悬剂的制备方法，其中，

该方法包括粉碎过筛、混合、制粒与整粒。

通过上述方法，可以以简单的步骤有效地制备所述广藿香油干混悬剂。

根据本公开的另一个实施方式，其提供了根据所述的广藿香油包合物或者根据所述的广藿香油干混悬剂在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的用途。

更具体而言，根据本公开的一个实施方式，所述的特征图谱的建立方法包括：

(1)对照品溶液的制备：取1～2mg市售的广藿香醇和广藿香酮对照品，分别加正己烷溶解；

(2)供试品溶液的制备：分别移取市售样品50μL，分别加入200μL正己烷，摇匀，得供试品溶液；

(3)色谱条件：

色谱柱：Agilent HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm(序列号USN398724H)；程序升温：70℃以3℃/min升至150℃，再以2℃/min升至170℃，再以5℃/min升至230℃，保持11min；检测器：MS；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：He；柱流速：1mL/min；进样量：1μL；分流比：50:1；扫描类型：SCAN；SCAN模式分子量范围：50-550。

(4)分析方法：采用GC-MS技术测定，对于对照品溶液和供试品溶液的色谱和质谱信息进行分析，与GC-MS NIST数据库进行匹配获得13个特征峰的定性归属信息，得到特征图谱及其化合物组成的定性信息，分析得到13个特征峰的化学名称、CAS号和分子式等，并生成广藿香油的特征图谱重叠图与对比图。

在特征图谱的重叠图与对比图中，其中13个特征峰中4个主要共有峰为刺蕊草烯、δ-愈创木烯、广藿香醇及广藿香酮，其峰面积总和占比大于70％，其中主要活性成分广藿香醇相对峰面积占比最高，大于30％以上。

更具体而言，根据本公开的一个实施方式，所述的特征图谱的建立方法包括：

(1)内标溶液制备和对照品溶液制备：精密称取142.24mg正十八烷至容量瓶中，加正己烷定容至10mL，摇匀，备用；精密称取市售的广藿香醇对照品6.399mg至容量瓶中，精密加入0.2mL内标溶液，用正己烷定容至2mL；精密称取市售的广藿香酮对照品4.736mg至容量瓶中，精密加入0.2mL内标溶液，用正己烷定容至2mL；

(2)供试品溶液的制备：移取市售样品50μL，分别加入200μL正己烷，摇匀，得供试品溶液；

(3)色谱条件：色谱柱：安捷伦HP-5，30m×0.32mm×0.25μm；程序升温：70℃以2℃/min升至150℃，再以2℃/min升至170℃，再以5℃/min升至230℃，保持11min；检测器：FID；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：He；柱流速：1mL/min；进样量：1μL；分流比：50:1；

(4)分析方法：将不同批次广藿香油GC-FID图谱分别以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，设定S1色谱图为参照色谱图，对保留时间的色谱峰进行多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱。以S1为参照谱进行指纹图匹配，生成了指纹图谱，标定了S1-S5样品的17个共有指纹峰(占总峰面积95％以上)，5个特征峰分离度良好，具有指纹图谱特征且能够较全面的反映广藿香挥发油的质量；对各批广藿香油进行相似度分析，可知S1-S5指纹图谱相似度均大于0.998，表明各批广藿香挥发油在主要成分上没有明显差别。

更具体而言，根据本公开的一个实施方式，利用GC-FID方法，用内标法定量，对广藿香油中的广藿香醇和广藿香酮进行测定即得广藿香醇和广藿香酮得含量，对上述5批广藿香油的含量测定结果进行数据分析，得到广藿香油中广藿香醇与广藿香酮的含量比例范围和优选含量比例。

更具体而言，根据本公开的一个实施方式，其中将所述广藿香油与无水乙醇配制成1:2的广藿香油溶液，羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精按照5:0～5:5的比例混合，用水配成饱和溶液。常温下按照广藿香油与两种环糊精的液固比1:5～1:10投料，将广藿香油溶液慢速滴加到环糊精饱和溶液中，持续搅拌1-2h包合，4℃放置，抽滤去除不溶物，-80℃放置过夜，冷冻干燥，得包合物。

