一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用 (Acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase mutant and application thereof ) 是由 王成华 朱春燕 张婷 张冉 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用,该突变体是将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶进行如下任一突变后获得的：(1)将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基进行F296L突变；(2)将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基进行Y351A突变；(3)将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基进行S392A突变；(4)在鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基的E388与D389位之间插入一段长度由GHFCGLLQLSKRFEQ组成的15个氨基酸多肽片段。本发明的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体可利用空气中氧气作为电子受体,具有更好的底物亲和力和催化效率,可降低生产成本,更加适用于工业化生产应用。(An acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase mutant and application thereof, wherein the mutant is obtained by performing any one of the following mutations on acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase: (1) subjecting the alpha subunit of acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase to F296L mutation; (2) carrying out Y351A mutation on the alpha subunit of the acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase; (3) subjecting the alpha subunit of acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase to S392A mutation; (4) a15 amino acid polypeptide fragment consisting of GHFCGLLQLSKRFEQ in length is inserted between positions E388 and D389 of the alpha subunit of acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase. The acinetobacter baumannii xanthine dehydrogenase mutant can utilize oxygen in the air as an electron acceptor, has better substrate affinity and catalytic efficiency, can reduce production cost, and is more suitable for industrial production and application.)
技术领域
本发明涉及一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶及其应用，在鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的基础上，通过点突变制造黄嘌呤氧化酶活性增强的黄嘌呤脱氢酶突变体，及其在降解含次黄嘌呤和黄嘌呤材料中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
黄嘌呤氧化还原酶(Xanthine oxidoreductase，简称XOR)是一种包含铁硫簇、钼蝶呤和黄素辅基的氧化还原酶，它具有黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，简称XOD，EC1.17.3.2)和黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase，简称XDH,EC 1.17.1.4)两种不同的存在形式。它可以利用O2、NAD+和亚甲基蓝等作为电子受体，氧化催化包括嘌呤、蝶呤、杂环分子等在内的多种底物的氧化反应(李丽书,陈献华,邵叶波,等.黄嘌呤氧化还原酶的结构、功能和作用[J].细胞生物学杂志,2004,26(4):381-384.)。X0R具有重要的商业应用价值，其中黄嘌呤氧化酶的应用主要涉及五个方面，分别是药物代谢、核苷类药物合成、体外检测、生物修复、健康食品方面(王成华,邢新会.黄嘌呤氧化酶的研究进展及其发展前景[J].广西科学,2017,24(1):15-24.)。临床上可用于制备免疫抗体、肿瘤抑制剂和细胞缺血性再灌注损伤等疾病的检测(李忠琴.节杆菌黄嘌呤氧化酶的发酵、纯化、特性及基因研究[D].江苏:江南大学,2007.)。
XOD是由前体蛋白XDH经过巯基氧化可逆转变或者通过酶解断裂不可逆转变而来，利用分子O2作为电子受体，但失去了XDH所具有的利用NAD+作为电子受体的能力。它们是同一基因转录表达的产物，其中XDH是基因转录后的直接产物，是在体内的主要存在状态(Woolfolk,C.A.and J.s.Downard,Distribution of xanthine oxidase and xanthinedehydrogenase specificity types among bacteria.J Bacteriol,1977.130(3):1175-91)。相对于XDH利用昂贵的NAD+作为电子受体而言，可以直接利用空气中02作为电子受体的XOD成为商业用酶的首选。
目前，商品化X0D仅限于提取法生产。例如从牛奶奶油等动物源材料中提取的牛奶XOD，从野生藤黄节杆菌等野生微生物中提取的细菌XOD。牛奶黄嘌呤氧化酶是目前市场上最主要的XOD，也是最早获得专利并投向市场的酶。然而，XDH到X0D的复杂转变过程，存在着活性X0D与前体蛋白混杂与活性XOD含量低的问题，不仅影响到XOD的活性和得率，还增加了酶的使用成本，造成XOD价格高昂，限制了其应用发展(Enroth,C.,et al.,Crystalstructures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase:structure-based mechanism of conversion.Proc Natl Acad Sci USA，2000.97(20):10723-8)。
