模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料及其制备方法和应用 (Nano material for simulating natural killer cells to efficiently treat intracellular bacteria and preparation method and application thereof ) 是由 葛敏 林翰 施剑林 于 2021-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料及其制备方法和应用。所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料包括作为载体的、双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅以及负载于所述载体的孔道中的蛋白酶；所述蛋白酶优选为穿孔素和/或颗粒酶。所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料以双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅作为载体,在胞内菌模型具备的特异性氧化还原电位下响应性降解释放蛋白酶,不仅因其在正常细胞中几乎不降解而能够规避对正常细胞的杀伤,而且可以通过特异性响应释放以模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌从而实现对感染细胞的杀菌治疗,并进一步引起生物体自发的免疫调节机制来促进高效的抗菌抗感染应用。(The invention discloses a nano material for simulating natural killer cells to efficiently treat intracellular bacteria, and a preparation method and application thereof. The nano material for simulating natural killer cells to efficiently treat intracellular bacteria comprises dendritic mesoporous silica which is used as a carrier and doped with disulfide bonds and protease loaded in a pore channel of the carrier; the protease is preferably perforin and/or granzyme. The nano material for simulating the natural killer cells to efficiently treat the intracellular bacteria takes the dendritic mesoporous silica doped with disulfide bonds as a carrier, and the protease is degraded and released in a response manner under a specific oxidation-reduction potential possessed by an intracellular bacteria model, so that the protease not only can avoid killing the normal cells because the protease is hardly degraded in the normal cells, but also can simulate the natural killer cells to efficiently treat the intracellular bacteria through the specific response release so as to realize the sterilization treatment on infected cells, and further cause a spontaneous immune regulation mechanism of organisms to promote efficient antibacterial and anti-infection application.)
技术领域
本发明属于有机无机杂化介孔分子材料
技术领域
，具体涉及一种模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料及其制备方法和应用。背景技术
穿孔素和颗粒酶是存在于细胞毒性T淋巴(CTL)细胞和自然杀伤(NK)细胞内的糖蛋白。研究发现当细胞受到病毒侵袭或转化为癌细胞时，效应细胞与靶细胞接触，通过穿孔素在靶细胞膜上形成活性孔道，并向靶细胞内释放颗粒酶，诱导靶细胞裂解死亡。这一免疫激活的调控通路得到证实(Immunol.Today 1991,12,(11),415-419；Cell.1991,64,(6),1175-1181)。但许多类型的细胞不表达穿孔素或不形成免疫突触，且在体内免疫中激活的NK细胞释放穿孔素和颗粒酶的量比较少。另外，研究者发现穿孔素和颗粒酶的作用效果很大程度依赖于细胞所处的环境(Immunol.Today 2000,21,(6),254-256)。因此如何安全地实现对穿孔素和颗粒酶的可控释放从而使类NK细胞对胞内菌进行有效杀伤是一个亟待解决的重大科学问题。