更具体而言，根据本公开的一个实施方式，其中，所述广藿香油干混悬剂以广藿香油为活性成分，由广藿香油和填充剂、助悬剂、表面活性剂、润湿剂和芳香剂制备得到8％～14％的广藿香干混悬剂。所述填充剂为可溶性淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、微晶纤维素中的一种或几种；所述助悬剂为卡波姆940、琼脂、羧甲基纤维素钠、黄原胶中的一种或几种；所述的表面活性剂为吐温80、吐温20、吐温85、司盘20、十二烷基硫酸钠中的一种或几种；所述润湿剂为水。

更具体而言，根据本公开的一个实施方式，其中，所述广藿香油干混悬剂的制备方法包括以下步骤：

(1)辅料过筛：将相关固体辅料粉碎过100目筛；

(2)混合：将处方量的广藿香油及西甲硅油、润湿剂置研钵中，研磨30～45min，然后加入相当于填充剂重量40％～60％的填充剂吸附合均匀后，按等量递加法与剩余填充剂、处方量的助悬剂、表面活性剂和润湿剂混合均匀；

(3)制粒及整粒：加入黏合剂制成软材，过20目筛制粒，置于40～60℃烘箱中干燥2～3h，过20目筛整粒，得广藿香油干混悬剂。

优选的，步骤(2)中的填充剂考虑首选吸附效果较好的可溶性淀粉、糊精、乳糖等中的一种或几种联用。

优选的，步骤(2)中的混悬剂羧甲基纤维素钠与黄原胶联用，比例为3:1时混悬效果较好，为优选比例。

优选的，步骤(2)中表面活性剂考虑选用吐温80、吐温20、吐温85、司盘20中的一种或几种联用。

以下结合具体实施和附图对本申请做进一步阐述。

一、广藿香油的质量检测方法

1.仪器与试剂

1.1仪器

Agilent 7890A-5977A气相色谱质谱联用仪(GC-MS)(安捷伦科技有限公司)，Agilent 7890B气相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，FID检测器，XS205电子天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)，XPR2电子天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2试剂

正己烷(分析纯)国药集团化学试剂有限公司；正十八烷(111636-201804)中国食品药品检定研究院；广藿香醇(5986-55-0，成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98％)；广藿香酮(23800-56-8，中国食品药品检定研究院，纯度≥98％)；市售广藿香油(S1：恒诚香料，20180628；S2：百草香料，20160102；S3：绿源精油，20191006；S4：中香精油，20191025；S5：江西安邦，20190901)

2.实验方法

2.1GC-MS色谱条件

色谱柱：Agilent HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；程序升温：70℃以3℃/min升至150℃，再以2℃/min升至170℃，再以5℃/min升至230℃，保持11min；检测器：MS；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：He；柱流速：1mL/min；进样量：1μL；分流比：50:1；扫描类型：SCAN；SCAN模式分子量范围：50-550。

2.2GC-FID色谱条件

色谱柱：安捷伦HP-5，30m×0.32mm×0.25μm；程序升温：70℃以2℃/min升至150℃，再以2℃/min升至170℃，再以5℃/min升至230℃，保持11min；检测器：FID；进样口温度：230℃；检测器温度：250℃；载气：He；柱流速：1mL/min；进样量：1μL；分流比：50:1；内标法。

3.实验结果分析

3.1特征图谱分析

各批次广藿香油特征图谱与GC-MS NIST数据库进行匹配获得13个特征峰的定性归属信息。其中4个主要共有峰为刺蕊草烯、δ-愈创木烯、广藿香醇及广藿香酮，其峰面积总和占比大于70％，其中主要活性成分广藿香醇相对峰面积占比最高，大于30％以上。

3.2指纹图谱分析

各批次广藿香油GC-FID图谱分别以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，标定了S1-S5样品的17个共有指纹峰(占总峰面积95％以上)，5个特征峰分离度良好，具有指纹图谱特征且能够较全面的反映广藿香挥发油的质量；各批广藿香油指纹图谱相似度均大于0.998，表明各批广藿香挥发油在主要成分上没有明显差别。