本发明人前期研究获取了一种新的荚膜红细菌来源XDH(申请号201410764840.5，发明人邢新会、王成华、张翀，一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用)，一种新的鲍氏不动杆菌来源XDH(申请号201510406718.5，发明人邢新会、王成华、张翀、苏楠，一种碱性黄嘌呤脱氢酶及其在检测试剂盒中的应用)。并通过基因工程手段获取了更高催化活性的截断体形式变体XDH(申请号201510048275.7，发明人邢新会、王成华、张翀，一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用)，以及一种黄嘌呤脱氢酶突变体(申请号201710152663.9，发明人邢新会、王成华、张翀，黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用)。随着领域的扩展，有必要进一步开发pH耐受范围更高，底物亲和力更强和催化效率更好的新型XOD。如果能将鲍氏不动杆菌来源XDH蛋白改造成可以直接转录翻译的XOD将具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用。所提供的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体具备增强的黄嘌呤氧化酶的活性，该黄嘌呤脱氢酶突变体是在由序列1所示氨基酸序列的ɑ亚基与序列2所示氨基酸序列的β亚基构成的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶序列中，进行定点突变后获得。所述定点突变为仅对ɑ亚基进行突变(β亚基不进行突变)。
本发明提供一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体，该突变体酶是由ɑ亚基和β亚基构成，所述ɑ亚基的氨基酸序列如序列表中SEQ IN NO:1所示，所述β亚基的氨基酸序列如序列表中SEQ IN NO:2所示。
本发明所提供的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体由如下ɑ亚基和β亚基构成。
所述ɑ亚基为如下(a1)-(a5)中任一:
(a1)氨基酸序列为序列表中序列3所示的亚基；
(a2)将序列表中序列1的第296位的苯丙氨酸(F)替换为亮氨酸(L)后得到的氨基酸序列所示的亚基；
(a3)将序列表中序列1的第351位的络氨酸(Y)替换为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列所示的亚基；
(a4)将序列表中序列1的第392位的丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)后得到的氨基酸序列的亚基；
(a5)将(a1)-(a4)中任一氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加后得到的具有相同功能的亚基。
所述β亚基为如下(b)：
(b)氨基酸序列为序列表中序列2所示的亚基；
对于以上(a1)来说，所述定点突变具体为在鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基第E388氨基酸和D389氨基酸间***一段长度为15个氨基酸，具体序列为GHFCGLLQLSKRFEQ的氨基酸多肽序列。该突变记为E388Insert。
对于以上(a2)来说，所述定点突变具体为将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基(序列1)的第296位的苯丙氨酸(F)替换为亮氨酸(L)。该突变记为F296L。
对于以上(a3)来说，所述定点突变具体为将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基(序列1)的第351位的络氨酸(Y)替换为丙氨酸(A)。该突变记为Y351A。
对于以上(a4)来说，所述定点突变具体为将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基(序列1)的第392位的丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)。该突变记为S392A。
编码所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；
所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的实施例中，所述核酸分子具体为编码所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的基因，所述基因具体为如下1)-8)中任一所示DNA分子：
1)序列表中序列5所示DNA分子；
2)序列表中序列5的第1-1545位所示DNA分子；
3)将序列表中序列4的第886-888位的ttt替换为ctg后所得序列所示DNA分子；
4)将序列表中序列4的第886-888位的ttt替换为ctg后所得序列的第1-1500位所示DNA分子；
5)将序列表中序列4的第1051-1053位的tat替换为gca后所得序列所示DNA分子；
6)将序列表中序列4的第1051-1053位的tat替换为gca后所得序列的第1-1500位所示DNA分子；
7)将序列表中序列4的第1174-1176位的tct替换为gca后所得序列所示DNA分子；
8)将序列表中序列4的第1174-1176位的tct替换为gca后所得序列的第1-1500位所示DNA分子；
9)在严格条件下与1)-8)中任一所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
10)与1)-9)中任一所限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6X SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2X SSC，0.1％SDS和1X SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述1)和2)所示基因为编码鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体E388Insert的基因；上述3)和4)为编码鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体F296L的基因；上述5)和6)为编码鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体Y351A的基因；上述7)和8)为编码鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体S392A的基因。
用于制造黄嘌呤脱氢酶突变体的亲本基因为来源于鲍氏不动杆菌的黄嘌呤脱氢酶基因，其核苷酸序列如序列15表示，序列15自5’末端起第1位至第1500位核苷酸所示的DNA分子编码ɑ亚基，第1502位至第3877位核苷酸所示的DNA分子编码β亚基。所述基因中，除了ɑ亚基及β亚基外，还包括对形成活性黄嘌呤脱氢酶必须的伴侣蛋白进行编码的碱基序列，其对应的碱基序列为第3884位至第4867位。由于本发明的黄嘌呤脱氢酶突变体F296L、Y351A、E388Insert和S392A只在野生型酶ɑ亚基中发生突变，因此具有与野生酶相同的氨基酸序列的β亚基及伴侣蛋白。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、宿主细胞或重组菌也是本发明保护的范围。
所述转基因细胞系不包括动物和植物的繁殖材料。
在本发明的一个实例中，所述重组载体具体为将序列表中序列5所示的DNA分子替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRX0388。在本发明的一个实例中，所述重组载体具体为将“将序列表中序列4的第886-888位的ttt替换为ctg后所得序列所示DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRX0296。在本发明的另一个实例中，所述重组载体具体为将“将序列表中序列4的第1051-1053位的tat替换为gca后所得序列所示DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRX0351。在本发明的再一个实例中，所述重组载体具体为将“将序列表中序列4的第1174-1176位的tct替换为gca后所得序列所示DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRX0392。以上四个重组载体即为产鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的重组质粒，分别表达四种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体。
