阅读说明：本技术 一种水凝胶微粒及其制备方法 (Hydrogel particle and preparation method thereof ) 是由 刘杨 杨宇 陈胜勤 于 2020-02-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种水凝胶微粒及其制备方法。制备方法包括步骤：1)制备羧甲基-β-环糊精溶液；2)制备羧甲基壳聚糖溶液；3)制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒。通过羧甲基-β-环糊精和羧甲基壳聚糖进行接枝交联得到的水凝胶微粒,主要使用到羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖两种原材料,且两种原材料便宜易得,避免了高成本原料的使用；其制备步骤简洁,制备过程安全、易操作；水凝胶微粒几乎无细胞毒性,生物相容性良好,能够口服灌胃,无任何毒副作用,且负载胰岛素后缓释效果良好,能避免胃酸及胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解,可控制药物的释放和延长药物疗效及保持药物活性不变,提高口服胰岛素类蛋白药物的生物利用度。(The invention discloses a hydrogel particle and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the steps of 1) preparing carboxymethyl- β -cyclodextrin solution, 2) preparing carboxymethyl chitosan solution, and 3) preparing carboxymethyl- β -cyclodextrin grafted carboxymethyl chitosan hydrogel particle, wherein the carboxymethyl- β -cyclodextrin and carboxymethyl chitosan are grafted and crosslinked to obtain the hydrogel particle, two raw materials of carboxymethyl- β -cyclodextrin and carboxymethyl chitosan are mainly used, the two raw materials are cheap and easy to obtain, the use of the raw materials is avoided, the preparation steps are simple, the preparation process is safe and easy to operate, the hydrogel particle almost has no cytotoxicity and good biocompatibility, can be orally perfused into a stomach, has no toxic or side effect, has good sustained release effect after loading insulin, can avoid the damage and degradation of the insulin by gastric acid and pepsin, can control the release of a medicament, prolong the curative effect of the medicament, keep the activity of the medicament unchanged, and improve the bioavailability of an oral insulin-like protein medicament.)

一种水凝胶微粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种羧甲基-β-环糊精 接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒，以及制备该水凝胶微粒的方法。

背景技术

糖尿病是现代人们生活中最常见的慢性疾病之一且很难根治，一 直以来胰岛素为主要的治疗方式。但长期针剂注射容易引起过敏、低 血糖、感染及皮下脂肪萎缩等副作用，这给需要终生用药的糖尿病患 者带来很多困扰及不便。口服给药方便合理、易于被患者接受，因此 口服胰岛素无疑是较理想且最好的治疗方式。目前，口服胰岛素类蛋 白给药需要克服生理障碍、酶障碍及物理化学稳定性等问题，因此需 要借助生物相容性好、无细胞毒性的载体材料将胰岛素制成缓控释制 剂，这样不仅可避免胃酸及胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，提高胰岛 素的生物利用度，还可以延缓胰岛素在体内的作用时间，减少给药次 数。

多糖具有高度的稳定性、安全性、无毒性、亲水性、生物可降解 性等优点，而且来源广泛、成本低。多糖水凝胶是多糖利用的一个重 要方面，可用作缓释载体，显示出十分广阔的应用前景。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖的水溶性衍生物，具有良好的生物相容 性、成膜性、吸附性、亲水性、可修饰性以及低生理毒性，储存丰富、 价格低廉，壳聚糖对胰岛素的包裹以及优良靶向性，可使壳聚糖胰岛 素材料在一定程度上避免消化道蛋白酶对胰岛素的分解。羧甲基-β- 环糊精具有疏水空腔生成包络物的能力，在pH较低的溶液中溶解度 低，但在中、碱性溶液中，由于羧基解离，可以任意浓度溶解，而且 其结构疏松，自流动性明显改善。故在人体肠道pH6-7的环境中具有 很好的溶解性，可提高药物的稳定性和生物利用度，用于药物的缓释 和改善剂型。

发明内容

本发明公开了一种用作口服胰岛素的载体的水凝胶微粒，其具有 多孔结构和非晶型结构，热稳定性能良好，缓释性能良好；且有较好 的生物相容性，能有效包载胰岛素药物和抵抗胃酸的破坏作用并保护 胃粘膜不受药物的刺激，从而控制药物的释放和延长药物疗效及保持 药物活性。

一种水凝胶微粒的制备方法，主要包括以下步骤：

1)制备羧甲基-β-环糊精溶液：取羧甲基-β-环糊精溶解于去离子 水中，制得羧甲基环糊精溶液；

2)制备羧甲基壳聚糖溶液：取羧甲基壳聚糖溶解于去离子水中， 制得羧甲基壳聚糖溶液；

3)制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒：将羧甲 基-β-环糊精溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合，再加适量的1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺进行接枝交联， 在25℃下充分搅拌24小时，得到接枝产物溶液；接枝产物溶液用甲 醇沉淀，过滤得沉淀物；用蒸馏水溶胀沉淀物，再用去离子水透析， 最后用甲醇沉淀，冷冻干燥，过20目筛，收集获得固体颗粒状水凝 胶。