3.4含量测定

利用GC-FID测定方法，用内标法定量，得到各批次广藿香油中广藿香醇和广藿香酮的含量及二者的含量比例范围(14:1～35:1)，最优的比例为30:1。

二、广藿香油在制备治疗溃疡性结肠炎药物的应用

以下为本发明的广藿香油、广藿香醇及其自微乳制剂的治疗作用：

1.实验方法

1.1动物分组和给药

本实验动物为雄性C57BL/6小鼠，分组与给药设计见表1。

表1.实验分组设计

注：广藿香醇自微乳中广藿香醇含量为10.0％

1.2造模方法

除正常组外其余各组小鼠采用如下方法造模，先空白饮用水7天，再给予小鼠2％硫酸葡聚糖7天，再饮用日常饮用水14天，以硫酸葡聚糖7天/间歇14天/硫酸葡聚糖7天的处理模式经历3个循环，诱导产生慢性结肠炎。每个循环间隙给予药物治疗。

1.3供试品和对照品配制方法

1.3.1溶媒对照品配制及保存方法

称取所需量的羧甲基纤维素钠，加入灭菌注射用水溶解并定容至终浓度为0.5％。配制后2～8℃保存备用。

1.3.2广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳及柳氮磺吡啶的配制及保存方法

称取或量取所需量的广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳及柳氮磺吡啶，并加入对应所需量配制好的0.5％羧甲基纤维素钠，搅拌，超声，直至混匀，配制后2～8℃保存备用。

1.4给药频率和方式

灌胃给药，每天一次。

1.5药效评价

1.5.1一般情况观察

实验前3天开始称重，标记。硫酸葡聚糖处理组动物给予饮用水配制的2％硫酸葡聚糖溶液7天，约5mL/d/只，每两天换一次硫酸葡聚糖溶液，对照组小鼠正常饮水。在给予硫酸葡聚糖后，每天固定时间称重，观察小鼠有无稀便、血便、体重减轻或食欲减退等症状。便血的严重程度采用双盲法进行半定量作为症状计分(clinical scores)，每天观察、记录二次。计分方法：正常为0分；轻微稀便为1分；水样稀便为2分；浅血+稀便3分；明显便血为4分。

1.5.2小鼠肠道通透性分析

实验结束时每组各取5只小鼠，禁食24h后灌胃给以异硫氰酸荧光素-葡聚糖(100mg/mL在磷酸盐缓冲液中)，剂量为44mg/100g体重。4h后眼眶取血置于微容器SST，收集血清，用等量磷酸盐缓冲液稀释后，取100μL置于96孔板中485nm激发光下检测异硫氰酸荧光素-葡聚糖的量。

1.5.3血清采集和结肠长度检测

实验结束时，摘眼球取血，离心收集血清，保存于-80℃冰箱；采用颈椎脱臼处死小鼠，分离小鼠结肠，用磷酸盐缓冲液润洗，滤纸滤干，测量小鼠结肠长度，并拍照。

1.5.4病理检查及计分

分离部分结肠经10％的福尔马林溶液固定后，石蜡包埋，切片。常规脱腊后，切片经苏木素－伊红染色以便进行病理学分析。光镜观察H&E染色的切片，盲法下对结肠炎及结肠破坏程度进行半定量分级：评分标准如下：①溃疡：分三级，0—无，1—小溃疡(小于3mm)，2—大溃疡(大于3mm)；②炎症：0—无，1—轻度，2—重度；③肉芽组织：0—无，1—有；④病变深度：0—无，1—粘膜下层，2—肌层，3—浆膜层；⑤纤维化：0—无，1—轻度，2—重度。

1.5.5小鼠外周血炎症因子含量

采用达科为公司ELISA检测试剂盒检测小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23的含量，具体步骤按说明书进行。

血清TNF-α的测定方法如下:

1)在冰上用稀释缓冲液R(1X)溶解细胞因子标准品，混匀后静置10min，再用稀释缓冲液R(1X)稀释到500、250、125、62.5、31.3、15.6和7.8pg/mL；

2)根据实验孔(空白和标准品)数量，确定所需的板条数目；

3)稀释样本血清：每个样本吸取30μL血清+70μL稀释缓冲液R(1X)进行稀释；

4)加样：按照100μL/孔加入稀释后的细胞因子标准品，以及100μL/孔加入样本至样本孔，100μL/孔加入稀释缓冲液R(1X)；

5)加相应检测抗体：50μL/孔加入生物素标记的抗体工作液。混匀后，盖上封板膜，37℃温育90min；

6)洗板：扣去孔内液体，300μL/孔加入洗涤缓冲液R(1X)工作液；停留1min后弃去孔内液体。重复4次，每次在滤纸上扣干；

7)加酶：100μL/孔加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液。盖上封板膜，37℃温育30min；