在本发明中，所述微生物具体为将所述重组载体(上述四个重组载体之一)转化大肠杆菌后得到的重组大肠杆菌。
其中，所述转化可以是把所述重组载体引入到宿主细胞时所使用的一切方法。比如，把所述表达载体引入到宿主细胞的方法包括但不局限于氯化钙及热冲击转化法、离子枪冲击法、电穿孔法、超声波处理、通过PEG的沉淀法。
所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体在作为黄嘌呤氧化酶中的应用也属于本发明的保护范围。
所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体作为黄嘌呤氧化酶在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)降解次黄嘌呤和/或黄嘌呤；
(b)降解含有次黄嘌呤和/或黄嘌呤的材料。
所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、宿主细胞或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(A)制备具有黄嘌呤氧化酶活性的产品；
(B)制备既具有黄嘌呤脱氢酶活性，也具有黄嘌呤氧化酶活性的产品。
下述任一生物材料也属于本发明的保护范围：
A)蛋白质，其氨基酸序列为如下(a1)-(a4)中任一：
(a1)序列表中序列3:
(a2)将序列表中序列1的第296位的苯丙氨酸(F)替换为亮氨酸(L)后得到的序列；
(a3)将序列表中序列1的第351位的络氨酸(Y)替换为丙氨酸(A)后得到的序列；
(a4)将序列表中序列1的第392位的丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)后得到的序列；
B)基因，其核苷酸序列为如下b1)–b4)中任一:
b1)序列表中序列5的第1-1545位；
b2)将序列表中序列4的第886-888位的ttt替换为ctg后所得序列的第1-1500位；
b3)将序列表中序列4的第1051-1053位的tat替换为gca后所得序列的第1-1500位；
b4)将序列表中序列4的第1174-1176位的tct替换为gca后所得序列的第1-1500位；
C)含有B)中所述基因的重组载体、表达盒、宿主细胞或微生物。
所述生物材料在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)制备具有黄嘌呤氧化酶活性的产品；
(b)制备既具有黄嘌呤脱氢酶活性，也具有黄嘌呤氧化酶活性的产品。
另外，本发明还保护制备所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的方法，具体是将编码所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的核酸分子导入大肠杆菌进行诱导表达，得到所述蛋白质。
所述核酸分子是通过含有所述核酸分子的重组表达载体(如上述四个重组载体)导入所述大肠杆菌中的。
本发明的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体E388Insert利用空气中氧气作为电子受体时，最适pH为7，最适温度为40℃，对黄嘌呤的Km值为0.27μM，转化数为7.48s-1，比活力为0.13U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时，最适pH为7，最适温度为45℃，对黄嘌呤的Km值为0.82μM，转化数为15.69s-1，对应的比活力为0.03U/mg蛋自。两种受体时比活力的比值为4.3，比野生型提高17.2倍(野生型两者的比值为0.25)。
本发明的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体F296L利用空气中氧气作为电子受体时，最适pH为7.5，最适温度为50℃，对黄嘌呤的Km值为1.32μM，转化数为34.76s-1，比活力为0.25U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时，最适pH为9，最适温度为50℃，对黄嘌呤的Km值为1.16μM，转化数为62.43s-1，对应的比活力为0.16U/mg蛋自。两种受体时比活力的比值为1.56，比野生型提高6.24倍(野生型两者的比值为0.25)。
本发明的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体Y351A利用空气中氧气作为电子受体时，最适pH为9，最适温度为40℃，对黄嘌呤的Km值为10.26μM，转化数为26.64s-1，比活力为1.49U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时，最适pH为9，最适温度为40℃，对黄嘌呤的Km值为28.02μM，转化数为196.02s-1，对应的比活力为0.77U/mg蛋白。两种受体时比活力的比值为1.94，比野生型提高7.76倍(野生型两者的比值为0.25)。
本发明的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体S392A利用空气中氧气作为电子受体时，最适pH为7，最适温度为45℃，对黄嘌呤的Km值为0.09μM，转化数为5.88s-1，比活力为5.06U/mg蛋白。对以NAD作为电子受体时，最适pH为9，最适温度为50℃，对黄嘌呤的Km值为0.28μM，转化数为19.68s-1，对应的比活力为7.2U/mg蛋自。两种受体时比活力的比值为0.7，比野生型提高2.8倍(野生型两者的比值为0.25)。
本发明突出的有益效果在于：
所提供的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体，具有比鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶增强的黄嘌呤氧化酶活性，可以利用分子氧作为电子受体反应，降解病毒唑等核苷类药物生产过程中产生的次黄嘌呤等副产物，也可以拓展至其它催化底物，例如其它嘌呤、蝶啶、杂环分子和醛类在内的多种底物的氧化反应，和亚甲基蓝、苯醌、高铁氰化物和硝酸盐等多种类型的电子受体，进一步将该变异黄嘌呤氧化酶应用于生物传感器领域。
附图说明
图1为纯化的重组黄嘌呤脱氢酶突变体SDS-PAGE电泳图。泳道M：标准蛋白Marker，条带大小分别为245kDa，180kDa，135kDa，100kDa，75kDa，63kDa和48kDa；泳道1：突变体F296L；泳道2：突变体Y351A；泳道3：突变体E388Insert；泳道4：S392A
图2为纯化的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体降解黄嘌呤底物酶活检测体系的吸光度随时间变化图，这是基于产物尿酸的检测法。F296L、Y351A、E388Insert和S392A为鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体。以图例中E388Insert-xanthine为例说明反应条件，为鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体E388Insert以黄嘌呤(xanthine)为底物的降解反应。.