其中，羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为 3.3:17:19.2:19.2。

进一步，每克羧甲基-β-环糊精溶解于20mL去离子水。每克羧 甲基壳聚糖溶解于25mL去离子水。优选地，所述羧甲基-β-环糊精 纯度≥99.3％，所述羧甲基壳聚糖的羧化度≥80％。

进一步，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量 为3.68g。所述N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量为2.21g。

上述制备所得羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒可 用于胰岛素的包埋及口服递送。羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖 水凝胶微粒具有多孔结构，属于非晶型结构。多孔结构有利于水分子 的渗透和药物分子的贮存保留。结构特征表明其溶胀性能良好，热稳 定性能良好；羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒包埋胰 岛素后，经模拟人体胃肠道环境，载胰岛素水凝胶微粒可避免胃酸及 胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，且保持胰岛素的生物活性不变。不同 浓度的水凝胶溶液(12.5、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL) 培养的细胞存活率均达96％以上，无细胞毒性作用；糖尿病小鼠经口 服载胰岛素凝胶微粒(50、75、100IU/kg)，可维持6-10h的低血糖 水平，载胰岛素水凝胶微粒对2型糖尿病小鼠模型具有良好且较持久 的降血糖活性效果。

与现有技术相比，本发明通过羧甲基-β-环糊精和羧甲基壳聚糖进 行接枝交联得到的水凝胶微粒，主要具有以下优势：

(a)本发明主要使用到羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖两种原 材料，且两种原材料便宜易得，避免了高成本原料的使用，具有经济 合理性，节约成本。

(b)本发明的水凝胶微粒，制备步骤简洁，制备过程安全、易 操作。

(c)本发明的水凝胶微粒几乎无细胞毒性，生物相容性良好， 能够口服灌胃，无任何毒副作用，可广泛用于口服递送药物。

(d)本发明的水凝胶微粒，负载胰岛素后缓释效果良好，能避 免胃酸及胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，可控制药物的释放和延长药 物疗效及保持药物活性不变，提高口服胰岛素类蛋白药物的生物利用 度。

附图说明

图1是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒制备工艺流 程图；

图2是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的傅里叶红 外分析图；

图3是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的X射线单 晶衍射图；

图4是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的扫描电镜 图；

图5是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的热重分析 图；

图6是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的溶胀率 图；

图7是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒负载胰岛素 后的累积释药曲线图；

图8是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒释放胰岛素 后的荧光光谱图；

图9是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒释放胰岛素 后的圆二色谱图；

图10是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的细胞毒 性图；

图11是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒负载胰岛 素后的降血糖活性效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图 对本发明作进一步地详细描述。

实施例1，制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒。

工艺流程如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)制备羧甲基-β-环糊精溶液：称取4.0g羧甲基-β-环糊精溶解 于80mL去离子水中，制得羧甲基-β-环糊精溶液；

(2)制备羧甲基壳聚糖溶液：称取4.0g羧甲基壳聚糖溶解于100 mL去离子水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；

(3)制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒：将羧 甲基壳聚糖溶液和羧甲基-β-环糊精溶液混合，再加3.68g的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2.21g的N-N-羟基琥珀酰亚胺进 行接枝交联，在25℃下充分搅拌24小时，得到接枝产物溶液；接枝 产物溶液用甲醇沉淀，过滤得沉淀物；用蒸馏水溶胀沉淀物，再用去 离子水透析，最后用甲醇沉淀，冷冻干燥，过20目筛，收集获得固体 颗粒状水凝胶。

实施例2，结构表征测定。

傅里叶红外光谱检测：分别将羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖与 少量KBr混合研磨均匀，压成薄片。冷冻干燥后的凝胶样品借助ATR 附件，通过傅里叶红外光谱在波长500～4000cm^-1范围进行扫描。

羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的表征如下图所 示，其中，如图2所示，三者在3400cm^-1位置的峰均归属为OH基团振 动。羧甲基-β-环糊精在2930、1601、1420cm^-1处的吸收峰分别归属 为羧甲基脂肪族CH₂基团的不对称伸缩振动、羧酸盐基团C＝O的不对 称伸缩振动和对称伸缩振动。在羧甲基壳聚糖谱图中，在1597、1414 cm^-1处有与羧甲基-β-环糊精共同的吸收峰，为羧酸盐基团C＝O的不对 称伸缩振动和对称伸缩振动，而在2875cm^-1波段处的吸收峰归属为乙 酰氨基团的对称CH₃振动。在羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝 胶微粒谱图中显示出强度高达1634cm^-1的典型酰胺I带，该迹象表明 在羧甲基壳聚糖和羧甲基-β-环糊精之间发生了成功的酰胺化交联。 此外，由于α(1→4)吡喃葡萄糖环的振动，羧甲基-β-环糊精显示在 946cm^-1波段处有吸收峰，且在水凝胶制备过程中通过羧甲基-β-环糊 精的加入，水凝胶微粒在894cm^-1处有更强的吸收峰，表明羧甲基-β-环糊精通过羧甲基壳聚糖的氨基和羧甲基-β-环糊精的羧甲基之间的 酰胺键作用，促使羧甲基-β-环糊精接枝到了羧甲基壳聚糖上，因此 接枝成功。

X射线单晶衍射仪检测：将冷冻干燥的凝胶样品研碎；分别将凝 胶粉末，羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖置于样品池中，通过X射线 单晶衍射仪检测；参数如下：放射源Cu-Kα(λ＝0.154nm)，工作电压、 工作电流分别为40KV和40mA，衍射角度10°到45°。

如图3所示，羧甲基-β-环糊精的晶面特征衍射吸收峰，其峰强度 较强、峰形较好，说明其结构规整，晶型较好。羧甲基壳聚糖的X射 线单晶衍射光谱显示出，在反射角2θ值为20°处，由于羟基分子氢键 造成的晶体特点的结晶形态。而羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖 水凝胶微粒的X射线单晶衍射图，反射角2θ值为20°处表现出宽的单峰 模式，与羧甲基壳聚糖相比，表现为结晶度降低，吸收峰有所减弱， 显示为更多的是无定形态。因此，接枝完成，X射线单晶衍射结果也 与红外谱图的结果相一致。

扫描电镜检测：将羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒 进行冷冻干燥，冻干后的凝胶样品贴在导电胶上，真空环境下喷金20 min。通过10KV电压下的扫描电镜观察其截面微观结构。

图4是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的扫描电镜 图，不同倍数下观察到凝胶截面均有较多的孔隙，具有不规则疏松多 孔结构。

热重分析检测：将冻干后的水凝胶微粒进行热重分析仪检测；样 品置于密封的铝质样品篮中，在氮气中以10℃/min的升温速率从 25℃加热至600℃。

图5是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的热重分析 图，水凝胶在100℃前主要为水分的流失，200-600℃为官能团的化 学降解，羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒分解时间相 比羧甲基-β-环糊精和羧甲基壳聚糖发生更早，表明凝胶微粒的热稳 定性能更好。

实施例3，理化性能测定指标评定。

溶胀实验：取一定质量(W₀)的冷冻水凝胶放置在5mL的pH＝1.2 的0.1M HCl溶液和pH＝6.8、pH＝7.4的0.1％(w/v)PBS磷酸盐溶液中， 并在37℃、100rpm下震荡2h。分别在30、60、90、120min时轻轻 用滤纸吸收去除多余的液体的表面,并且称重(W_t)。溶胀率用以下公 式计算，绘制溶胀率随时间的变化曲线。

溶胀率：SR＝(W_t-W₀)/W₀×100％

结果阐明了羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的理 化性质，其中，图6表明在不同的pH条件下水凝胶微粒的溶胀率均较 高，具备优良的溶胀性能。水凝胶微粒既可吸收大量的水分子，也利 于药物的大量贮存。

载药实验：取一定质量的冷冻水凝胶浸入到5mg/mL的胰岛素盐 酸溶液中，于37℃、100r/min条件下恒温振荡进行吸附载药，中间 每隔一段时间取样测定溶液的吸光度，直至溶液的吸光度不变为止， 使水凝胶达到溶胀和吸附平衡，然后取出水凝胶常温真空干燥即可， 并用紫外分光光度计测定吸附前后溶液的吸光度值，由标准曲线法算 出其中的浓度，计算水凝胶的载药量。载药率按如下公式计算：

载药率：Q＝[V×(C₀-C_e)]/W×100％

体外释药性能测定：将达到吸附和溶胀平衡的水凝胶室温晾干至 恒重后，称重并置于锥形瓶中，模拟胃肠道pH值的变化，先将载胰 岛素水凝胶微粒放入pH1.2的HCl溶液中，在37℃恒温培养振荡器中 100r/min条件下恒温连续振荡释放药物2h，然后放入释放介质为pH 值为6.8的PBS中，继续在37℃条件下释放药物2h，最后放入释放介 质为pH值为7.4的PBS中，继续在37℃条件下释放药物3h，每隔0.5 小时用移液管移取2mL缓释液，，并补充新鲜的2mL相应体积的模拟 胃肠道缓释介质，通过紫外分光光度计分别以各自的空白作参比，测 定药物的吸光度值，得到药物的含量，绘制累积药物释放曲线。累计 释药率按如下公式计算得到，绘制释药曲线。