8)洗板：扣去孔内液体，300μL/孔加入洗涤缓冲液R(1X)工作液；停留1min后弃去孔内液体。重复4次，每次在滤纸上扣干；

9)显色：100μL/孔加入1％的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液，37℃避光温育15min，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应；

10)终止反应：100μL/孔迅速加入终止液终止反应；

11)读板：终止反应10min内，用检测波长450nm读值，用校正波长630nm同时读板；

12)结果分析：通过Excel拟合最佳标准曲线，根据样本OD值计算相应浓度。

血清IL-1β、IL-6和IL-17的测定步骤和TNF-α测定步骤相似。

1.5.6小鼠结肠黏膜炎症因子表达变化

取小鼠结肠，经清洗后，分离肠黏膜，将其放入1.5mL EP离心管中，剪碎，加入1mLTrizol溶液，静置3min，提取总mRNA，通过实时荧光定量PCR(q-PCR)，检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23mRNA的表达。

①提取RNA:

1)将小鼠结肠组织进行充分研磨，适量Trizol溶液；

2)加入200μL氯仿；

3)离心后用200μL的移液枪将原来的EP离心管中上层的透明水相吸入到一个新的EP离心管中，大约取出的体积为400-500μL即可；

4)加入异丙醇500μL，沉淀形成；

5)离心，上清去除；75％乙醇，混匀，洗涤沉淀；

6)用200μL移液枪轻轻吸去上层的75％乙醇，室温静置风干5-10分钟，肉眼不能明显看到水分；

7)加入适量经焦碳酸二乙酯处理的水(DEPC-treated water)，用手指敲打以帮助完全溶解；

8)取2μL RNA样品于260nm和280nm处进行读数检测RNA浓度，RNA浓度最优为200-500ng/mL

②逆转录合成cDNA:

实时荧光定量PCR(q-PCR)实验使用的是Yeasen公司所生产的逆转录试剂盒以及严格遵守其操作说明，20μL反应体系，使用实时荧光定量PCR(q-PCR)仪器进行逆转录的基因反应。

反应条件：37℃,15min；85℃,5s；4℃，∞；反应体系见表2。

表2.逆转录反应体系

③实时荧光定量PCR(q-PCR)

1)使用Pubmed Primer Blast设计引物，上海华津生物科技有限公司合成，引物序列见表3。

表3.引物序列

2)参照两步法荧光定量耐热反转录PCR试剂盒(Thermo Scientific SYBR Greenq-PCR)的说明书，按照以下表格所使用的配比制备反应体系，反应在96孔板进行。反应设置的条件是：步骤1:95℃,10min；步骤2：95℃,15s；60℃,60s；40个循环反复，反应体系见表4。

表4.q-PCR反应体系

3)结果处理和分析

聚合酶链式反应反应随着反应延长，后期的DNA产物以指数的速度增长，荧光水平上升，此时就可以根据DNA的指数期的某一个时刻点对最初的cDNA模板进行定量分析。具体办法是，首先规定DNA的指数期的一个荧光阈值，超过阈值后，该时刻反应经历的循环数则被定义为Ct值。所以，通过检测目的基因相对于参比基因的比值，即能够相对地定量出样品中目的基因的含量。

-ΔΔCt＝ΔCt_实验组-ΔCt_对照组

其中ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内参基因

计算2^-ΔΔCt，即是实验组的目的基因表达相对于对照组的目的基因的表达比例。

1.6统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计处理，所有数据均以x±s表示，以单因素方差分析检测差异性，以p<0.05为差异显著。

2.实验结果

2.1广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳对硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用

实验进行中发现，空白组小鼠体重持续增长，饮食饮水正常，精神状态佳，活动频繁，粪便形态未见明显异常；硫酸葡聚糖模型组小鼠体重明显下降，饮食少，食欲差，精神状态萎靡，不喜活动，毛发灰暗无光泽，出现腹泻、肉眼血便、脓便等症状，出现早且严重。如附图1所示，各给药组小鼠稀便和血便情况明显减少，与模型组小鼠相比各项症状得到明显改善(p<0.05；p<0.01；p<0.001)。如附图2所示，相比于模型组，给予广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳后，每组小鼠体重开始出现不同程度的回升。在给药结束时，各给药组小鼠最终体重的差异无统计学意义。广藿香醇自微乳组小鼠便血程度明显低于广藿香醇组(p<0.05)。