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、试剂盒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
基因来源菌株为(Acinetobacter baumannii)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌株编号为CICC10254。
pTrc99A为中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心Biovector Science Lab，Inc.产品，产品目录号为Biovector 108321(GenBank登录号为M22744.1，Amann,E.,Ochs,B.andAbel,K.J.Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression ofunfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene,1988,69(2):301-315.)。
重组质粒pTRAN为表达野生型鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的重组质粒，其是通过将如序列表中序列4所示的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶基因、在5’端引入6X组氨酸纯化标签编码序列后，***pTrc99A载体NcoI和Hind III双酶切位点得到的载体。来自申请人前期申请的专利申请(申请号201510406718.5，发明人邢新会、王成华、张翀、苏楠，一种碱性黄嘌呤脱氢酶及其在检测试剂盒中的应用)，即为该专利申请中实施例1制备的重组质粒pTRAN。
镍离子金属鳌合亲和层析介质-
黄嘌呤和NAD为Sigma公司产品，产品目录号分别为Sigma X7375-10g和SigmaN1636。
下述实施例中的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体均是指实施例1制备的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体，其组成小亚基和大亚基分别简记为ɑ亚基(XDHA)，β亚基(XDHB)。
实施例1
鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的制备
一、鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体重组质粒的构建
1、突变位点的选择及突变引物的设计
黄嘌呤脱氢酶与黄嘌呤氧化酶根本区别在于电子受体区域结构差异，造成氧化还原环境的不同从而对NAD及氧气造成不同的选择性。本发明选择对电子受体区域氧化还原电势贡献较大的F296、Y351、E388、S392位点进行定点突变，构建利用氧气作为电子受体活性增强的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体。
采用PCR引物介导的突变方法，以重组质粒pTRAN为模板构建突变体，所设计引物序列如下:
在F296位点构建突变体的引物对:
F296L-S:5’-GCAGCGCCGTCTGGCTTCCATGCCGATTAAAAATGCAG-3’(序列6)
F296L-A:5'-GCATGGAAGCCAGACGGCGCTGCAATTCTTGAAAGTC-3'(序列7)
在Y351位点构建突变体的引物对:
Y351A-S:5’-TTATTTAGACGCACAAAAAACAGCATTACGACTTGGTGAG-3’(序列8)
Y351A-A:5'-CTGTTTTTTGTGCGTCTAAATAAAAGTCTTCCAAAGCAATTTC-3'(序列9)
在E388位点构建突变体的引物对:
E388Insert-S:
5’-TCTGCGGTCTGCTACAAATTGTCGAAAAGGTTCGAACAAGATATTTCTGCGGTATGTGC-3’(序列10)
E388Insert-A:
5'-TCGACAATTTGTAGCAGACCGCAGAAATGTCCTGCTCAAAACGTTTGGCAATTTTATAG-3'(序列11)
在S392位点构建突变体的引物对:
S392A-S:5’-GCAAGATATTGCAGCGGTATGTGCAGCCATTTCATG-3'(序列12)
S392A-A:5’-CACATACCGCTGCAATATCTTGCTCAAAACGTTTGGCAAT-3'(序列13)
2、PCR产物的扩增
以pTRAN重组质粒DNA为模板，以上述1合成的上游引物E388Insert-S和下游引物E388Insert-A为引物，进行PCR扩增，得到长度为9kb的全质粒PCR产物，即为表达在E388位点与D389位点之间***GHFCGLLQLSKRFEQ多肽氨基酸片段的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的重组质粒全长片段。
25ul PCR反应体系：1ng质粒总DNA，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，5μl 5XPrimeSTAR Reaction buffer，2ul dNTPs(各2.5mM)，0.25U PrimeSTAR DNA polymerase，ddH20补齐至25μl。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；98℃10s，68℃9min，循环25次；最后68℃退火2min。
3、PCR产物的转化
将上述获得的PCR产物加入10UDpnI酶，于37℃水浴温浴1h以消解掉甲基化的模板质粒。然后采用常规分子生物学操作，取10μl消化后的产物直接转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，转化产物涂布含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基，倒置于37℃恒温培养箱培养16h。
4、鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体重组质粒的筛选
将上述转化产物挑取重组菌单菌落，接种于10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养至0D600为0.6左右，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。将诱导培养的菌液，以9000r/min、15min、4℃离心，收集沉淀，得到诱导表达的工程菌，沉淀重悬于600μl的磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH7.4)中，得到菌悬液。向菌悬液中加入20μl溶菌酶(100mg/ml)，37℃水浴温育2h，破胞液于12000r/min、4℃下离心30min，上清液为粗酶液。采用下述方法进行粗酶液黄嘌呤氧化酶活性的测定：
