生理活性物质的口服给药
阅读说明：本技术 生理活性物质的口服给药 (Oral administration of physiologically active substances ) 是由 桑卡拉姆·曼特里普拉达 路加·阿默 凯思琳·M·坎贝尔 王学燕 于 2018-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明的实施方案可包括一种用于口服药物传输的组合物。该组合物可包含生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。生理活性物质可跨胃传输。生理活性物质在苛刻的胃酸环境中会是稳定的并且不发生降解。为了有助于保护生理活性物质,可将生理活性物质与载体加以混合。载体可以是不溶解于胃的胃酸的液体。生理活性物质可溶解于载体。粘膜粘附化合物可用于促进生理活性物质被吸收到胃的衬里。渗透促进剂可促成生理活性物质经过胃壁的传输。(Embodiments of the invention may include a composition for oral drug delivery. The composition may comprise a physiologically active substance, a carrier compound, a mucoadhesive compound, and a penetration enhancer. Physiologically active substances can be transported across the stomach. The physiologically active substance will be stable and not degrade in harsh gastric acid environments. To help protect the physiologically active substance, the physiologically active substance may be mixed with a carrier. The carrier may be a liquid that is insoluble in the gastric acid of the stomach. The physiologically active substance may be dissolved in the carrier. Mucoadhesive compounds are useful for promoting the absorption of physiologically active substances into the lining of the stomach. Penetration enhancers may facilitate the transport of physiologically active substances through the stomach wall.)
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月23日提交的美国临时专利申请第62/475,624号、和于2018年3月15日提交的美国专利申请第15/922,651号的优先权，这两个专利申请的全部内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。
背景技术
将生理活性物质(诸如小分子药物、激素类、蛋白质类、诊断试剂、和其它医药活性物质)传输进入患者面临着许多挑战。生理活性物质必须被传输进入患者。传输生理活性物质的一种方法是通过注射。注射可使生理活性物质能够到达血流或靶向区域以便快速地或直接地进行治疗，但注射对于患者而言会是不方便或疼痛的。许多生理活性物质必须频繁地给药，包括一天数次。更加频繁的给药方案会增加患者的不方便，会降低患者的依从率，并且会导致患者的不太理想的治疗结果。如果生理活性物质是通过注射而给药，那么另一次注射增加疼痛的频率、感染的风险、和患者中发生免疫应答的概率。注射的替代是摄入。与注射相比，摄入常常更加方便且创伤性较小。然而，由于摄入，生理活性物质必须穿过患者的消化系统并且会在到达血流或靶向区域进行治疗之前发生降解。因此，常常采用注射而不是摄入。例如，糖尿病的治疗通常需要胰岛素注射而不需要胰岛素的口服给药。对于可靠地将生理活性物质口服传输至血流或靶向区域进行治疗仍然存在着需求。本文中所描述的方法和组合物提供针对这些和其它需求的解决方案。
发明内容
本发明的实施方案允许将生理活性物质口服传输至人或其它动物的血流。生理活性物质主要是穿过胃壁而传输。为了在苛刻的环境中发生降解之前将生理活性物质穿过胃进行传输，而将生理活性物质与载体加以混合。载体可以是不溶解于胃的胃酸的液体。生理活性物质可溶解于载体。载体可使生理活性物质免受胃中的胃酸和胃蛋白酶的破坏。粘膜粘附化合物可用于促进生理活性物质吸附到胃的衬里。渗透或吸收促进剂可促成生理活性物质经过胃壁的传输。生理活性物质的口服给药会无需某些包衣或抑制剂，这些包衣或抑制剂会具有不良的副作用。
本发明的实施方案可包括一种用于口服药物给药的组合物。该组合物可包含生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。
本发明的实施方案可包括一种用于口服给药的药物制剂。该药物制剂可包含生理活性物质。该药物制剂也可包含如下的材料，该材料包括粘膜粘附化合物、渗透促进剂、反转胶束、或其中生理活性物质形成包合物(inclusion complex)的化合物中的至少一个。生理活性物质化合物可包括药物制剂的质心。所述材料可与生理活性物质接触。与生理活性物质的任何部分相比，一部分的所述材料可布置在更远离质心的位置。
本发明的实施方案可包括一种制造用于生理活性物质的口服给药的药物的方法。该方法可包括将生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂加以混合。该方法还可包括将生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂包封于胶囊中。该胶囊可构造成在胃酸中溶解以释放出生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。可用粘膜粘附化合物包覆该胶囊。
本发明的实施方案也可包括一种治疗的方法。该方法可包括将容纳组合物的胶囊向人进行口服给药。该组合物可包含生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、渗透促进剂。该方法也可包括使一部分的胶囊溶解于人的胃中，以释放生理活性物质和载体化合物进入胃中。该方法还可包括将一部分的生理活性物质吸附到胃壁上。另外，该方法可包括将生理活性物质经过胃壁传输进入血流中。
附图说明
图1示出了根据本发明实施方案的容纳生理活性物质的胶囊的口服给药的图解。
图2A～图2E示出了根据本发明实施方案的与生理活性物质的口服给药有关联的传输过程的图解。
图3A～图3G示出了根据本发明实施方案的口服给药组合物的结构层的图解。
图4示出了根据本发明实施方案的制造用于生理活性物质的口服给药的药物的方法。
图5示出了根据本发明实施方案的治疗方法。
具体实施方式
生理活性物质的常规给药方法包括注射。最近的工作已集中在开发生理活性物质给药的口服方法。然而，大部分的工作集中在保护在胃的胃酸中的生理活性物质，直到生理活性物质到达小肠。然后，将生理活性物质经过小肠传输至血流。为了使生理活性物质不在胃中完全地降解，先前的工作包括添加肠溶包衣和/或蛋白酶抑制剂。肠溶包衣是抵抗酸水解的包衣。蛋白酶抑制剂也可包括肽酶抑制剂。肠溶包衣和蛋白酶抑制剂会影响食物的正常消化，并且可具有肿胀和便秘的副作用。此外，就经过小肠被吸收的大量的生理活性物质而言，在摄入之前高浓度的生理活性物质需要在组合物中。使生理活性物质穿过其中通常没有生理活性物质的适当受体的小肠会导致差的治疗结果。例如，胰岛素受体通常不位于小肠附近，而是位于胰腺和肝脏附近。穿过肠壁的胰岛素蛋白质不具有到达胰腺和肝脏中的受体的直接路径。相反，就***(IGF)受体而言，与IGF受体结合的升高水平的胰岛素导致促***作用并且与癌症有关联。
本发明的实施方案可允许生理活性物质的口服给药的改善。代替经过肠壁传输生理活性物质，可经过胃壁传输生理活性物质。经过胃壁传输生理活性物质可具有若干优点。胰腺或肝脏可具有蛋白质或肽的受体，并且与经过肠壁的传输相比经过胃壁的传输可提供到达受体的直接或缩短的路径。因为生理活性物质无需到达肠，所以生理活性物质可以不包括用以保护生理活性物质的肠溶包衣。该包衣可具有不良的副作用。在代替经过肠壁的经过胃壁的路径中，在摄入前的生理活性物质浓度无需是高浓度，因为在消化道中更多的生理活性物质经过较短的时间会不发生降解，或者因为与经过肠壁相比有更多的生理活性物质会经过胃壁被吸收。没有肠溶包衣可降低生理活性物质的给药成本。
为了经过胃传输生理活性物质，生理活性物质应当在苛刻的胃酸环境中稳定且不发生降解，并且生理活性物质应当经过胃壁被吸收。为了这个目的，本发明的实施方案包括提高生理活性物质在胃中的稳定性并增加生理活性物质的吸收的方法。为了有助于保护生理活性物质，而将生理活性物质与载体加以混合。载体是不溶解于胃的胃酸的液体。生理活性物质可溶解于载体。粘膜粘附化合物可用于促进生理活性物质吸附到胃的衬里。渗透促进剂可促成生理活性物质经过胃壁的传输。
生理活性物质是指天然的、合成的、或基因工程的化学或生物化合物，该化合物在本技术领域中已知可调节生理过程从而提供对活人中的不希望有的现有疾病的诊断、预防、或治疗。生理活性物质包括药物，诸如抗心绞痛药、抗心律失常药、抗哮喘药、抗生素、抗糖尿病药、抗真菌药、抗组胺药、抗高血压药、抗寄生虫药、抗癌药、抗肿瘤药、抗病毒药、强心苷类、除草剂、激素类、免疫调节剂、单克隆抗体、神经递质、核酸类、蛋白质类、放射性造影剂、放射性核素、镇静药、镇痛药、甾体药物、镇静药、疫苗、升压药、***、肽类、小分子等。
在本发明的实施方案中，代替或除生理活性物质外，也可以采用前体药物(其在与细胞内介质、细胞、或组织发生局部相互作用时经历向指定生理活性物质的转化)。在本发明的实施方案中，代替或除生理活性物质外，也可想到包括能够形成盐的特定生理活性物质的任何可接受盐。盐类可包括卤化物盐、磷酸盐、醋酸盐、有机酸盐、和其它盐类。