释药率：

图7表明在前两小时模拟胃液环境内凝胶微粒没有明显的突释现 象，释放率仅8％，而在模拟肠道环境释放率显著增加至55％至70％， 并实现可持续释放。因此，水凝胶对胰岛素有良好的控释和缓释性能， 可避免胰岛素受胃液的分解，而在肠道pH环境下释放时间更长、更 稳定，有利于胰岛素被人体肠道吸收。

胰岛素生物活性测定：将胰岛素标准溶液和载胰岛素水凝胶经模 拟人体环境释放出的胰岛素进行荧光光谱仪测定及对比分析，将激发 光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择 的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。设定激 发波长为276nm，激发和发射的狭缝宽度为2.5nm，发射波长扫描范 围280-450nm。将胰岛素标准溶液和载胰岛素水凝胶经模拟人体环境 释放出的胰岛素进行圆二色谱仪测定及对比分析，用1cm光程差的圆 柱形石英比色皿，设定参数为精密度0.2nm，带宽1.0nm，扫描速率200nm/min，扫描范围200-300nm，恒温4℃下扫描测定。

图8表明经模拟人体环境释放出的胰岛素荧光光谱图在308nm附 近均出现了特征峰，与胰岛素标准溶液的荧光光谱图一致，说明胰岛 素在经过凝胶微粒的包埋与释放此过程中其二级结构没有发生任何 改变，该凝胶微粒可保持胰岛素原有的生物活性不变。图9表明经模 拟人体环境释放出的胰岛素圆二色谱图中，在波长208nm和222nm 附近出现的两个负峰分别对应胰岛素的α螺旋和反平行β折叠的特征 峰。由此表明包埋的胰岛素在释放前后的结构未发生明显变化，进而 测其生物活性也保持不变，也与荧光光谱图的结果相一致。

实施例4，生物相容性测定指标评定。

细胞毒性实验：将Caco-2细胞接种于96孔板中，接种密度1×10⁵细胞/孔，用100μL含20％优质胎牛血清、1％双抗和1％非必需氨基酸 的MEM培养基在5％CO₂，37℃条件下培养24h。将凝胶微粒加入 MEM培养基，制成12.5、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL 的凝胶混悬液。24h后去除96孔板中的培养基，加入100μL不同浓度 凝胶混悬液，继续培养24h，然后每孔加入10μL CCK-8溶液。用加 了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对 照。在细胞培养箱内继续孵育0.5小时，在450nm测定吸光度。用不含 凝胶的MEM培养基做对照组。每组设8个复孔平行实验，取其平均值。

细胞存活率(％)＝OD_490(样品)-OD_490(空白)/OD_490(对照)-OD_490(空白)×100％

羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒有良好的生物相 容性，其中，如图10所示，凝胶混悬液(12.5、25、50、100、200、 400、800、1600μg/mL)培养24h后Caco-2细胞细胞存活率均到达96％ 以上，表明凝胶微粒无毒性，生物相容性良好。

实施例5，药理活性测定指标评定。

小鼠降血糖水平检测：取60只2～3周的雄性昆明小鼠，使用链脲 佐菌素(STZ)诱导法建立2型糖尿病小鼠模型。模型构建成功(血糖水 平≥16.7mmol/L)后，作为糖尿病小鼠模型用于进一步实验。将糖尿 病小鼠分为六组，每组10只，分别为模型组(口服0.9％生理盐水)、阳 性组(皮下注射5IU/kg)、阴性组(口服100IU/kg胰岛素溶液)、高剂量 给药组(口服100IU/kg载胰岛素凝胶微粒)、中剂量给药组(口服75 IU/kg载胰岛素凝胶微粒)、低剂量给药组(口服载50IU/kg胰岛素凝胶 微粒)。按照预先设计的不同方式给药后，通过收集尾巴末端的血样 (每小时一次)来获得血糖值，并检测不同给药方式下血糖随时间的变化规律。

图11所示，载胰岛素凝胶微粒有良好的降血糖活性作用。模型组 和阴性组对小鼠的血糖水平并没有起到任何的作用；阳性组可确保注 射后2小时血清胰岛素浓度达到峰值，但是作用时间短、急剧且很快 血糖值有所回升；相比之下,口服灌胃载胰岛素水凝胶微粒(50、75、 100IU/kg)均表现出血清胰岛素浓度峰值在6h左右,且可控制小鼠长 时间保持低血糖水平，缓释出的胰岛素持续了大约近10h。这表明, 水凝胶微粒包埋胰岛素后可实现缓释作用并对2型糖尿病小鼠模型具 有更持久的降血糖活性效果。