构建2ml如下反应体系：100mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.5)，1ml；10mM EDTA(pH8.5)，0.20ml；10mM氧嗪酸钾水溶液，0.02ml；20mM黄嘌呤溶液，0.01ml；ddH20，0.67ml；0.1U/ml粗酶液，0.1ml。
除酶液最后加入外，其余样品不限加入顺序。将反应体系中除鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体水溶液外的其余试剂混匀后，置于40℃水浴温浴5min，然后加入100μl鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体水溶液启动反应。在40℃条件下边反应边记录3-5min内反应体系0D295吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(Δ0D295/min)。
对具有酶活的阳性克隆抽提质粒进行测序验证，结果质粒为将序列表中序列5所示的DNA分子替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRX0388，即为产鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的重组质粒，表达鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体，记为E388Insert。E388Insert在E388位点与D389位点间***一段长度由GHFCGLLQLSKRFEQ组成的15AA氨基酸肽段。
序列表中序列号5所示的DNA分子，自5’末端起第1位至第1545位核苷酸所示的DNA分子编码ɑ亚基，其氨基酸序列如序列3所示，大小约为56kDa，第1547位至第3922位核苷酸所示的DNA分子编码β亚基，其氨基酸序列如序列2所示，大小为87kDa，第3929位至第4912位编码活性黄嘌呤脱氢酶必须的伴倡蛋白序列，该伴侣蛋的氨基酸序列如序列14所示，大小为37kDa。
采用相同的方法，分别用F296L-S和F296L-A PCR扩增构建F296位点的突变体及其重组质粒pTRX0296；用Y351A-S和Y351A-A构建Y351位点的突变体及其重组质粒pTRX0351；用S392A-S和S392A-A构建S392位点的突变体及其重组质粒pTRX0392；pTRX0296的结构描述为：将“将序列表中序列4的第886-888位的ttt替换为ctg后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒Ncol和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒。pTRX0351的结构描述为：将“将序列表中序列4的第1051-1053位的tat替换为gca后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒。pTRX0392的结构描述为：将“将序列表中序列4的第1174-1176位的tct替换为gca后所得序列所示的DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒。
二、鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的纯化
1、将上述步骤一得到的pTRX0388转化大肠杆菌DH5ɑ，得到重组菌，挑取重组菌单菌落，接种于5ml含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养过夜。将过夜培养的菌液，按照1％的接种量转接于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220r/min条件下培养，待菌液培养至0D600为0.6左右，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导剂，同样条件下继续诱导培养16h。
2、将步骤1得到的菌液在9000r/min的条件下离心15min，收集沉淀，得到诱导表达的工程菌，菌体重悬于30ml的磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH7.4)中，得到菌悬液，将菌悬液通过超声细胞破碎仪(南京先欧仪器制造有限公司X0-400SD)破胞，超声1s，休息2s，超声20min，细胞破碎液于4℃下12000r/min离心30min，上清液为粗酶液。
3、金属螯合层析法纯化鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体
(1)在上述2获得的粗酶液用0.22μm滤膜过滤，得到滤液；
(2)将总体积为30ml的滤液上样至
将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体E388Insert进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果如图1所示，结果表明，E388Insert由大小约为56kDa的小亚基和大小约为87kDa的大亚基这两种亚基组成。纯化酶中不含有大小约为37kDa的伴侣蛋白。
采用同样的方法对鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体F296L、Y351A和S392A进行表达和纯化，SDS-PAGE检测结果同样列于图1，结果表明，F296L、Y351A和S392A均由大小约为56kDa的小亚基和大小约为87kDa的大亚基这两种亚基组成。
实施例2
鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体作为黄嘌呤氧化酶以及黄嘌呤脱氢酶的表征。
一、黄嘌呤氧化酶酶活的测定方法
基于黄嘌呤氧化酶催化如下反应(反应式1和2)，尿酸在295nm处有特异性吸收，因此可以通过分光光度法测定产物尿酸的生成对酶活进行表征。
本发明中，黄嘌呤氧化酶酶活性测定的反应体系如表1所示。
表1黄嘌呤氧化酶酶活测定的2mL反应体系组成