生理活性物质可单独使用或者联合使用。在药物组合物中生理活性物质的量可足以使对活人中的不希望有的现有疾病的诊断、预防、或治疗成为可能。一般来说，剂量可随着患者的年龄、疾病、性别、和不希望有的疾病的程度而变化，并且可以由本领域技术人员来决定剂量。适合于人使用的剂量范围包括0.1至6,000mg生理活性物质每平方米体表面积的范围。
生理活性物质可包括蛋白质类或肽类。蛋白质类或肽类可包括胰岛素、人生长激素、胰高血糖素样肽-1、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素的片段、恩夫韦地，或奥曲肽。
胰岛素通常是由胰腺所产生。胰岛素调节血液中葡萄糖的代谢。高水平的葡萄糖或其它高血糖可以是胰岛素产生失调的指征，并且可以是糖尿病的指征。胰岛素常常是作为糖尿病的治疗剂通过注射而给药。
可用作生理活性物质的另一种蛋白质是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1(31个氨基酸的肽)是肠降血糖素，是可以降低血糖水平的激素。GLP-1可通过刺激胰岛素释放并抑制胰高血糖素释放而影响血糖。GLP-1也可通过减少胃排空而减慢营养素吸收进入血流的速率，并且可直接地减少食物摄取。GLP-1影响血糖水平的能力已使GLP-1成为2型糖尿病和其它病的潜在治疗剂。在其未被改变的状态中，GLP-1由于蛋白酶解因而具有小于2分钟的体内半衰期。
蛋白质类或肽类可包括人生长激素。人生长激素(hGH)(191个氨基酸的肽)是增强细胞生长和再生的激素。hGH可用于治疗生长障碍和生长不足。例如，hGH可用于治疗儿童中的矮小症或者成年人中的生长激素缺乏症。hGH的常规给药方法包括每日皮下注射。
类似于hGH和GLP-1，恩夫韦地
另一个生理活性物质是甲状旁腺激素(PTH)或者PTH的片段。PTH是同化(骨形成)物质。PTH可以以具有9,425Da分子量的含有84个氨基酸的多肽形式而由甲状旁腺分泌。前34个氨基酸可以是矿物质稳态的生物活性基团。合成的截短形式的PTH是以商品名
生理活性物质可包括小分子。小分子可包括由生物药剂学分类系统(BCS)所定义的药物，该分类系统是基于它们的水溶解度和肠渗透性对口服传输药物进行分类的系统。BCS将口服传输药物分类成四个类别：类别I，高渗透性、高溶解性；类别II，高渗透性、低溶解性；类别III，低渗透性、高溶解性；类别IV，低渗透性、低溶解性。溶解性分类是基于美国药典(USP)；当在1～6.8的pH范围内于37±1℃下最高强度可溶解于250mL或以下的水介质时，药物被认为是极易溶解。当基于质量平衡测定或者与静脉参照剂量相比确定全身生物利用度是给药剂量的85％或以上时，药物被认为是高渗透性的。关于小分子的其它信息可参见Amidon GL，Lennernas H，Shah VP，和Crison JR，1995年，生物药剂学药物分类的理论基础：体外药品溶出与体内生物利用度的相关性，Pharm Res,12:413-420，该参考文献的内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。
关于蛋白质类及蛋白质类的偶联物的其它信息可以参见于2004年4月8日提交的美国专利申请第10/553,570号(于2015年5月26日以美国专利第9,040,664号的形式发布)。关于蛋白质类和偶联物的浓度释放曲线的信息可以参见于2015年11月30日提交的美国专利申请第14/954,701号。在本公开中的专利申请、专利公布、和其它参考文献的内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。
I.方法
图1示出了容纳生理活性物质的胶囊102的口服给药的图解。胶囊102可以经过人106的口被摄入。该胶囊可沿食管108向下行进到胃110中。胃包括胃液112，该胃液也可包含胃蛋白酶。胶囊102可在胃110中溶解，并且生理活性物质可经过胃壁被吸收。胶囊102可以不行进到十二指肠114和小肠或者消化道的其它下游部分。图1是为了说明的目的而提供，并且各部分并不是按比例绘制。
图2A～图2E示出了与生理活性物质的口服给药有关联的传输过程的图解。图2A示出了胶囊202的图解。胶囊202包含生理活性物质204。其它化合物也可包含于胶囊202中。例如，其它化合物可包括载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。
图2B示出了在胃206中的胶囊202。胃206中容纳液体208，该液体包含胃液和胃蛋白酶。胃液和胃蛋白酶可各自单独地降解生理活性物质。液体208可溶解胶囊202，该胶囊202可释放胶囊中的化合物，包括生理活性物质204。
图2C示出了在胶囊202已被溶解后在胃206中的生理活性物质204。生理活性物质204浸没于载体化合物210中，该载体化合物210可用于使生理活性物质204免受液体208的破坏。载体化合物210可不溶解于液体208。例如，载体化合物210可以是有机相、油相、或非极性相。载体化合物210可包括油。生理活性物质204可部分地或完全地溶解于载体化合物210。载体化合物204可具有小于水或液体208的密度。因此，载体化合物210连同生理活性物质204可漂浮于液体208的顶部上。胃206通常会从不缺乏液体208，并且载体化合物210可漂浮于液体208的顶部上达数小时。
图2D示出了移动到胃206的壁的生理活性物质204和载体化合物210。该移动可以是胃中的正常液体流动的结果。生理活性物质204可吸附到胃壁上，从而防止生理活性物质204以远离胃壁的方式移动。已包含于胶囊202中的粘膜粘附物质可有助于生理活性物质204吸附到胃壁上。
图2E示出了经过胃壁被传输的生理活性物质204以及载体化合物的一部分212。载体化合物的一部分214可滞留于胃206中。渗透促进剂化合物可有助于生理活性物质204经过胃壁细胞的传输。然后生理活性物质204可行进经过血流到达蛋白质或肽化合物的受体。
最初在胶囊202中的部分的生理活性物质可以不被传输经过胃壁。部分的生理活性物质会损失到胃液或胃蛋白酶中，尽管载体化合物和任何其它化合物可有助于保护生理活性物质。部分的生理活性物质可离开载体化合物并进入胃液。生理活性物质可不完全地浸没于载体化合物中，并且部分的生理活性物质会变得暴露于胃液。当并非全部的生理活性物质被传输经过胃壁时会引起额外的损失。另外，并非全部的被传输经过胃壁的生理活性物质可达到生理活性物质的受体。可对胶囊中的生理活性物质的初始剂量进行调整以补偿预期的损失。
II.组合物
本发明的实施方案可包括一种用于口服药物传输的组合物。该组合物可包含生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。
生理活性物质可包括本文中所描述的任何生理活性物质，包括胰岛素、人生长激素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素的片段、恩夫韦地、或奥曲肽。除非上下文另有说明，胰岛素是指人胰岛素。生理活性物质可包括与PEG的偶联物。例如，生理活性物质可包括胰岛素-PEG偶联物或GLP-1-PEG偶联物。PEG可具有在2kDa至5kDa范围内的分子量。聚乙二醇化胰岛素可被称为聚乙二醇胰岛素(peginsulin)、PEG-胰岛素或胰岛素-PEG。
生理活性物质可包括蛋白质或肽类似物、同系物、或衍生物。类似物是具有一个或数个氨基酸的蛋白质或肽序列的化合物，并且其余的序列被不同的氨基酸所替换或者将更多的氨基酸添加到该序列中。就胰岛素而言，胰岛素类似物包括赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、和甘精胰岛素。同系物是来源于不同动物的蛋白质或肽化合物。例如，犬胰岛素、猪胰岛素、和大鼠胰岛素是胰岛素同系物。另外，胰岛素同系物可包括哺乳动物胰岛素、鱼胰岛素、爬行动物胰岛素、和两栖动物胰岛素。衍生物是具有一个连接的基团的蛋白质或肽化合物、类似物、或同系物。例如，地特胰岛素、德谷胰岛素、和PEG-胰岛素是胰岛素衍生物。在动物中，类似物、同系物、和衍生物应当具有与该蛋白质或肽化合物相似或相同的代谢影响。例如，胰岛素类似物、胰岛素同系物、和胰岛素衍生物会对动物中的葡萄糖具有代谢影响。
本发明的实施方案可包括GLP-1、GLP-1激动剂、或者GLP-1的类似物、同系物、或衍生物。GLP-1的类似物和激动剂包括激动肽、索马鲁肽、利拉鲁肽、杜拉鲁肽、阿必鲁肽、和利西那肽。GLP-1同系物可包括犬GLP-1、猪GLP-1，并且大鼠GLP-1是GLP-1同系物。另外，GLP-1同系物可包括哺乳动物GLP-1、鱼GLP-1、爬行动物GLP-1、和两栖动物GLP-1。PEG-GLP-1是胰岛素衍生物。GLP-1类似物、GLP-1同系物、和GLP-1衍生物可通过诱导胰腺释放胰岛素而对葡萄糖做出应答。
组合物可包含蛋白质或肽化合物的任意组合。例如，组合物可包含胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素同系物、胰岛素衍生物、GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1同系物、GLP-1衍生物的任意组合、或它们的聚乙二醇化化合物。例如，组合物可包含胰岛素、GLP-1、聚乙二醇化胰岛素、和聚乙二醇化GLP-1。
生理活性物质可包括小分子。小分子可包括本文中所描述的任何小分子。小分子可包括解热镇痛药、镇痛药、抗疟药、抗生素、消毒剂、情绪稳定剂、激素替代、口服避孕药、***、镇静药、和他汀类药物。
载体化合物可以是水不溶性的。胃酸是水性混合物，载体化合物不应与胃酸混合从而减慢生理活性物质化合物的降解。载体化合物可包括两亲性的和与水不混溶的化合物。载体化合物可包括鱼油、二十二碳六烯酸(DHA)、酯化的甘油三酯、ω-脂肪酸、橄榄油、橙油、磷虾油、柠檬油、红花油、蓖麻油、氢化油、海藻油、或它们的混合物。鱼油可包括来源于鲭鱼、鲱鱼、金枪鱼、鲑鱼、和鳕鱼肝的油。载体化合物可包括鲸脂油、海豹脂油、培根油、猪油、和液化黄油。载体化合物也可以是具有高生物利用度的化合物，是可以经过胃壁被吸收进入血流的化合物。载体化合物可以是在GRAS(通常认为是安全的)FDA注册中。可以以1mL载体每1.5mg生理活性物质当量的比率包含载体化合物。在一些实施方案中，可以以0.1至0.5mL、0.5mL至1mL、1mL至1.5mL、1.5mL至2.0mL、2.0mL至2.5mL、2.5mL至3.0mL、或大于3mL每1.5mg生理活性物质的比率添加载体化合物。