2.2广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳减轻硫酸葡聚糖诱导的小鼠溃疡性结肠肠炎的病变程度

解剖后取小鼠结肠，测量每只小鼠结肠长度，如附图3所示，模型组小鼠相比空白组结肠长度明显较短(p<0.001)，而各给药组小鼠结肠长度较模型组均有不同程度的增加(p<0.05或p<0.001)。其中高低剂量的广藿香挥发油组之间小鼠结肠长度无统计学差异，广藿香挥发油低剂量组小鼠结肠长度明显高于广藿香醇组(p<0.05)。广藿香醇自微乳组小鼠结肠长度显著高于广藿香醇组(p<0.001)。不同剂量的广藿香挥发油组与广藿香醇自微乳组小鼠结肠长度相比于柳氮磺吡啶组的差异不具有统计学意义。

对结肠组织的H&E染色，见附图4，结果显示硫酸葡聚糖模型组小鼠结肠黏膜层出现重度炎症细胞浸润，局灶泡沫样组织细胞聚集，局部出现不同程度的坏死，坏死处已有成纤维细胞增生，黏膜肌层组织出现炎症细胞浸润；各给药组小鼠黏膜层炎症有明显的改善，小鼠结肠黏膜结构均有一定程度的恢复，上皮结构较完整，炎症细胞浸润减少，相对模型组情况明显好转(p<0.001)。其中广藿香挥发油低、高剂量组与广藿香醇自微乳组小鼠结肠病变程度相比于柳氮磺吡啶组的差异不具有统计学意义，而广藿香醇组结肠病变较柳氮磺吡啶组明显更为严重(p<0.001)。高低剂量的广藿香挥发油组小鼠结肠病变程度无统计学差异，广藿香挥发油低剂量组小鼠结肠病变程度明显低于广藿香醇组(p<0.05)。而广藿香醇自微乳组小鼠溃疡性结肠炎的病变程度显著低于广藿香醇组(p<0.001)。

2.3广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳对硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠的血清中细胞因子水平的影响

和正常组相比，模型组小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23等炎性细胞因子含量显著增加(p<0.001)；不同剂量的广藿香挥发油以及广藿香醇、广藿香醇自微乳均可显著降低硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23等细胞因子的水平(p<0.001)，如附图5。其中，高低剂量的广藿香挥发油组与广藿香醇自微乳组小鼠血清中炎性细胞因子的含量与柳氮磺吡啶组无统计学差异，而广藿香醇组血清中炎性细胞因子的含量显著高于柳氮磺吡啶组(p<0.001)。高低剂量的广藿香挥发油组血清中细胞因子水平的差异没有统计学意义，广藿香挥发油低剂量组小鼠炎性细胞因子含量明显低于广藿香醇组(p<0.001)。给予广藿香醇自微乳的血清中细胞因子水平显著低于广藿香醇组(p<0.001)。

2.4广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳对硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织炎性因子mRNA表达水平的影响

和正常组相比，模型组小鼠结肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23等mRNA表达水平显著上升(p<0.001)；不同剂量的广藿香挥发油以及广藿香醇、广藿香醇自微乳均可显著降低硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23等mRNA表达水平(p<0.001)，如附图6。其中，广藿香挥发油低剂量组小鼠结肠组织中炎性因子mRNA的表达相比于柳氮磺吡啶组无统计学差异，广藿香挥发油高剂量组TNF-α、IL-1βmRNA的表达显著低于柳氮磺吡啶组(p<0.05)，广藿香挥发油低剂量组TNF-αmRNA的表达明显高于广藿香挥发油高剂量组(p<0.05)。广藿香挥发油低剂量组小鼠炎性细胞因子mRNA表达明显低于广藿香醇组(p<0.01或p<0.01)。广藿香醇自微乳组TNF-α、IL-1β与IL-23mRNA的表达量显著低于柳氮磺吡啶组(p<0.05)，广藿香醇自微乳组炎性因子mRNA表达水平显著低于广藿香醇组(p<0.001)。