为此学者设计了各种激活免疫系统的方式，试图通过外界药物刺激将NK细胞活化从而释放穿孔素和颗粒酶实现主动靶向。如2007年研究员发现颗粒酶H辅助颗粒酶B杀死感染了腺病毒的细胞，通过对颗粒酶H的可控调节来对感染的腺病毒细胞进行杀伤(TrendsImmunol.2007,28,(9),373-375)。但是，目前还没有关于模拟构建人工自然杀伤纳米材料体系的报道。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料及其制备方法和应用。所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料以双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅作为载体，在胞内菌模型具备的特异性氧化还原电位下响应性降解释放蛋白酶，不仅因其在正常细胞中几乎不降解而能够规避对正常细胞的杀伤，而且可以通过特异性响应释放以模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌从而实现对感染细胞的杀菌治疗，并进一步引起生物体自发的免疫调节机制来促进高效的抗菌抗感染应用。
第一方面，本发明提供一种模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料。所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料包括作为载体的、双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅(Dendritic Mesoporous Organosilica Nanoparticles，DMON)以及负载于所述载体的孔道中的蛋白酶。作为优选，所述蛋白酶为糖蛋白。更优选地，所述蛋白酶为穿孔素和/或颗粒酶。
本发明通过在树枝状介孔二氧化硅骨架中掺杂双硫键，在胞内菌特有的表面氧化还原电位条件下发生骨架的坍塌降解，从而对负载的纳米蛋白酶实现高效特异性释放，起到杀伤胞内菌的治疗效果。此外，被纳米蛋白酶杀死的胞内菌破裂所产生的细菌碎片作为机体内的抗原激起机体的体液免疫和细胞免疫，细胞免疫的激活可以进一步放大对胞内菌的杀伤，实现良性循环从而高效杀伤胞内菌。
较佳地，所述树枝状介孔二氧化硅具有孔径在25-30nm之间的大孔径。该孔径突破了原有小孔径二氧化硅体系只能负载小分子药物的局限，实现了对较大尺寸的纳米蛋白酶(粒径通常在8-16nm)的负载。
较佳地，双硫键占树枝状介孔二氧化硅的摩尔比例为2-5％，优选为3-4％。将上述比例控制在该范围内，有利于实现树枝状结构的构建及响应性降解。
较佳地，蛋白酶占模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料的质量百分比为2.5-10％，优选为6-8％，更优选为4.5-5.5％。此时能够充分发挥载体的负载能力同时利用合适的药物(蛋白酶)浓度进行胞内菌杀伤。
较佳地，所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料在负载蛋白酶的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅的表面修饰甲氧基硅烷聚乙二醇。甲氧基硅烷聚乙二醇(mPEG-Silane)的修饰改性可以提高无机纳米载体在体内的生物安全性，在高效负载纳米蛋白酶的同时实现良好的生物相容性和体内循环响应。
第二方面，本发明提供上述任一项所述的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：
(1)以表面活性剂为结构导向剂，以碱为催化剂，以正硅酸乙酯和含有双硫键的有机硅作为前驱体，通过溶胶凝胶反应合成双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅；
(2)以步骤(1)合成的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅作为载体，在载体的孔道中负载蛋白酶，得到所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料。
本发明的的制备方法简便可行、产量高、效率高、无污染、成本低，得到的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料形貌规则、孔径可控、孔容大、环境响应性好，有利于纳米蛋白酶在胞内菌感染部位的可控释放和高效作用，具有优异的缓解和治疗效果，有望用于制备治疗胞内菌感染的药物体系。
较佳地，所述表面活性剂为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或者嵌段共聚物表面活性剂中的至少一种；所述碱催化剂为氢氧化钠、氨水、三乙醇胺、水杨酸钠、碳酸钠中的至少一种；所述含有双硫键的有机硅为双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物和/或双(三乙氧基甲硅烷基丙基)二硫化物。
较佳地，所述制备方法还包括：将负载蛋白酶的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅和甲氧基硅烷聚乙二醇在醇溶液中搅拌混合。
第三方面，本发明提供上述任一项所述的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料在杀菌方面的应用。
附图说明