粘膜粘附化合物可包括环糊精(例如，七2,6-β-O-甲基-β-环糊精(Hepakis2,6-B-O-methyl-B-cyclodextrin)、淀粉、(d,l-丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)、己内酯、或食品添加剂。粘膜粘附化合物可包括衍生于聚丙烯酸的聚合物(例如，聚卡波非、卡波姆)、衍生于纤维素的聚合物(例如，羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、海藻酸盐、壳聚糖、凝集素类、脂肪酸的酯类(例如，单油酸甘油酯、甘油单亚油酸酯)、侵袭素、菌毛蛋白、抗体、巯基化分子(例如，巯基化聚合物)、及它们的衍生物。用作粘膜粘附化合物的聚合物可以是阳离子型、阴离子型、或非离子型。粘膜粘附化合物可包括泊洛沙姆188。粘膜粘附化合物描述于Carvalho等人的“粘膜粘附药物传输系统”Brazilian J.of Pharm.Sci.,45(1)(2010)，该文献的内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。
环糊精可与生理活性物质形成包合物，或者环糊精可与聚乙二醇化生理活性物质的PEG组分形成包合物。环糊精可包括α-环糊精、β-环糊精、或γ-环糊精。环糊精也可包括化学改性环糊精，其可包括羟丙基-β-环糊精、磺丁基醚β-环糊精、随机甲基化β-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、聚合的环糊精、环氧氯丙烷-β-环糊精、或羧甲基环氧氯丙烷β-环糊精。
不希望受到理论的束缚，据推测可将生理活性物质保护于环糊精环结构中以防止其在胃酸中发生降解。包合物可由任意大小的PEG与α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、或化学改性环糊精中的任一种所形成。包合物可包含与生理活性物质连接的一种或多种化合物。例如，多个环糊精分子可与单独的聚乙二醇化蛋白质连接。包合物可在0.5摩尔至1摩尔过量、1摩尔至2摩尔过量、2摩尔至3摩尔过量、3摩尔至4摩尔过量、4摩尔至5摩尔过量、5摩尔至10摩尔过量、10摩尔至15摩尔过量、15摩尔至20摩尔过量、或大于20摩尔过量的情况下而形成。
渗透促进剂可包含带正电荷的分子、带负电荷的分子、或两性分子。渗透促进剂可包含两亲性分子。渗透促进剂可包含中性分子，诸如烷基葡萄糖苷。带正电荷的分子可包括烷基胆碱类、酰基胆碱类、和胆汁盐。带负电荷的分子可包括十二烷基硫酸钠。两性分子可包括磷脂类、鞘脂类、和十二烷基磷酰胆碱(DPC)。渗透促进剂可包括1,2-二榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-脂酰乙醇胺(POPE)、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛胆酸钠盐、乙二胺四乙酸(EDTA)、N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、十三烷基-β-D-麦芽糖苷、十二烷基硫酸钠(SDS)、多库酯钠(DSS)、胆汁盐、纳米乳液(例如，液滴尺寸小于150nm，基于
可以以3mg每1.5mg生理活性物质的比率包含渗透促进剂。在一些实施方案中，可以以0.5mg至1.0mg、1.0mg至1.5mg、1.5mg至2.0mg、2.0mg至2.5mg、2.5mg至3.0mg、3.0mg至3.5mg、3.5mg至4.0mg、或大于4.0mg每1.5mg生理活性物质的比率而包含渗透促进剂。
组合物也可包括将生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂加以包封的胶囊。该胶囊可构造成在胃中降解。换句话说，该胶囊可构造成使得至少一部分的胶囊在胃中降解或溶解从而释放出胶囊的内容物。在一些情况下，整个胶囊可在胃中降解或溶解。胶囊材料可包括明胶、多糖类、和增塑剂。胶囊材料可包括肠溶包衣。
组合物也可包含有机酸的疏水性阴离子。该有机酸的疏水性阴离子可增加生理活性物质的疏水性，这可允许生理活性物质停留在载体化合物中达较长的持续时间。有机酸可包括扑酸、多库酯(docusate，DSS)、呋喃甲酸、或它们的混合物。疏水性阴离子可包括双羟萘酸阴离子、多库酯阴离子、或糠酸盐阴离子。在这些或其它的例子中，疏水性阴离子可以是脂肪酸阴离子、磷脂阴离子、聚苯乙烯磺酸盐阴离子、或它们的混合物。磷脂阴离子的磷脂可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷酸胆碱、或它们的混合物。疏水性阴离子也可不包括所描述的任何阴离子或所描述的任何阴离子的组群。疏水性阴离子可附接到蛋白质上的特定侧链，或者它可附接到生理活性物质上的多个侧链。疏水性阴离子可具有大于1的logP。logP是水-辛醇分配系数，并且可被定义为蛋白质盐在辛醇中的浓度与蛋白质盐在水中浓度的对数。大于10的logP可导致是水中浓度10倍的辛醇中浓度。水-辛醇分配系数可用于当分子自身会是两亲性时对不同分子的分配进入疏水相的能力进行比较。
组合物可包含反转胶束。胶束可以是具有亲水性头和疏水性尾的分子。胶束可被称为反转的，因为亲水性头面朝内而疏水性尾面朝外。反转胶束可包括磷脂类、DPPG、POPE、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛胆酸钠盐、N-十二烷基β-D-麦芽糖苷、十三烷基-β-D-麦芽糖苷、SDS、DSS、DPC、和它们的阴离子。反转胶束也可以是渗透促进剂。
组合物可包含可生物降解聚合物。该可生物降解聚合物可形成包含生理活性物质的颗粒。该可生物降解聚合物可包括PLGA或己内酯类。PLGA可包围生理活性物质，从而提供针对在胃酸中降解的额外的抗性。可生物降解聚合物可溶解于水。可生物降解聚合物可具有端羧基，这些端羧基与生理活性物质形成离子对，使得生理活性物质更有可能停留在载体液体中。可生物降解聚合物可起粘膜粘附物质的作用，并且与胃壁相互作用。
组合物可包含pH值调节剂，例如升高胃的pH值的化合物。升高胃的pH值可对抗胃酸并且可延迟生理活性物质在胃中的降解。作为例子，组合物可包含碳酸氢钠，其可升高pH值并降低胃蛋白酶在胃中的活性。胃酸调节剂的其它例子包括H2受体阻滞剂、质子泵抑制剂、***素E1样化合物、和抗酸剂、及它们的盐。抗酸剂可包括碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钙、碳酸氢钙、碳酸氢铝、氢氧化铝、镁碳酸氢、氢氧化镁、三硅酸镁、及它们的组合。其它胃酸调节剂描述于美国专利公布第2017/0189363A1号，该专利公布的内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。
组合物可包含离子型或非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂的例子包括硫酸盐类、磺酸盐类、磷酸盐类、羧酸盐类、十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯烷基硫酸钠、月桂醇醚硫酸钠、多库酯(琥珀酸二异辛酯磺酸钠)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁基磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐类、和烷基醚磷酸盐类。非离子型表面活性剂的例子包括Triton X-100、泊洛沙姆、单硬脂酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、失水山梨醇单月桂酸酯、山梨醇酐单硬脂酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、吐温20、吐温40、吐温60、和吐温80。表面活性剂可有助于使油相免受酸性水相的影响。
组合物可包含肽酶抑制剂。肽酶抑制剂可包括乙二胺四乙酸(EDTA)和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)。肽酶抑制剂可包括任何的抑制剂家族，包括抑制剂I3A、抑制剂I3B、抑制剂I4、抑制剂I9、抑制剂I10、抑制剂I24、抑制剂I29、抑制剂I34、抑制剂I36、抑制剂I42、抑制剂I48、抑制剂I53、抑制剂I67、抑制剂I68、和抑制剂I78。肽酶抑制剂描述于Rawlings等人的“进化的肽酶抑制剂家族”Biochem.J,378(3)705-716(2004)中，该文献的内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。组合物也可不包含肽酶抑制剂，或者以比在常规口服给药制剂中所使用浓度更低的浓度而包含肽酶抑制剂。
组合物可不包含油。组合物可不包含本文中所描述的任何化合物或化合物的组群。
若干化合物可具有不同化合物的特性。例如，环糊精可以是粘膜粘附物质，并且可以是对抗酸和酶催化降解的稳定剂。在有些情况下，组合物可包含两个、三个、四个、或五个不同的化合物作为生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。在某些情况下，组合物可包含同时起粘膜粘附和渗透促进剂的作用的单个化合物。
III.结构
本发明的实施方案可包括用于口服给药的药物制剂的结构，如在不按比例绘制的图3A～图3F中所示。如在图3A中，该药物制剂可包含生理活性物质302。生理活性物质302可以是本文中所描述的任何生理活性物质。生理活性物质302可包括药物制剂304的质心。
药物制剂也可包含如下的材料，该材料包括粘膜粘附化合物、渗透促进剂、反转胶束、或包合物中的至少一个，其中生理活性物质形成包合物。该材料可与生理活性物质接触。一部分的该材料可布置在与生理活性物质的任何部分相比更加远离质心的位置。
该材料可包括粘膜粘附化合物、渗透促进剂、反转胶束、或包合物中的一个、两个、三个、或四个。该材料也可包括肽酶抑制剂、pH值调节剂、或表面活性剂中的至少一个。
如在图3B中所示，该材料可包括包合物306，其中生理活性物质302形成包合物。包合物306可包含本文中所描述的任何化合物。
如在图3C中所示，该材料可包括渗透促进剂308。一部分的渗透促进剂308与包合物306的任何部分相比可更加远离质心。渗透促进剂308可包含本文中所描述的任何化合物。
如在图3D中所示，该材料可包括反转胶束310。一部分的反转胶束310与包合物306的任何部分相比可更加远离质心。反转胶束310可以是本文中所描述的任何反转胶束。