2.5广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳对硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道通透性的影响

和正常组相比，模型组小鼠血清中异硫氰酸荧光素-葡聚糖含量显著上升(p<0.001)，提示其肠道通透性增加；不同剂量的广藿香挥发油以及广藿香醇、广藿香醇自微乳均可显著降低硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠小鼠血清中异硫氰酸荧光素-葡聚糖含量(p<0.001)，即降低其肠道通透性，如附图7。其中广藿香醇组小鼠血清中异硫氰酸荧光素-葡聚糖含量显著高于柳氮磺吡啶组(p<0.001)，其他组小鼠血清中异硫氰酸荧光素-葡聚糖含量与柳氮磺吡啶组的无统计学差异。高低剂量的广藿香挥发油组肠道通透性的差异没有统计学意义，广藿香挥发油低剂量组小鼠的肠道通透性显著低于广藿香醇组(p<0.01)。广藿香醇自微乳组小鼠的肠道通透性明显低于广藿香醇组(p<0.001)。

3.结论

广藿香挥发油、广藿香醇、广藿香醇自微乳对硫酸葡聚糖诱导的溃疡性结肠炎小鼠均具有一定的治疗作用，均可减轻硫酸葡聚糖诱导的小鼠溃疡性结肠炎的病变程度，均可降低小鼠的血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23等细胞因子的水平并降低结肠组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-23的mRNA表达水平，均可降低溃疡性结肠炎小鼠的肠道通透性。其中广藿香挥发油对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用与阳性药相当，无明显的剂量依赖关系；广藿香挥发油低剂量的药效优于等量的广藿香醇；广藿香醇自微乳对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用明显优于广藿香醇，考虑主要是由于广藿香醇自微乳提高了广藿香醇口服给药的生物利用度。

三、广藿香油的固化技术

1广藿香油包合物制备技术

将广藿香挥发油与无水乙醇配制成1:2的广藿香油溶液；羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精按照5:(0～5)的比例混合，用水配成饱和溶液。常温下，按照广藿香油：羟丙基-β-环糊精：磺丁基-β-环糊精＝1:5:(0-5)投料比，将广藿香油溶液慢速滴加到环糊精饱和溶液中，持续搅拌1～2h包合，4℃放置，抽滤去除不溶物，-80℃放置过夜，冷冻干燥，得包合物。

2广藿香油干混悬剂制备

2.1制备方法

2.1.1辅料过筛：将相关固体辅料粉碎过100目筛；

2.1.2混合：将处方量的广藿香油及西甲硅油、润湿剂置研钵中，研磨30～45min，然后加入相当于填充剂重量40％～60％的填充剂吸附及混合均匀后，按等量递加法与剩余填充剂、处方量的助悬剂、润湿剂混合均匀；

2.1.3制粒及整粒：加入黏合剂制成软材，过20目筛制粒，置于40～60℃烘箱中干燥2～3h，喷香精，过20目筛整，得广藿香油干混悬剂。

2.1.4制备工艺说明：广藿香油为粘稠的油状液体，流动性差，不易与固体辅料混合均匀，故该干混悬剂的制备工艺中，先用部分填充剂吸附广藿香油，再按等量递加法与剩余的固体辅料搅拌后再过筛混合，然后湿法制粒、整粒。其中，过筛法具有操作简单、耗能少和易于混合均匀的优点。湿法制粒可以减小颗粒的比表面积，减弱自身的吸湿性。

2.2处方筛选

(一)填充剂筛选

固定其他辅料，对常用的填充剂进行筛选，主要包括可溶性淀粉、蔗糖、糊精、乳糖和微晶纤维素等。根据口感、吸附效果、混悬效果等进行筛选，结果见表5。

表5.填充剂筛选结果

结果显示，蔗糖在口感方面较好，但是吸附效果较差，微晶纤维素在混悬效果方面较差，结合广藿香油性质，考虑首选吸附效果较好的可溶性淀粉、糊精、乳糖等中的一种或几种作为广藿香油干混悬剂的填充剂。