图1为本发明的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料的制备流程图；
图2是实施例1合成的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅在不同标尺下的TEM图，(A)为1μm，(B)为100nm，(C)为500nm；
图3是单分散的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒的元素分布图和能谱分析图(包括O元素、Si元素和S元素的能谱分析图)；
图4是双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅在还原性谷胱甘肽环境中响应性降解2h、24h和48h的TEM图；
图5是双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅的N2吸附-脱附等温线，插图为双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅的孔径分布曲线；
图6是对照组、实验组1和实验组2的细菌菌落的生长状态测试结果。
具体实施方式
通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。在没有特殊说明的情况下，各百分含量指质量百分含量。
本公开提供一种模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料，包括作为载体的、双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅(也可以称为“树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅”)以及负载于所述载体的孔道中的蛋白酶。
由于双硫键掺杂于树枝状介孔二氧化硅的骨架中，所以双硫键的掺杂并不影响树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅的物理参数。双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅保持了树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒的形貌，适合作为良好的蛋白酶载体。双硫键均匀分布在树枝状介孔二氧化硅的骨架上，在到达胞内菌感染部位后可以更好响应性降解从而实现蛋白酶的可控释放。一些实施方式中，树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅纳米颗粒为具有树枝状孔的球形形貌。其中，树枝状孔的孔径可为10-30nm，优选为具有孔径在25-30nm之间的大孔径。
另外，树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径可为220-280nm，比表面积为300-550m2/g，孔容为0.6-1.8m2/g。
本发明选择树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅纳米颗粒作为载体：其一，树枝状载体的特殊设计突破了原有小孔径二氧化硅体系负载大分析药物的应用局限。具体来说，常规小分子药物可以使用小孔径二氧化硅负载，但是纳米蛋白酶的大分子结构使其负载所需要的孔径远大于其他介孔二氧化硅，故具备树枝状骨架的树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅纳米颗粒能够提供负载纳米蛋白酶的大孔径。其二，该载体把双硫键掺杂到树枝状介孔氧化硅的骨架中，能在胞内菌高氧化还原电位作用下骨架坍塌降解，克服表面修饰双硫键对载体骨架材料的降解有限的缺点。以上说明本发明的树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅具有特异性响应、大孔径、高比表面积、形貌均一、可安全生物降解的特点，利于模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料的构建。
纳米蛋白酶负载于掺杂双硫键的树枝状介孔二氧化硅的孔道内。由于掺杂双硫键的树枝状介孔二氧化硅的孔径大于纳米蛋白酶的尺寸，因此蛋白酶能够通过物理吸附作用进行负载。胞内菌这一特异性的疾病模型存在具有高氧化还原电位的生物微环境。响应优选为GSH和H2O2双响应。树枝状介孔二氧化硅骨架中掺杂的双硫键在H2O2氧化作用下断裂形成-SOOH键，在GSH(谷胱甘肽)还原作用下断裂形成-SH键，由此介孔二氧化硅纳米粒子由于骨架中双硫键的断键发生破裂，位于孔道中的纳米蛋白酶被释放出载体材料外。当负载的蛋白酶是穿孔素和颗粒酶时，穿孔素在细胞膜表面打孔介导颗粒酶对胞内细菌进行有效杀伤，解决了机体自身免疫系统或常规抗菌药物不能对藏匿于细胞内的细菌(胞内菌)进行识别和杀伤的重要问题。而且所述纳米蛋白酶载体材料在实现胞内菌杀伤的过程中能够有效引起机体的免疫调节从而加快病菌的杀伤和炎症感染部位的愈合。
所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料还可以在负载蛋白酶的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅的表面修饰甲氧基硅烷聚乙二醇。修饰甲氧基硅烷聚乙二醇的主要作用是改善纳米材料的生物相容性。同时甲氧基硅烷基团和二氧化硅体系具有较好的一致性，能够减少其他基团的引入。
以下结合图1示例性本发明所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料的制备方法。在此公开的制备方法便捷易行、操作条件精确可控。