表1中除酶液最后加入外，其余样品不限加入顺序。将反应体系中除鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体水溶液外的其余试剂混匀后，置于40℃水浴温浴5min，然后加入100μl鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体水溶液启动反应。在40℃条件下边反应边记录3-5min内反应体系0D295吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(Δ0D295/min)。
按照下述公式计算所检测的黄嘌呤氧化酶的酶活和比酶活。
酶活(U/ml)＝Δ0D295/min X1.6Xdf (公式1)
比酶活(U/mg)＝(U/ml)X1/C (公式2)
公式1中1.6为采用消光系数法将上述2ml反应体系中尿酸从吸光度变化转化为摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为:
其中:Vt为反应总体积(2.0ml)，Vs为反应体系中酶液体积(0.1ml)，12.5为测定条件下尿酸的摩尔消光系数(cm2/μmol)，1.0cm为测定比色杯光程。
公式1中df为酶液稀释倍数。
公式2中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。
酶活力单位(U)定义：在测定温度和pH值条件下每分钟转化生成lμmol尿酸所需要的酶量。
二、黄嘌呤脱氢酶酶活的测定方法
基于黄嘌呤脱氢酶催化如下反应(反应式4和反应式5)，可以通过产物尿酸的生成速度对酶活进行精确表征。因为尿酸在295nm处有特异性吸收，本发明通过分光光度法对酶活性进行测定。
2mL黄嘌呤脱氢酶酶活性的测定反应体系如表2所示。
表2黄嘌呤脱氢酶酶活测定的2mL反应体系组成
表2中除酶液最后加入外，其余样品不限加入顺序。将反应体系中除鲍氏不动杆菌鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体水溶液外的其余试剂混匀后，置于40℃水浴温浴5min，然后加入100μl鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体水溶液启动反应。在40℃条件下边反应边记录3-5min内反应体系0D295吸光值变化，计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间变化速率(Δ0D295/min)。
按照下述公式计算所检测的黄嘌呤脱氢酶的酶活和比酶活。
酶活(U/ml)＝Δ0D295/min X1.6Xdf (公式1)
比酶活(U/mg)＝(U/ml)X1/C (公式2)
公式1中1.6为采用消光系数法将上述2mI反应体系中尿酸从吸光度变化转化为摩尔浓度的计算系数，该系数计算方法为:
其中:Vt为反应总体积(2.0ml)，Vs为反应体系中酶液体积(0.1ml)，12.5为测定条件下尿酸的摩尔消光系数(cm2/μmol)，1.0cm为测定比色杯光程。
公式1中df为酶液稀释倍数。
公式2中C为酶液的浓度，单位为mg/ml。
酶活力单位(U)定义：在测定温度和pH值条件下每分钟转化生成lμmol尿酸所需要的酶量。
三、最适温度和最适pH的测定
以黄嘌呤为底物时，特别检测实施例1中制备的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体分别作为黄嘌呤脱氢酶及黄嘌呤氧化酶时的最适pH和最适温度。
最适温度的测定通过按照表1(黄嘌呤氧化酶活性)和表2(黄嘌呤脱氢酶活性)构建200μl反应体系，分别置于30-80℃区间范围内测定酶活，最适温度用相对酶活的最大值对应的温度表示。
最适pH值通过测定pH 3.5-11.0范围内缓冲体系下相对酶活，用最大酶活对应的pH值表示。具体是分别将表1(黄嘌呤氧化酶活性)和表2(黄嘌呤脱氢酶活性)中反应体系中最终浓度为0.05mol1/L的pH8.5Tris盐酸缓冲溶液分别替换为pH 3.5-5.5的0.05mol/L乙酸缓冲体系、pH 6-7.5的0.05mol/L磷酸缓冲体系、pH 8-9.5的0.05mol/L Tris盐酸缓冲体系和pH 10-11.0的0.05mol/L的碳酸钠缓冲体系进行测定。
结果如表3所示，各鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体作为黄嘌呤脱氢酶时，变异酶F296L的最适pH为7.5，比野生型降低1个pH单位；最适温度为50℃，比野生型提高10℃；变异酶S392A的最适pH为7，比野生型降低1.5个pH单位；最适温度为45℃，比野生型提高5℃；变异酶Y351A和E388Insert的最适温度与野生型一致，为40℃；其中变异酶Y351A的最适pH为9，比野生型提高0.5个pH单位；变异酶E388Insert的最适pH为7，比野生型降低1.5个pH单位；
结果如表3所示，各鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体作为黄嘌呤氧化酶时，变异酶F296L和S392A的最适pH为9，比野生型提高0.5个pH单位；最适温度为50℃，比野生型提高10℃；变异酶E388Insert的最适pH为7，比野生型降低1.5个pH单位；最适温度为45℃，比野生型提高5℃；变异酶Y351A的最适温度与野生型一致，为40℃；最适pH为9，比野生型提高0.5个pH单位。
表3鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体与野生型的部分酶学参数
四、酶促动力学参数
按照上述步骤一和二中所述方法测定实施例1的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体的黄嘌呤氧化酶和黄嘌呤脱氢酶活性。在最适温度和最适pH条件下，0.05-1mM浓度范围，各鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体降解黄嘌呤的最初反应速度符合米氏动力学方程。按照米氏方程进行非线性拟合，结果如表3所示，相对于野生型酶作为黄嘌呤脱氢酶，利用氧气作为电子受体的氧化酶活性是利用NAD作为电子受体的脱氢酶活性的25％；本发明提供的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体F296L、Y351A、E388Insert和S392A均具有更强的利用空气中氧气作为电子受体催化底物黄嘌呤氧化的功能，五者氧化酶与脱氢酶(XOD/XDH)活性之比分别为156％、194％、430％和70％，相对于野生型分别提高了6.24倍、7.76倍、17.2倍和2.8倍，而对应的催化效率分别提高了9.6倍、0.94倍、10.1倍和23.85倍。
实施例3
鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体作为黄嘌呤氧化酶在降解黄嘌呤和次黄嘌呤以及处理含该类底物的材料中的应用