如在图3E中所示，该材料可包括粘膜粘附化合物312。一部分的粘膜粘附312与包合物306的任何部分相比可更加远离质心。粘膜粘附化合物312可以是本文中所描述的任何粘膜粘附化合物。
包合物306可接触生理活性物质302。反转胶束306可接触包合物306。渗透促进剂308可接触包合物306。粘膜粘附312可接触反转胶束310或渗透促进剂308中的至少一个。
并非所有的化合物会是存在的。与生理活性物质、渗透促进剂、反转胶束、或包合物的任何部分相比，一部分的粘膜粘附化合物(如果存在)可更加远离质心。包合物(如果存在)可接触生理活性物质。反转胶束(如果存在)可接触包合物或生理活性物质。渗透促进剂(如果存在)可接触包合物或生理活性物质。所存在的化合物可接触更靠近质心的化合物。例如，粘膜粘附化合物可接触渗透促进剂、反转胶束、包合物、或生理活性物质中的至少一个。
如在图3F中所示，药物制剂还可包括胶囊314。胶囊314可包封生理活性物质302、材料、和载体化合物316。载体化合物316可以是本文中所描述的任何载体化合物。图3F可以是图2A的一个实施方案。胶囊314也可包封肽酶抑制剂、pH值调节剂、或表面活性剂。
如在图3G中所示，在一些实施方案中，粘膜粘附化合物312可在胶囊的更加远离药物制剂质心的一侧接触胶囊314。在胶囊内部，材料可包括渗透促进剂308、反转胶束310、或包合物306中的至少一个。胶囊314可包封生理活性物质和材料。胶囊也可包封载体化合物316。另外的粘膜粘附化合物可存在于胶囊314内部，并且可以如在图3E和图3F中的方式而构造。图3G可以是图2A的一个实施方案。
来源于生理活性物质的不同层可起保护层的作用，用以防止生理活性物质在胃酸中降解。
IV.制造的方法
图4示出了制造用于生理活性物质的口服给药的药物的方法400。方法400可包括将生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂加以组合(方框402)。生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂可以是本文中所描述的任何化合物，并且可以以本文中所描述的任意量而组合。方法400还可包括将肽酶抑制剂、pH值调节剂、或表面活性剂与生理活性物质加以组合。肽酶抑制剂、pH值调节剂、和表面活性剂可以是本文中所公开的任何肽酶抑制剂、pH值调节剂、和表面活性剂。本文中所描述的任何化合物可排除与生理活性物质组合。
可在方框402前首先形成生理活性物质的包合物。可将环糊精或其它环状化合物与生理活性物质在水溶液中加以混合。包合物可形成沉淀物，该沉淀物是包合物。当与其它化合物混合时，生理活性物质可在包合物中。
在一些实施方案中可将各化合物加以组合然后搅拌或者在其它实施方案中不搅拌。可通过对混合物进行超声处理，将各化合物搅拌。可在室温下对混合物进行超声处理。在添加渗透促进剂之前，可对生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附共同地进行超声处理。可简单地使与渗透促进剂的混合物产生旋流或涡流而加以混合。在一些实施方案中，方法400可包括用载体化合物包覆生理活性物质。
方法400还可包括将生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂包封于胶囊中。该胶囊可构造成在胃酸中溶解，以释放出生理活性物质、载体化合物、和粘膜粘附化合物。胶囊可以是本文中所描述的任何胶囊。胶囊可包括肠溶包衣。在各实施方案中，胶囊可不包括肠溶包衣，并且胶囊和/或在胶囊中的组合物可不包含肽酶抑制剂。
V.治疗的方法
图5示出了治疗的方法500。该治疗可包括对影响代谢途径的疾病的治疗。该疾病可包括糖尿病、生长缺陷、HIV、AIDS、骨疾病、或骨质疏松症。
方法500可包括将容纳组合物的胶囊向人进行口服给药(方框502)。该组合物可包含生理活性物质、载体化合物、粘膜粘附化合物、和渗透促进剂。该组合物也可包含肽酶抑制剂、pH值调节剂、或表面活性剂中的至少一个。该组合物可以是本文中所描述的任意组合物。
方法500也可包括使一部分的胶囊溶解于人的胃中，从而将生理活性物质和载体化合物释放进入胃中(方框504)。
方法500还可包括将一部分的生理活性物质吸附到胃壁上(方框506)。在该部分的生理活性物质吸附到胃壁上之前，该部分的生理活性物质可滞留于载体化合物中。因为载体可不混溶于胃酸中，所以生理活性物质在被吸附到胃壁上之前会不发生降解。
另外，方法500可包括将生理活性物质经过胃壁传输进入血流中(方框508)。将生理活性物质传输经过胃壁可以是在胶囊口服给药后的约3至4小时。
VI.实施例
在各实施例中使用人胰岛素，除非另有说明。
A.实施例1
制备三个样品，所有的样品包含3mg的胰岛素-PEG偶联物(包含5kDaPEG)和1mL鱼油。
样品1：3mg的胰岛素-PEG偶联物、1mL鱼油、50mgβ-环糊精、和3mg十二烷基磷酰胆碱(DPC)。
样品2：3mg的胰岛素-PEG偶联物、1mL鱼油、0.7mg扑酸。
样品3：3mg的胰岛素-PEG偶联物、1mL鱼油、3mg DPC。
对样品1～3进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均质的。然后将各样品添加到5mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)以判定胰岛素-PEG是否滞留于油相中。HPLC表明在样品1～3中在15分钟内胰岛素-PEG离开油相而进入胃液相。未观察到在本实施例中的样品适合于胰岛素的口服给药，因为胰岛素-PEG偶联物不滞留于油相中达足够长的时间。
B.实施例2
对胰岛素-PEG(5kDa)的双羟萘酸盐进行测试，以了解胰岛素-PEG双羟萘酸盐是否将会滞留于油相中达较长的时间。通过在超过7的pH值下将胰岛素-PEG与双羟萘酸钠加以混合，而制备胰岛素-PEG双羟萘酸盐。然后使pH值下降到4。然后收集沉淀物并通过冷冻干燥而使其干燥。将胰岛素-PEG双羟萘酸盐包含于样品4和6中。在样品5中，将双羟萘酸钠添加到胰岛素-PEG中而未形成胰岛素-PEG双羟萘酸盐。
样品4：3mg的胰岛素-PEG双羟萘酸盐、1mL鱼油、50mgβ-环糊精、3mg DPC。
样品5：3mg的胰岛素-PEG、0.5mg双羟萘酸钠、1mL鱼油、50mgβ-环糊精、3mg DPC。
样品6：3mg的胰岛素-PEG双羟萘酸盐、1mL鱼油、3mg DPC。
对样品4～6进行超声处理直到浑浊和均质。然后将样品添加到5mL的模拟胃液(不含胃蛋白酶)中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)以判定胰岛素-PEG是否滞留于油相中。就样品5而言，在15分钟内胰岛素-PEG离开油相并发现于胃液相中。就样品6而言，胰岛素-PEG滞留于油相中达至少1.5小时然后发现于胃液相中。就样品4而言，甚至在第5小时在胃液相中仅发现少量的胰岛素-PEG，或者胰岛素停留在油相中或发生沉淀。
在本实施例中的样品似乎表明，与将双羟萘酸钠添加到胰岛素-PEG中时相比，胰岛素-PEG双羟萘酸盐将会停留在油相中达更长的时间。样品4显示用于胰岛素口服给药的最适宜结果，这会是β-环糊精的结果。
C.实施例3
对胰岛素-PEG(5kDa)和α-环糊精的包合物进行了测试。将胰岛素-PEG和10摩尔过量的α-环糊精在水溶液中加以混合，并且在4℃下保持一夜以形成沉淀物。将所形成的沉淀物冻干并且使用于样品7。
样品7：6.2mg的胰岛素-PEG与α-环糊精的包合物、1mL鱼油、3mgDPC。
样品8：3.1mg胰岛素-PEG、1mL鱼油、3mg DPC。
在形成样品7和8中，对胰岛素-PEG(或胰岛素-PEG包合物)和鱼油进行30分钟的超声处理。然后将DPC添加到经超声处理的混合物中，并且简单地使该混合物形成旋流或涡流而进行混合。将所形成的混合物在室温下保持1小时。然后将样品添加到5mL的模拟胃液(不含胃蛋白酶)中。将混合物颠倒数次进行混合。
HPLC确定就样品7而言在3小时后35％的包合物滞留于油相中。同时，样品8中全部的胰岛素-PEG分配进入水相中。本实施例表明，与不是包合物的一部分的胰岛素-PEG偶联物相比，胰岛素-PEG包合物停留在油相中达更长的时间。
D.实施例4
在胃蛋白酶的水溶液中对包合物进行了测试。
样品9：2mg的胰岛素-PEG(5kDa)与α-环糊精的包合物。
将样品9添加到1mg胃蛋白酶溶解于1mL模拟胃液的水溶液中。胰岛素-PEG被完全地消化。本实施例表明包合物在测试浓度下不足以防止胰岛素发生降解。
E.实施例5
将实施例3的样品7添加到含有1mg/ml胃蛋白酶的模拟胃液中。HPLC表明在3小时后约12％的胰岛素-PEG存在于油相中。本实施例表明，当胰岛素-PEG滞留于油相中时，包合物防止胰岛素-PEG的降解。
F.实施例6
对与α-环糊精、β-环糊精、和γ-环糊精的包合物进行了测试。α-环糊精具有最小的由环所形成的环形孔，而γ-环糊精具有最大的环形孔。将胰岛素-PEG(5kDa)与10摩尔过量的α-环糊精、β-环糊精、或γ-环糊精在水溶液中加以混合并且在4℃下保持一夜而形成沉淀物。将所形成的沉淀物冻干。在模拟胃液中执行分配研究，如在实施例1中。在3小时后，35％的与α-环糊精的包合物、7％的与β-环糊精的包合物、和10％的与γ-环糊精的包合物滞留于油相中。本实施例表明对于含有5kDa PEG的胰岛素-PEG，α-环糊精包合物具有最佳性能。与其它的环糊精相比，α-环糊精可具有用于胰岛素-PEG的更合适尺寸的环形孔。
G.实施例7
在包合物中和在不包括包合物两种情况下，对包含2kDa PEG的胰岛素-PEG进行了测试。将胰岛素-PEG与10摩尔过量的α-环糊精在水溶液中加以混合，并且在4℃下保持一夜而形成沉淀物。将所形成的沉淀物冻干并且使用于样品10。
样品10：6.2mg的胰岛素-PEG与α-环糊精的包合物、1mL鱼油、3mgDPC。
样品11：3.1mg胰岛素-PEG、1mL鱼油、3mg DPC。
在形成样品10和11中，对胰岛素-PEG(或胰岛素-PEG包合物)和鱼油进行30分钟的超声处理。然后将DPC添加到经超声处理的混合物中，并且简单地使该混合物形成旋流或涡流而进行混合。将所形成的混合物在室温下保持1小时。然后将样品添加到5mL的模拟胃液(不含胃蛋白酶)中。将混合物颠倒数次进行混合。