首先制备树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅。例如，以表面活性剂为结构导向剂，以碱催化剂，以正硅酸乙酯(TEOS)和含有双硫键的双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物(BTEE)作为前驱体，通过溶胶-凝胶法合成树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅。此时双硫键均匀掺杂于树枝状介孔二氧化硅的骨架中。溶胶凝胶反应温度可为75-85℃，反应时间可为9-15h。该工艺能够对现有的小孔径(小于5nm)介孔二氧化硅的制备工艺进行改良从而制备孔径在25-30nm之间的树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅。
所述表面活性剂可为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或者嵌段共聚物表面活性剂，包括但不限于十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和/或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。碱催化剂包括但不限于氢氧化钠、氨水、三乙醇胺(TEA)、水杨酸钠(NaSal)、碳酸钠中的至少一种。
一些实施方式中，将TEA溶解在水中并在80℃搅拌混合0.5h，然后加入CTAB和NaSal在80℃搅拌1h，随后向溶液中加入TEOS和BTEE，继续反应过夜，反应完成后冷却。通过高速离心收集产物，并用乙醇洗涤以除去残留的反应物。将收集的产物在60℃下用硝酸铵的乙醇溶液萃取以除去表面活性剂，在室温下真空干燥过夜，得到树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅。
在上述反应过程中，TEOS与BTEE的体积比为3：2～4：5。合适的硅源比例有助于制备得到形貌规则的掺杂双硫键的树枝状二氧化硅，否则可能造成骨架坍塌或双硫键掺杂失败。一些示例中，TEOS与BTEE的体积比为6：5，7：6，最优为1：1。此外，CTAB、TEA和NaSal的质量比可为5：1：2～7：1：4。
在树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅上负载蛋白酶。蛋白酶的种类可根据需要进行适应性变化，优选纳米级蛋白酶。更优选地，在树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅上负载穿孔素和/或颗粒酶。穿孔素和颗粒酶的质量比优选为4：3-4：5。此时获得的纳米材料能够模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌(CAR-NK)治疗理念，掺杂双硫键的树枝状介孔二氧化硅在生物体胞内菌感染部位特异性降解释放穿孔素和颗粒酶(模拟NK细胞释放穿孔素和颗粒酶)，穿孔素对在细胞膜上打孔从而介导颗粒酶进入细胞内对胞内菌进行杀伤，解决了常规抗生素不能杀伤胞内菌的问题。而且，该纳米材料能够在有效实现胞内菌杀伤的过程中引起机体的自发免疫调节机制起到高效协同的抗菌抗感染效果。
负载蛋白酶的方式并非本发明的创新点所在，采用本领域常用的负载方式即可。一些实施方式中，将树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅和蛋白酶在极性溶剂中搅拌即可。极性溶剂采用本领域常用的极性溶剂，优选为水。搅拌时间可为12-24h。
一些实施方式中，将树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅分散于蛋白酶溶液中并进行搅拌。作为示例，蛋白酶溶液中穿孔素和颗粒酶的浓度可为20-40U/mL。搅拌温度可为室温或者低温冰水浴。
还可以对负载蛋白酶的树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅(双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅)表面修饰甲氧基硅烷聚乙二醇(mPEG-Silane)。修饰方法可以是将负载蛋白酶的双硫键掺杂树枝状介孔二氧化硅与甲氧基硅烷聚乙二醇(mPEG-Silane)在醇溶液中搅拌。这样mPEG-Silane通过共价键结合的方式修饰在负载蛋白酶的双硫键掺杂树枝状介孔二氧化硅表面。甲氧基硅烷聚乙二醇的分子量可为1000-10000。一些实施方式中，树枝状有机无机杂化介孔二氧化硅与mPEG-Silane的质量比可为2：(5～11)，例如2：7、2：9等。此时可以得到较好的表面修饰效果。搅拌温度可为20-30℃，优选25℃。搅拌时间可为15-48小时，优选30小时。
本发明公开的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料可以通过调控NK细胞释放的穿孔素和颗粒酶，提供一种实现高效可控治疗病菌感染、炎症以及组织愈合的新途径。模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料可以同时负载穿孔素和颗粒酶，并在胞内菌的高还原电位环境下发生特异性的响应降解，释放穿孔素和颗粒酶，实现细胞膜表面打孔及细胞内的细菌杀伤治疗。而且，所述模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料在有效杀伤胞内菌实现抗感染的同时，激起生物体的自发免疫从而大大提升治疗效果，并且免疫记忆使得机体抵抗力大幅上升。这种模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料在杀伤胞内菌抗感染的CAR-NK疗法及协同免疫方面的应用中有优异且广阔的应用前景。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