(二)助悬剂筛选

固定其他辅料，对常用的助悬剂进行筛选，主要包括卡波姆940、琼脂、黄原胶、羧甲基纤维素钠等，根据其溶解性及助悬效果进行考察，结果见表6。

表6.助悬剂筛选结果

结果显示，卡波姆940与琼脂混悬效果都较差，还原剂混悬效果好，但是溶解慢，羧甲基纤维素钠混悬效果一般，但是溶解性好，因此考虑选用卡波姆940、琼脂、黄原胶、羧甲基纤维素钠中的一种或几种进行筛选。为了考察最佳比例，考虑将黄原胶与其他混悬剂混合使用，进一步筛选考察助悬剂。

(三)混悬剂联用比例筛选

经过上述试验，考虑将混悬剂羧甲基纤维素钠与黄原胶联用，对其使用比例进行筛选，按照羧甲基纤维素钠与黄原胶比例为1:1、3:1、5:1进一步筛选，混悬效果见表7。

表7.混悬剂比例筛选

结果显示当羧甲基纤维素钠与黄原胶比例为3:1混悬效果较好，为优选比例。

(四)表面活性剂筛选

固定其他辅料，对常用的表面活性剂进行筛选，主要包括常用的吐温80、吐温20、吐温85、司盘20、0.5％十二烷基硫酸钠溶液，根据混悬效果及混悬液沉降情况确定稳定性进行考察，筛选结果见表8。

表8.表面活性剂筛选结果

结果显示，吐温80和吐温85效果较好，十二烷基硫酸钠存在一定的气泡，吐温20和司盘20混悬效果一般，所以考虑选用吐温80、吐温20、吐温85、司盘20中的一种或几种作为表面活性剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种广藿香油GC-MS特征图谱的构建方法：

(1)对照品溶液的制备：取1～2mg广藿香醇和广藿香酮对照品，分别加正己烷溶解。

(2)供试品溶液的制备：分别移取市售样品50μL，分别加入200μL正己烷，摇匀，得供试品溶液。

(3)色谱及质谱检测条件见表9：

表9.GC-MS色谱及质谱条件

(4)分析测定：吸取供试品溶液1μL注入气相质谱联用仪，进行GC-MS检测，对于对照品溶液和供试品溶液的色谱和质谱信息进行分析，与GC-MS NIST数据库进行匹配获得13个特征峰的定性归属信息，得到特征图谱及其化合物组成的定性信息，分析得到13个特征峰的化学名称、CAS号和分子式等结果见表10，各批样品均体现13个色谱峰，各样品中除11号峰不同外，其余12个峰的归属都为相同物质，说明各批样品成分基本一致，检出的化合物种类和个数具有较好相似性，其中各批挥发油中广藿香醇相对峰面积占比最高，为30.92％-33.16％。并生成广藿香油的特征图谱重叠图与对比图，分别见附图8和附图9。

表10. 5批广藿香油样品的特征图谱中化合物信息

实施例2

广藿香油GC-FID指纹图谱的检测：

(1)内标溶液制备和对照品溶液制备：精密称取142.24mg正十八烷至容量瓶中，加正己烷定容至10mL，摇匀，备用；精密称取广藿香醇对照品6.399mg至容量瓶中，精密加入0.2mL内标溶液，用正己烷定容至2mL；精密称取广藿香酮对照品4.736mg至容量瓶中，精密加入0.2mL内标溶液，用正己烷定容至2mL。

(2)供试品溶液的制备：移取市售样品50μL，分别加入200μL正己烷，摇匀，得供试品溶液。

(3)色谱条件见表11：

表11.GC-FID法测定的色谱条件

(4)分析检测：

将不同批次样品的GC-FID图谱分别以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，设定S1色谱图为参照色谱图，对保留时间的色谱峰进行多点校正，自动匹配，生成对照指纹图谱，结果见附图10。对5批样品用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，得5批广藿香油指纹图谱的相似度达0.998，表明各批样品在主要成分上没有明显差别，证明广藿香油质量稳定性较好，结果见表12。

表12. 5批广藿香油指纹图谱的相似度

实施例3

广藿香油中广藿香酮和广藿香醇的含量测定：

(1)对照品溶液的制备：分别取1-2mg广藿香酮和广藿香醇对照品，加正己烷溶解。

(2)供试品溶液的制备：移取市售样品50μL，分别加入200μL正己烷，摇匀，得供试品溶液。

(3)色谱条件见实施例2的表11。

(4)分析检测：采用GC-FID法，用内标法进行定量，测定计算即得广藿香春和广藿香酮含量。

(5)广藿香醇和广藿香酮含量测定结果见表13和附图11。

表13.不同批次广藿香油含量测定结果(n＝2)