HPLC确定就样品10而言在3小时后20％的包合物滞留于油相中。同时，样品11中有6％的胰岛素-PEG滞留于油相中。本实施例表明，与不是包合物的一部分的胰岛素-PEG偶联物相比，胰岛素-PEG包合物停留在油相达更长的时间。此外，与实施例3的样品8相比，样品11中有更大量的胰岛素-PEG滞留于油相中。实施例7的结果表明，与包含5kDa PEG的胰岛素-PEG相比，包含2kDa PEG的胰岛素-PEG更好地停留在油中。
H.实施例8
为了估测各种制剂的膜渗透性，而执行了Caco-2渗透性研究。被测试化合物是胰岛素-PEG(5kDa)、胰岛素-PEG(5kDa)包合物、胰岛素-PEG(5kDa)包合物和DPC、胰岛素-PEG(2kDa)、和胰岛素-PEG(2kDa)包合物。将所有化合物以1mg胰岛素/mL介质的浓度溶解于介质并添加到Caco-2单层中。在3小时后，胰岛素-PEG(2kDa)使1％的胰岛素-PEG渗透经过细胞层。在3小时后，胰岛素-PEG(2kDa)包合物使5％的胰岛素-PEG渗透经过细胞层。在3小时后其它化合物均不显示经过细胞层的任何渗透。此研究表明胰岛素-PEG能够渗透经过Caco-2肠细胞层。基于这些结果，可预计胰岛素-PEG能够渗透经过胃壁。
I.实施例9
用不同的胰岛素-PEG样品和单独使用鱼油的对照组执行了体内研究。
样品12：3.1mg胰岛素-PEG(5kDa)、1mL鱼油、3mg DPC。
样品13：6.2mg胰岛素-PEG(5kDa)与α-环糊精的包合物、1mL鱼油、3mg DPC。
样品14：2.1mg胰岛素-PEG(2kDa)、1mL鱼油、3mg DPC。
样品15：4.87mg胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、1mL鱼油、3mg DPC。
在形成样品12～15中，对胰岛素-PEG(或胰岛素-PEG包合物)和鱼油进行30分钟的超声处理。然后将DPC添加到经超声处理的混合物中，并且简单地使该混合物形成旋流或涡流而进行混合。将所形成的混合物在室温下保持1小时。以150IU/kg(用于5kDa PEG)和75IU/kg(用于2kDa PEG)的剂量，通过口服灌胃将样品向大鼠进行给药。以规定的间隔，从颈静脉中采集血液并对血糖值进行分析。
在用胰岛素-PEG制剂进行给药的一些大鼠中，观察到显著的血糖降低。在用5kDa胰岛素-PEG(样品12和13)进行给药的各组中一只大鼠具有显著的血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)。在接下来的数小时中这些大鼠的血糖水平逐渐地升高，并且在大约3小时返回到基线(～50mg/dL)。在这些组中的剩余大鼠具有类似于对照组的血糖应答。用样品14(2kDa PEG)进行给药的大鼠中的两只大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)，血糖仍然保持低水平达3小时，在此时间点必须给这两只大鼠提供右旋糖，因为它们的血糖水平过低。在该组中剩余的大鼠具有类似于对照组的血糖应答。用样品15(2kDa PEG)进行给药的大鼠中的两只大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)，在2小时后这些大鼠中的一只大鼠具有接近基线的血糖水平，其它大鼠的血糖水平仍然保持低水平达3小时，在此时间点必须给它们提供右旋糖，因为它们的血糖水平过低。在该组中剩余的大鼠具有类似于对照组的血糖应答。具有显著血糖应答的大鼠在血清中也具有可检测水平的胰岛素-PEG(如通过ELISA所检测)。在某些大鼠中，与包含5kDaPEG的胰岛素-PEG相比，包含2kDaPEG的胰岛素-PEG似乎更好地被吸收，因为在这些大鼠中血清胰岛素-PEG的量更大。就2kDa胰岛素-PEG而言，这导致更加可重现的和持久的血糖降低，这与来自实施例8的发现是一致的。
J.实施例10
执行了体内研究以对口服胰岛素-PEG样品与胰岛素-PEG和胰岛素的皮下注射进行比较。
样品16：2.1mg胰岛素-PEG(2kDa)、1mL鱼油、3mg DPC。
样品17：0.015mg/kg胰岛素-PEG(2kDa)
样品18：0.011mg/kg胰岛素
在形成样品16中，对胰岛素-PEG和鱼油进行30分钟的超声处理。然后将DPC添加到经超声处理的混合物中，并且简单地使该混合物形成旋流或涡流而进行混合。将所形成的混合物在室温下保持1小时。以40和60IU/kg的剂量通过口服灌胃将样品16向大鼠进行给药。以0.3IU/kg的剂量将样品17和18皮下给药。以规定的间隔，从颈静脉中采集血液并对血糖值进行分析。
用样品17和18进行皮下给药的所有大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)。样品17(胰岛素-PEG)具有血糖的逐渐升高，并且在约4小时返回到基线(～60mg/dL)。样品18(胰岛素)具有血糖的逐渐升高，并且在约3小时返回到基线。用40IU/kg的样品16进行口服给药的一只大鼠具有血糖降低(在30分钟的时间点降低至40mg/dL)并且一只大鼠具有血糖降低(在6小时的时间点降低至40mg/dL)，这些大鼠的血糖水平在下一个时间点返回到基线。剩余的大鼠不具有显著的血糖降低。用60IU/kg的样品16进行口服给药的两只大鼠具有血糖降低(在2小时的时间点降低至40mg/dL)，血糖在3小时返回到基线，并且一只大鼠具有血糖降低(在8小时的时间点降低至30mg/dL)。剩余的大鼠不具有显著的血糖降低。尽管从40和60IU/kg剂量的口服制剂中看见存在某些血糖降低，但应答并不如在其中给药剂量较高的实施例9中所看见的那样显著。
K.实施例11
执行了体内研究，从而对口服胰岛素-PEG样品与胰岛素-PEG的皮下注射进行比较。除了口服制剂是以75IU/kg的剂量进行给药外，此研究类似于实施例10。
样品19：0.011mg/kg胰岛素
样品20：2.1mg胰岛素-PEG(2kDa)、1mL鱼油、3mg DPC。
在形成样品20中，对胰岛素-PEG和鱼油进行30分钟的超声处理。然后将DPC添加到经超声处理的混合物中，并且简单地使该混合物形成旋流或涡流而进行混合。将所形成的混合物在室温下保持1小时。通过口服灌胃以75IU/kg的剂量将样品20向大鼠进行给药。以0.3IU/kg的剂量将样品19皮下给药。以规定的间隔，从颈静脉中采集血液并对血糖值进行分析。
用样品19进行皮下给药的所有大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至20mg/dL)，血糖水平逐渐地升高并且在约3小时返回到基线(～60mg/dL)。用样品20进行口服给药的五只大鼠中的三只大鼠在30分钟具有在20和40mg/dL之间的血糖降低(降低至少30％)，血糖水平逐渐地升高并且在约3小时返回到基线。剩余的两只大鼠不具有显著的血糖降低。这些结果类似于样品14。
L.实施例12
用不同的蛋白质/肽活性药物成分(API)(胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)或者GLP-1(包含5kDa PEG))、渗透促进剂、粘膜粘附化合物、和载体化合物制备十七个样品。一些化合物可以同时起渗透促进剂和粘膜粘附化合物两者的作用。
样品21：2mg的胰岛素-PEG偶联物、1mL鱼油
样品22：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg DPC、1mL鱼油。
样品23：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油(DPPG)、1mL鱼油。
样品24：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-脂酰乙醇胺(POPE)、1mL鱼油。
样品25：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg脱氧胆酸、1mL鱼油。
样品26：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg脱氧胆酸钠、1mL鱼油。
样品27：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg甘氨胆酸钠、1mL鱼油。
样品28：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg牛胆酸钠盐、1mL鱼油。
样品29：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷、1mL鱼油。
样品30：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg十三烷基-β-D-麦芽糖苷、1mL鱼油。
样品31：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg十二烷基硫酸钠(SDS)、1mL鱼油。
样品32：2mg的GLP-1-PEG偶联物、3mg DPC、1mL鱼油。
样品33：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg DPC、1mL磷虾油。
样品34：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg DPC、3mg SDS、1mL鱼油。
样品35：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg DPC、3mg多库酯钠(DSS)、1mL鱼油。
样品36：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg DPC、50mg七(2,6-β-O-甲基-β-环糊精)、1mL鱼油。
样品37：2mg的胰岛素-PEG偶联物、3mg DPC、50mg丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、1mL鱼油。
对样品21～37的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对各样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将各样品添加到5mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将各混合物颠倒数次进行混合。