参照表1中黄嘌呤氧化酶反应体系的构建方法，构建如下a)至d)4组反应体系：
a)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤和1.05mg/L实施例1制备的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体F296L；
b)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤和1.12mg/L实施例1制备的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体Y351A；
c)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤和1.36mg/L实施例1制备的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体E388Insert；
d)50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.5)，分别含终浓度为1mM的EDTA，0.1mM的氧嗪酸钾，0.1mM的黄嘌呤和1.55mg/L实施例1制备的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体S392A；
分别将上述a)至d)4组反应体系中除酶外的所有试剂加入并混匀，置于40℃水浴中温浴5min，然后加入相应的纯化酶液启动反应，利用带有加热模块的分光光度计将反应温度控制在40℃条件下，边反应边记录反应3-5min内295nm下吸光值变化，绘制吸光度(Δ0D295)随时间变化的关系曲线、并计算反应曲线最初线性部分的吸光度随时间的变化速率(Δ0D295/min)，通过尿酸变化检测底物黄嘌呤的降解情况。
将a)至d)4组实验结果列于图2中。图2中表明：
以0.1mM黄嘌呤或次黄嘌呤为底物时，a)至d)4组反应体系下的最大吸光度变化速度(Δ0D295/min)分别为0.00492、0.01524、0.02038、0.03124。
因此，相对于野生型基本不能利用空气中氧气作为电子受体，而依赖于利用NAD作为电子受体，本发明提供的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体F296L、Y351A、E388Insert和S392A均可以利用空气中氧气作为电子受体生成H202，氧化降解黄嘌呤和次黄嘌呤生成尿酸。
以上公开了较佳实施例，但其并非用以限定本发明，应当理解的是，采用本领域熟知的技术，在不脱离本发明的精神和范围内，所作出的任何改动与修饰，都属于本发明权利要求书中界定保护的范围。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用
<130> 2019.11.1
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 505
<212> PRT
<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
<400> 1
Met His His His His His His Leu Glu Arg Pro Ile Thr Phe Phe Phe
1 5 10 15
Arg Gly Gly Gln Gln Gln Val Glu Ser Val Ile Pro Thr Met Thr Val
20 25 30
Leu Gln Phe Leu Arg Glu Tyr Ile Gln Thr Gly Lys Thr Arg Gln Thr
35 40 45
Ala Thr Lys Glu Gly Cys Ala Glu Gly Asp Cys Gly Ala Cys Thr Val
50 55 60
Val Ile Gly Glu Leu Val Asn Asp Asn Leu Gln Leu Arg Ser Val Asn
65 70 75 80
Ala Cys Ile Gln Phe Leu Pro Thr Leu Asp Gly Lys Ala Leu Phe Thr
85 90 95
Val Glu Gly Leu His Ser Leu Leu Pro Val Gln Asp Gly Thr Leu His
100 105 110
Pro Val Gln Gln Ala Met Val Asp Met His Gly Ser Gln Cys Gly Phe
115 120 125
Cys Thr Pro Gly Phe Ile Ile Ser Leu Trp Ser Met Tyr Glu Asn Glu
130 135 140
Gln His Ser Pro Ser Lys Asp Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Ser Gly Asn
145 150 155 160
Leu Cys Arg Cys Thr Gly Tyr Arg Pro Ile Leu Asp Ala Ala Gln Lys
165 170 175
Ala Tyr Asp Tyr Pro Arg Val Val Leu Glu Arg Gln Lys Val Ile Asp
180 185 190
Val Leu Lys Glu Ile Arg Thr Leu Pro Ala Leu His Leu Asn Asp Gln
195 200 205
Lys Gln Gln Phe Phe Ala Pro Lys Thr Leu Gln Asp Phe Ala Thr Leu
210 215 220
Arg Leu Gln Leu Pro Gln Ala Arg Ile Val Ala Gly Ser Thr Asp Val
225 230 235 240
Gly Leu Trp Val Thr Lys Gln Gly Arg Asn Leu Gly Asp Met Leu Tyr
245 250 255
Ile Gly Gln Val Glu Glu Leu Lys Lys Ile Val Val Thr Asp His Ala
260 265 270
Leu Thr Ile Gly Ala Asn Val Ser Leu Ser Asp Ala Leu Ile Lys Ile
275 280 285
Ser Asp Phe Tyr Ser Asp Phe Gln Glu Leu Gln Arg Arg Phe Ala Ser
290 295 300
Met Pro Ile Lys Asn Ala Gly Thr Leu Gly Gly Asn Ile Ala Asn Gly
305 310 315 320
Ser Pro Ile Gly Asp Ser Met Pro Ala Leu Ile Thr Leu Gly Thr Gln