根据2015版《中国药典》规定，广藿香油中含广藿香醇不得不少于26％，故5批样品均高于药典要求。广藿香醇与广藿香酮的含量范围比例为14:1～35:1；其中，广藿香醇和广藿香酮的优选含量比例为30:1。

实施例5

广藿香油包合物制备：

将广藿香挥发油与无水乙醇配制成1:2的广藿香油溶液，将羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精按照5:0的比例混合，用20mL水配成饱和溶液，常温下，按照广藿香油与两种环糊精的液固比1:8投料比，将广藿香油溶液滴加到环糊精饱和溶液中，持续搅拌1-2h包合，4℃放置，抽滤去除不溶物，-80℃放置过夜，冷冻干燥，得包合物。包合率为73.3％，载药量为12.2％。

实施例6

广藿香油包合物制备：

将广藿香挥发油与无水乙醇配制成1:2的广藿香油溶液，将羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精按照5:3的比例混合，用25mL水配成饱和溶液，常温下按照广藿香油与两种环糊精的液固比1:8投料比，将广藿香油溶液滴加到环糊精中，持续搅拌1.5h包合，4℃放置，抽滤去除不溶物，-80℃放置过夜，冷冻干燥，得包合物。包合率为83.3％，载药量为9.3％。

实施例7

广藿香油包合物制备：

将广藿香挥发油与无水乙醇配制成1:2的广藿香油溶液，将羟丙基-β-环糊精与磺丁基-β-环糊精按照5:5的比例混合，用40mL水配成饱和溶液，常温下按照广藿香油与两种环糊精的液固比1:10投料比，将广藿香油溶液滴加到环糊精中，持续搅拌2h包合，4℃放置，抽滤去除不溶物，-80℃放置过夜，冷冻干燥，得包合物包合率为83.5％，载药量为7.59％。

实施例8

广藿香油干混悬剂制备：

(1)处方：

(2)制备工艺：

辅料过筛：将相关固体辅料粉碎过100目筛；

混合：将处方量的广藿香油及西甲硅油、润湿剂置研钵中，研磨30～45min，然后加入相当于填充剂重量40％～60％的填充剂吸附合均匀后，按等量递加法与剩余填充剂、处方量的助悬剂、润湿剂混合均匀；

制粒及整粒：加入黏合剂制成软材，过20目筛制粒，置于40～60℃烘箱中干燥2～3h，喷香精，过20目筛整粒，得广藿香油干混悬剂。

检查：按照药典制剂通则检查，干燥失重为0.31％，混悬剂沉降比0.98。

实施例9

广藿香油干混悬剂的制备：

(1)处方：

(2)制备工艺：

辅料过筛：将相关固体辅料粉碎过100目筛；

混合：将处方量的广藿香油及西甲硅油、润湿剂置研钵中，研磨30～45min，然后加入相当于填充剂重量40％～60％的填充剂吸附合均匀后，按等量递加法与剩余填充剂、处方量的助悬剂、润湿剂混合均匀；

制粒及整粒：加入黏合剂制成软材，过20目筛制粒，置于40～60℃烘箱中干燥2～3h，过20目筛整粒，得广藿香油干混悬剂。

2.4检查：按照药典制剂通则检查，干燥失重为0.54％，混悬剂沉降比0.93。

实施例10

广藿香干混悬剂的制备：

(1)处方：

(2)制备工艺：

辅料过筛：将相关固体辅料粉碎过100目筛；

混合：将处方量的广藿香油及西甲硅油、润湿剂置研钵中，研磨30～45min，然后加入相当于填充剂重量40％～60％的填充剂吸附合均匀后，按等量递加法与剩余填充剂、处方量的助悬剂、润湿剂混合均匀；

制粒及整粒：加入黏合剂制成软材，过20目筛制粒，置于40～60℃烘箱中干燥2～3h，过20目筛整粒，得广藿香油干混悬剂。

检查：按照药典制剂通则检查，干燥失重为0.58％，混悬剂沉降比0.96。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。