用高效液相色谱仪(HPLC)对胃液相的样品进行分析，以判定胰岛素-PEG是否仍然被保护于油相中和有多少进入水相。HPLC表明在大部分的制剂中在15分钟内胰岛素-PEG离开油相而进入胃液相。由于实验误差和/或其它误差，一些结果显示大于100％的API。在样品23、24和31中，胰岛素-PEG似乎更缓慢地离开油相，这表明DPPG、POPE和DSS有助于将胰岛素保持在油中。
表1
M.实施例13
使用胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)，使用不同的渗透促进剂、粘膜粘附化合物、和载体化合物制备了六个样品。一些化合物可以同时起渗透促进剂和粘膜粘附化合物两者的作用。
样品38：3mg的胰岛素-PEG偶联物、6mg十三烷基-β-麦芽糖苷、1mL鱼油。
样品39：3mg的胰岛素-PEG偶联物、4mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-脂酰乙醇胺(POPE)、1mL鱼油。
样品40：3mg的胰岛素-PEG偶联物、4mg DPC、1mL橄榄油。
样品41：3mg的胰岛素-PEG偶联物、4mg DPC、50mg PLGA、1mL橄榄油。
样品42：3mg的胰岛素-PEG偶联物、4mg POPE、1mL橄榄油。
样品43：3mg的胰岛素-PEG偶联物、4mg POPE、4mg DPC、1mL橄榄油。
对样品38～43的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对各样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将各样品添加到5mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将各混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)，以判定胰岛素-PEG是否滞留于油相中和有多少进入水相。HPLC表明在大部分的制剂中在15分钟内胰岛素-PEG离开油相而进入胃液相。在样品39和42中，胰岛素-PEG似乎较缓慢地离开油相，这再次表明POPE有助于将胰岛素-PEG保持在油相中。然而，在对于胰岛素-PEG吸收而言为重要的DPC的存在下，POPE似乎并不有助于将胰岛素-PEG保持在油中。
表2
N.实施例14
执行了体内研究，从而对口服胰岛素-PEG样品与胰岛素的皮下注射进行比较。制备含有包含如在表3中所详述的胰岛素-PEG偶联物(包含2kDaPEG)、以及不同的包合物、渗透促进剂、粘膜粘附化合物、和载体化合物的用于口服给药的四个制剂。
表3
对制剂44～47的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对各样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。将样品在室温下存放过夜。在通过口服灌胃以75IU/kg的胰岛素当量剂量进行给药之前，使正常SD大鼠(5只大鼠/组)禁食一夜。为了比较，以0.3IU/kg的剂量用优泌林R(重组人胰岛素)对第五组(样品48)进行皮下给药。在给药前(-30min)和给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h)采集血液，用于使用血糖仪的葡萄糖测量。
用样品48进行皮下给药的所有大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)。血糖水平逐渐地升高并且在3小时返回到基线。给与样品44的五只大鼠中的三只大鼠具有至少30％的血糖降低，并且在2或3小时最低。在4小时的时间点，在这些大鼠中的血糖返回到基线，除了一只大鼠的血糖经过6小时仍然低于基线水平。给与样品47的一只大鼠具有显著的血糖降低，并且在2小时最低。直到8小时，血糖缓慢地返回到基线水平。给与样品45的两只大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)，同时一只大鼠在2小时具有30％的血糖降低。给与样品46的一只大鼠具有血糖降低(在30分钟内降低至≤20mg/dL)。在达到最小血糖水平后的约2小时，这些大鼠返回到基线血糖水平。应当指出的是，在10分钟从给与样品45的两只大鼠和给与样品46的一只大鼠中抽取血液并观察到在其嘴周围有油，这与具有血糖降低的大鼠是一致的。在嘴周围的油表明剂量会不完全地被传输至这些大鼠的胃中，并且这些大鼠在30分钟具有显著的血糖降低。
O.实施例15
使用胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)，使用不同的粘膜粘附化合物或渗透促进剂，制备六个样品。
样品49：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品50：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、10.6mg泊洛沙姆188、0.8mL橄榄油。
样品51：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、10mg低分子量壳聚糖、0.8mL橄榄油。
样品52：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、10mg低分子量壳聚糖、25mg DSS、0.8mL橄榄油。
样品53：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、10mg羧甲基纤维素、25mg DSS、0.8mL橄榄油。
样品54：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、40mg PLGA、0.8mL橄榄油。
对样品49～54的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对各样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将各样品添加到5mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)，以判定胰岛素-PEG是否滞留于油相中和有多少进入水相。在含有DSS的样品52和53中，胰岛素-PEG似乎更加缓慢地离开油相，这表明DSS有助于将胰岛素-PEG保持在油相中。
表4
P.实施例16
使用胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)，使用不同类型和量的渗透促进剂，制备九个样品。不同的渗透促进剂包括DPC、DSS和POPE。
样品55：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、2.4mgDPC、0.8mL橄榄油。
样品56：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、3mgPOPE、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品57：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品58：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、3mgPOPE、3mg DSS、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品59：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、3mgPOPE、30mg DSS、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品60：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、3mg DSS、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品61：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、15mgPOPE、30mg DSS、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品62：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、3mgDSS、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
样品63：3.68mg的胰岛素-PEG(2kDa)与α-环糊精的包合物、30mgDSS、2.6mg DPC、0.8mL橄榄油。
对样品55～63的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将样品添加到5mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)，以判定胰岛素-PEG是否滞留于油相中和有多少进入水相。在含有等量的DSS和POPE的样品58、含有的DSS比POPE更多的样品59和61中，胰岛素-PEG似乎更加缓慢地离开油相。在具有DSS但不具有POPE的样品62和63中离开油相的胰岛素-PEG的量多于在样品58、59、和61中的量，从而表明DSS和POPE可共同地发挥作用从而将胰岛素-PEG保持在油相中。
表5
Q.实施例17
制备用于体内研究的样品。制备含有如在表6中所详述的胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)以及不同的渗透促进剂的用于口服给药的四个制剂。
表6
对制剂64～66的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。将样品在室温下存放一夜。在通过口服灌胃以75IU/kg的胰岛素当量剂量或橄榄油单独(样品67)进行给药之前，使正常SD大鼠(8只大鼠/组)禁食一夜。在给药前(-30min)和给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h)采集血液，用于使用血糖仪的葡萄糖测量。