步骤(1)制备双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅。70mg TEA、400mg CTAB和200mgNaSal溶解在25mL去离子水中，混合均匀并在80℃水浴搅拌1.5小时，然后向溶液中加入2mLTEOS和2mL BTEE，继续反应12小时，随后冷却，以12000r/min离心30min收集粗产品。粗产品使用水和乙醇离心洗涤各2遍，将洗涤后的粗产品分散于8mg/mL的硝酸铵的乙醇溶液，回流过夜，离心，收集产物后继续用乙醇洗涤。为了充分除去CTAB表面活性剂，重复硝酸铵的乙醇回流和洗涤步骤各3次。
步骤(2)负载穿孔素和颗粒酶。将10mg双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒分散于3mL纳米蛋白酶水溶液中。该水溶液中穿孔素和颗粒酶的浓度均为30U/mL。所述溶液在低温(2-5℃)搅拌6h后离心冲洗，收集产物，得到负载蛋白酶的、双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅。
步骤(3)PEG表面修饰。将10mL步骤(2)的产物即负载纳米蛋白酶的、双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅加入到100mL乙醇，随后加入50mg甲氧基硅烷聚乙二醇，常温搅拌3h后，离心冲洗，得到最终产物。
图2是双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒于超声后在铜网碳膜上的TEM分布图。双硫键掺杂的介孔二氧化硅分散性良好，呈现球形树枝状结构，尺寸均一，形貌规则。
图3是单分散的双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒的元素分布图和能谱分析图。硫元素成功掺杂在树枝状介孔二氧化硅的骨架中。
降解性测试：将双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅纳米颗粒加入到10mM的GSH溶液中，在20-30℃的环境中搅拌2h、12h、24h、48h，将得到的降解产物在TEM下观察形貌结构的变化。图4可以看出随着降解时间的延长，树枝状骨架结构发生塌陷，骨架载体的孔道打开，从而可以实现纳米蛋白酶的良好释放效果。这说明双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅具有优异的时间依赖降解性和特异响应降解性。时间依赖的降解性是指随着时间的延长，双硫键掺杂的树枝状介孔氧化硅坍塌程度增加，逐渐成为破碎的结构。特异响应降解性是使用GSH模拟生物体体内胞内菌所具有的特异性微环境，即能响应胞内菌的微环境降解，在其他微环境中则基本不发生降解。本发明的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料能够模拟NK细胞的选择性杀伤细菌的特异性，且随着时间的推移可控释放纳米蛋白酶，不仅起到药物缓释的作用，而且能够通过纳米蛋白酶释放实现良好的抗菌效果。
图5是将双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅进行N2吸附-脱附等温线和孔径分布图。可以看出双硫键掺杂的树枝状介孔二氧化硅具有较大孔径，树枝状孔洞的粒径在25-30nm之间，满足负载纳米蛋白酶(尺寸约10nm)的空间条件，适合作为高效负载酶类物质的载体。
抗菌实验：将革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌在37℃的羊血琼脂平板(羊血的体积百分比为5-7％)上生长过夜。挑出菌株的单个菌落，在37℃下于4mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中培养过夜。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬浮液连续稀释10倍，在胰酪大豆胨液体培养基中获得浓度1×106CFUs mL-1的菌液。用PBS将金黄色葡萄球菌稀释至浓度1×107CFU mL-1。通过扩展板菌落计数法进行抗菌活性实验。实验组2是将模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料加入浓度1×106CFU mL-1的菌液中培养12-48h，模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料的加入浓度为10-200μg mL-1。实验组1是将模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料替换为蛋白酶，该蛋白酶的加入量和实验组2的纳米材料中负载的蛋白酶种类和含量完全一致。对照组作为空白样，相较于实验组2的区别是不加入模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料。抗菌试验结果表明本发明的模拟自然杀伤细胞高效治疗胞内菌用纳米材料能够对细菌菌落进行有效杀伤。