给与样品64～66的所有大鼠，在2～8小时下降返回到接近初始水平之前，在第一小时内具有大约50％的血糖升高。在对照组(样品67)中观察到类似的倾向，这表明在本实施例中样品64～66不能有效地降低这些特定大鼠的血糖。
R.实施例18
制备了用于体内研究的样品。制备了含有如在表7中所详述的胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)以及不同的载体化合物、渗透促进剂、和粘膜粘附化合物的用于口服给药的四个制剂。这些样品类似于实施例17，除了全部的这些样品含有PLGA作为粘膜粘附剂并且向大鼠给与较高的剂量(100IU/kg)外。
表7
对制剂69～71的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对各样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。将样品在室温下存放一夜。在通过口服灌胃以100IU/kg的胰岛素当量剂量或橄榄油单独(样品72)进行给药之前，使正常SD大鼠(8只大鼠/组)禁食一夜。在给药前(-30min)和给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h)采集血液，用于使用血糖仪的葡萄糖测量。
给与样品69的大鼠具有类似于对照组(样品72)的血糖应答。用样品70进行给药的一只大鼠具有显著的血糖降低，并且从0.5至3小时血糖水平是在23～39mg/dL之间，在4小时为47mg/dL和在第6小时为44mg/dL；在8小时血糖水平返回到基线(～75mg/dL)。在该组中的剩余大鼠具有类似于对照组的血糖应答。用样品71进行给药的一只大鼠具有显著的血糖降低，并且在0.5小时血糖水平为64mg/dL，在1至2小时是在35～40mg/dL之间，在3至4小时是在53～57mg/dL之间，并且在6小时返回到基线附近。在此组中的剩余大鼠具有类似于对照组的血糖应答。DSS和PLGA在样品70和71中的存在连同剂量从75IU/kg增加到100IU/kg有助于与样品64～66相比较的进一步血糖降低。这表明DSS和PLGA在制剂中的存在有助于药物吸收。
S.实施例19
制备用于体内研究的样品。制备含有如在表8中所详述的胰岛素-PEG偶联物(包含2kDa PEG)以及不同的渗透促进剂、粘膜粘附化合物、载体化合物、和表面活性剂的用于口服给药的七个制剂。
表8
以与在样品73～75和79中所不同的方法制备样品77中的包合物。将胰岛素-PEG与10摩尔过量的α-环糊精在水溶液中加以混合并且在4℃下保持一夜而形成沉淀物。在冷冻干燥之前将所形成的沉淀物过滤以除去任何可溶解的胰岛素-PEG和α-环糊精并且使用于样品77，制备包合物的此方法应当导致制剂中游离环糊精的减少。对制剂73～75和77～79的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后，将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。将样品在室温下存放一夜。在通过口服灌胃以100IU/kg的胰岛素当量剂量或橄榄油和DHA单独(样品76)进行给药之前，使正常SD大鼠(8大鼠/组)禁食一夜。就样品73～76而言在给药前(-30min)和给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、6h、8h)就样品77～79而言在给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h)采集血液，用于使用血糖仪的葡萄糖测量。
用样品73进行给药的一只大鼠具有显著的血糖降低，此大鼠的基线为95mg/dL，在30分钟时血糖下降至60mg/dL，从1至3小时血糖保持在34～47mg/dL之间，并且在4小时为65mg/dL。接受样品73～79的所有其它大鼠具有类似于对照的血糖应答。这表明样品73具有测试制剂的最佳吸收。
T.实施例20
制备用于体内研究的样品。制备含有胰岛素-PEG偶联物(包含2kDaPEG)或胰岛素以及不同的渗透促进剂、粘膜粘附化合物、载体化合物、和蛋白酶抑制剂的用于口服给药的四个制剂。用被设计成不溶解直到它们到达小肠的肠溶包衣胶囊或者应当在胃中溶解的明胶胶囊制作了制剂。将样品的详细情况示于表9中。
表9
对制剂82～85的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后，将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将样品添加到胶囊中。在样品82和83中，在添加油混合物之前将SBTI添加到胶囊中。将样品在室温下存放一夜。在以8mg/犬的胰岛素当量剂量用丸剂进行给药之前，使正常小猎犬(6条犬/组)禁食一夜。在给药前(-30min)和给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、5h、7h)采集血液，用于使用血糖仪的葡萄糖测量。也对所采集的血液样进行胰岛素和c-肽的分析。
在用样品82进行给药的犬中未看到显著的血糖降低。给与样品83的六只犬中的两只犬具有大于30％的血糖降低，并且在0.5小时具有最大降低，在2小时血糖水平返回到基线。在该组的其它犬中未看见显著的血糖降低。在给与样品84和85的犬中未看见显著的血糖降低。这些结果表明成功的传输无需肠溶包衣胶囊，这是因为样品83是在明胶胶囊中传输。肽酶抑制剂SBTI的存在也似乎通过防止蛋白质的消化而增强吸收。
利用ELISA对血清胰岛素进行测量，在具有显著降低的血糖的两只犬中检测到血清胰岛素水平的升高，另外在其它样品中检测到胰岛素的一些升高。在样品83中，在具有血糖降低的两只犬中在10分钟胰岛素的最大浓度为3.7ng/ml并且在30分钟为6.4ng/ml。在给与样品82的四只犬中对胰岛素进行了检测，并且1.0ng/ml和1.6ng/ml之间的Cmax在10和60分钟之间。在两条犬的样品84中对胰岛素进行了检测，并且1.2ng/ml和1.3ng/ml之间的Cmax在60和90分钟之间。在给与样品85的两只犬中对胰岛素进行了检测，并且1.5ng/ml和1.8ng/ml之间的Cmax在10分钟和30分钟之间。总之，这些结果表明大于1.8ng/ml的血清胰岛素水平对于实现血糖降低是必需的。
在血糖降低的犬中，C-肽水平也被抑制。C-肽被用作内源性胰岛素的指示物。胰岛素原被裂解成胰岛素和C-肽。如果胰岛素是内源性的，则产生等摩尔的C-肽。当C-肽水平下降时，动物产生较少的胰岛素，这表明外源性胰岛素代替了内源性胰岛素。具有降低的血糖的给与样品83的两只犬也具有血清C-肽的降低，从64％降低至92％的基线水平。总之，血糖和C-肽的降低连同血清胰岛素的升高表明血糖的降低是由外源性胰岛素所导致。
U.实施例21
制备用于体内研究的样品。制备含有胰岛素-PEG偶联物(包含2kDaPEG)或胰岛素以及不同的渗透促进剂、粘膜粘附化合物、载体化合物和蛋白酶抑制剂的用于口服给药的四个制剂。用被设计成不溶解直到它们到达小肠的肠溶包衣胶囊或者应当在胃中溶解的明胶胶囊制作了制剂。另外，样品86～89的给药是在为了提高胃pH值而用在单独明胶胶囊中的200mg碳酸氢钠进行给药。提高胃的pH值应当会降低蛋白酶活性，在超过pH＝2下该蛋白酶具有降低的活性，从而有可能导致胰岛素在胃中较少的降解。另外，提高胃的pH值可能有助于提高胰岛素稳定性，因为降解可以在低pH值下发生。将样品86～89的详细情况示于表10中。
表10
对制剂86～88的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。在样品86和87中的油混合物之前将SBTI添加到胶囊中，而在样品88中的油混合物之前添加SBTI和EDTA。通过将除SBTI外的所有组分溶解于水中而制备样品89。在添加各组分之后使各样品形成涡流，直到混合物均匀，。然后将混合物速冻和冻干，并且添加到容纳SBTI的胶囊中。样品86～89的给药是为了提高胃pH值而用在单独明胶胶囊中的200mg碳酸氢钠进行给药。将样品在4℃下存放一夜。在以8mg/犬的胰岛素当量剂量用丸剂进行给药之前，使正常小猎犬(6条犬/组)禁食一夜。在给药前(-30min)和给药后(10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、5h、7h)采集血液，用于使用血糖仪的葡萄糖测量。
就给与样品86的犬而言，在30分钟两条犬具有最大的血糖降低(27％和65％降低)，而一条犬在1小时具有最大的血糖降低(39％)。剩余的三条犬具有小于基线值的15％的血糖变化。结果类似于在样品83中所观察的结果，从而表明碳酸氢钠的存在不显著地改变药物吸收。就给与样品87的犬而言，四条犬在30分钟具有最大的血糖降低(37％、41％、51％、和42％)，其中的三条犬中在另外的30分钟后并且在第四条犬中在1小时后血糖水平返回到基线。剩余的两条犬具有小于基线值的15％的血糖变化。就给与样品88的犬而言，两条犬在30分钟具有最大的血糖降低(降低30％和69％)，而一条犬在1小时具有最大的血糖降低(53％)。在两条犬中在1小时后并且在第三条犬中在3小时后血糖返回到基线水平。剩余的三条犬具有小于基线值的15％的血糖变化。就给与样品89的犬而言，一条犬在1小时具有最大血糖降低(29％)。剩余的五条犬具有小于基线值的15％的血糖变化，因此观察到载体化合物影响吸收。
V.实施例22
用在C-末端被聚乙二醇化(PTH-PEG)的由氨基酸残基1～34所组成的甲状旁腺激素的肽片段(PTH)制备了四个样品。用于偶联的PEG为2kDa或者5kDa，如下所述。
样品91：1.68mg PTH-PEG(2kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mgDSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品92：1.68mg PTH-PEG(2kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mgDSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品93：2.5mg PTH-PEG(5kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品94：2.5mg PTH-PEG(5kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
对样品91～94的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对各样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将样品添加到4mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)以判定PTH-PEG是否滞留于油相中和有多少进入水相。所有样品中有<40％在0.25小时离开油相而进入水相，并且在3小时非常少的PTH滞留于油中。将结果示于表11。
表11
W.实施例23
执行了体内研究，从而对口服PTH-PEG样品与PTH的皮下注射进行比较。制备含有PTH-PEG偶联物(氨基酸残基1～34，包含2kDa PEG)的制剂，用于在正常大鼠中通过口服灌胃的给药。为了进行比较，用非聚乙二醇化PTH(氨基酸残基1～34)制备样品，用于通过皮下注射给药。
样品95：2mg PTH和10mL磷酸盐缓冲盐水(pH＝7)，含有0.01％的吐温80(PBST)。
样品96：8.6mg PTH-PEG和1.3mgα-环糊精、5mg POPE、4mg DPC、5mg DSS、62.5mgSBTI、0.9mL橄榄油、和0.1mL DHA。
在给药之前的大约30分钟，用PBST溶解样品95的肽并颠倒数次进行混合。
对样品96的肽和油进行超声处理，直到它看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到该样品中，再次对其进行超声处理直到它看上去浑浊但均匀。将样品在2～8℃下存放一夜(约12小时)。在给药前的大约30分钟，将SBTI添加到该制剂中。
使正常大鼠(5大鼠/组)禁食一夜。就样品95而言，通过皮下注射以0.2mg PTH/mL/kg的剂量对大鼠进行给药。就样品96而言，通过口服灌胃以15mg PTH-PEG/kg(8.6mg/mL)的剂量对大鼠进行给药。在给药前(-30min)和给药后(15min、1h、2h、4h、24h)采集血液。利用ELISA对血清样品进行PTH和血清钙浓度的分析。
用样品95进行皮下给药的大鼠在15分钟具有在1,474至7,968pg/mL范围内的最大水平的PTH。这些水平迅速地下降并且仅两只大鼠在1小时具有可测量的水平。给与样品95的大鼠的相应的钙水平在2小时达到最大水平，并且是在57.3至66.9μg/mL的范围内。就用样品96进行口服给药的五只大鼠而言，仅一只大鼠具有可测量的PTH水平，并且在15分钟具有178,585pg/mL的Cmax。此大鼠的PTH水平缓慢地下降，但在24小时仍然是可测量的(1,813pg/mL)。此大鼠的血清钙浓度在1小时达到最大水平(80.2μg/mL)，并且在2小时和4小时之间水平返回到基线(～50μg/mL)。剩余4只大鼠的血清钙浓度在1小时达到最大水平，并且这些值是在56.4至73.5μg/mL的范围内。平均钙水平在2小时的时间点仍然较高，并且在4小时接近基线。此实验表明我们的技术可以用于碱性和酸性蛋白质药物两者。胰岛素是酸性蛋白质(pI＝5.5)并且PTH是碱性蛋白质(pI＝8.0)，因此组合物可以包含碱性和酸性蛋白质两者。
X.实施例24
使用胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-PEG偶联物(包含2kDa PEG或5kDa PEG)、或胰岛素制备了四个样品。
样品97：0.72mg GLP-1和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mgPLGA、0.8mL橄榄油。
样品98：1.25mg GLP-1-PEG(2kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mgDSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品99：1.84mg GLP-1-PEG(5kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mgDSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品100：1.36mg胰岛素(5kDa)和0.2mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
对样品97～100的肽和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。样品98明显地比其它样品更加浑浊。然后将样品添加到4mL的不包含胃蛋白酶的模拟胃液中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)，以判定蛋白质或聚乙二醇化蛋白质是否滞留于油相中和有多少进入水相。在样品97～100中，在水相中的蛋白质是不可定量的。在样品97、98和100中，在3小时后一些蛋白质滞留于油相中，如在表12中所示。与包含2kDa PEG的GLP-1(样品98)、或包含5kDa PEG的GLP-1(样品99)相比，更多的未聚乙二醇化的GLP-1(样品97)被保护在油相中，这表明PEG分子量有助于将GLP-1分配于油中。
表12
Y.实施例25
用油溶性小分子埃索美拉唑镁水合物制备了四个样品。
样品101：1.94mg埃索美拉唑镁水合物、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mgPLGA、0.8mL橄榄油。
样品102：1.11mg埃索美拉唑镁水合物、1mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mg DPC、3mgDSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品103：33.6mg埃索美拉唑镁水合物β-环糊精包合物、3mg POPE、2.4mg DPC、3mgDSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品104：33.9mg埃索美拉唑镁水合物γ-环糊精包合物、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
在样品103和104中，通过将埃索美拉唑镁水合物与10摩尔过量的β或γ环糊精在水溶液中加以混合而形成包合物。在于4℃下保温一夜后，形成白色沉淀物，然后将该沉淀物速冻和冻干。
对样品101～104的埃索美拉唑镁水合物和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将样品添加到4mL的不包含胃蛋白酶的50％乙腈和50％PBS的溶液中。将混合物颠倒数次进行混合。
使样品经过高效液相色谱仪(HPLC)，以判定埃索美拉唑镁水合物是否滞留于油相中和有多少进入水相。将结果是示于表13中。
表13
当把α-环糊精添加到油混合物中时，进入水相中的埃索美拉唑镁水合物的量减少，如在样品102中。当把与β或γ环糊精的包合物添加到油混合物中时，进入水相的埃索美拉唑镁水合物的量进一步减少，如在样品103和104中。
Z.实施例26
用水溶性小分子头孢曲松钠制备了两个样品。
样品105：2.15mg头孢曲松钠、3mg POPE、2.4mg DPC、3mg DSS、50mg PLGA、0.8mL橄榄油。
样品106：1.85mg头孢曲松钠、1mgα-环糊精、3mg POPE、2.4mgDPC、3mg DSS、50mgPLGA、0.8mL橄榄油。
对样品105～106的头孢曲松钠和油进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将剩余的成分添加到各样品中。再次对样品进行超声处理，直到它们看上去浑浊但均匀。然后将样品添加到4mL的模拟胃液的溶液中。将混合物颠倒数次进行混合。
利用模拟胃液在300nm处的吸光度来判定头孢曲松钠是否进入水相中。
结果表明样品105和106中的头孢曲松钠缓慢地进入水相，并且在3小时仅50％在水相中，这表明其它的50％滞留于油相中。
使用人生长激素、胰高血糖素样肽-1、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素的片段、恩夫韦地、和奥曲肽来代替活性药物成分，重复实施例1～26。
所有的专利、专利公布、专利申请、期刊论文、书籍、技术参考、和在本公开中所论述的全部内容以参考的方式并入本文中用于所有目的。
在前面的描述中，为了解释的目的，已陈述了许多细节从而便提供对本发明的各种实施方案的理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，某些实施方案可在不提供部分的这些细节、或者在提供额外细节的情况下实施。
上面已描述了若干实施方案，本领域技术人员将认识到的是，在不背离本发明的精神的前提下，可采用各种修改、替代结构和等同物。此外，尚未描述一些公知的方法和元件，从而避免不必要地使本发明难以理解。此外，任何具体实施方案的细节可不始终存在于该实施方案的变型中或者可加入到其它实施方案中。
在提供一系列值的情况下，应当理解的是，除非上下文中明确地指出，在该范围的上限和下限之间的各介于中间的值(直至下限单位的十分之一)也被具体地公开。包括在任何指定值之间的各较小范围或者在指定范围内的介于中间的值及任何其它指定值或在该指定范围内的介于中间的值。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或不被包括在该范围内，并且其任何、任何不、或两个限值被包括在该较小范围内的各范围也被包括在本发明中，可具有在指定范围内的任何具体排除的限值。在指定范围包括一个或两个限值的情况下，也包括排除所包括限值中的一个或两个限值的范围。
在本文中和在所附权利要求中所使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”、和“该(the)”包括复数所指对象，除非上下文中明确地指出。因此，例如对“一个方法”的引述包括多个的这种方法，并且对“组织”的引述包括对本领域技术人员而言为已知的一个或多个组织及其等同物等的引述。目前为止已为了清楚和理解的目的详细描述了本发明。然而，应当理解的是，在所附权利要求的范围内可实施某些变更和修改。
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