325 330 335
Leu Ile Leu Arg Val Gly Glu Gln Thr Arg Glu Ile Ala Leu Glu Asp
340 345 350
Phe Tyr Leu Asp Tyr Gln Lys Thr Ala Leu Arg Leu Gly Glu Phe Val
355 360 365
Glu Ala Ile Val Ile Pro Ser Arg Glu Gly Gln Thr Arg Phe Lys Phe
370 375 380
Ala Ser Tyr Lys Ile Ala Lys Arg Phe Glu Gln Asp Ile Ser Ala Val
385 390 395 400
Cys Ala Ala Ile Ser Cys Asp Leu Asp Asn Asp Asp Val Ala His Asn
405 410 415
Val Arg Ile Ala Phe Gly Gly Met Ala Ala Ile Pro Lys Arg Ala Lys
420 425 430
Tyr Ala Glu Ala Ile Leu Glu Gly Gln Gln Ile Thr Ala Glu Leu Ile
435 440 445
Val Gln Ala Gln Gln Ala Leu Ser Gln Asn Tyr Gln Pro Leu Asp Asp
450 455 460
Gly Arg Ala Ser Ser Ala Tyr Arg Leu His Val Ala Lys Asn Cys Leu
465 470 475 480
Gln Arg Phe Tyr Val Glu Lys Ile Leu Ser Gln Thr Leu Thr Arg Val
485 490 495
Asn Asp Leu Ile Ala Met Val Glu Ile
500 505
<210> 2
<211> 791
<212> PRT
<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
<400> 2
Met Asn Gln Thr Ile Asp Leu Asn Ile Ser Lys Lys Ser Ala Lys Ala
1 5 10 15
Gly Asp Ser Ile Pro His Glu Ser Ala His Leu His Val Thr Gly Gln
20 25 30
Ala Thr Tyr Ile Asp Asp Leu Pro Glu Leu Glu Asn Thr Met His Leu
35 40 45
Ala Val Gly Phe Ser Asn Cys Ala Lys Gly Lys Ile Ser Lys Phe Asp
50 55 60
Leu Asp Ala Val Arg Gln Ala Glu Gly Val Tyr Ala Val Phe Ser Ala
65 70 75 80
Lys Asp Ile Glu Val Glu Asn Asn Trp Gly Pro Ile Val Lys Asp Asp
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Pro Ile Phe Ala Glu Glu Gln Val Glu Phe Tyr Gly Gln Ala Leu Phe
100 105 110
Val Val Val Ala Glu Ser Tyr Gln Gln Ala Arg Gln Ala Val Arg Leu
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Ala Lys Ile Glu Tyr Val Pro Glu Thr Pro Ile Leu Thr Ile Gln Asp
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Ala Ile Lys Lys Glu Ser Trp Val Leu Pro Pro Val Glu Phe Ser His
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Gly Glu Val Glu Gln Ala Phe Gln Asn Ala Ala His Gln Leu Ser Gly
165 170 175
Thr Ile Glu Leu Gly Gly Gln Glu His Phe Tyr Leu Glu Gly Gln Ile
180 185 190
Ser Tyr Ala Ile Pro Gln Glu Asn Gln Ser Leu Lys Val Tyr Cys Ser
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Met Asn Met His Gln Val Ser Val Glu Ser Arg Arg Met Gly Gly Gly
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Phe Gly Gly Lys Glu Ser Gln Ser Ala Gln Trp Ala Cys Ile Ala Ser
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<211> 519
<212> PRT
<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
<400> 3
Met His His His His His His Leu Glu Arg Pro Ile Thr Phe Phe Phe
1 5 10 15
Arg Gly Gly Gln Gln Gln Val Glu Ser Val Ile Pro Thr Met Thr Val
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Leu Gln Phe Leu Arg Glu Tyr Ile Gln Thr Gly Lys Thr Arg Gln Thr
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Leu Cys Arg Cys Thr Gly Tyr Arg Pro Ile Leu Asp Ala Ala Gln Lys
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515
<210> 4
<211> 4885
<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
<400> 4
atgcatcatc accatcacca tttagaacgt ccaatcacct tcttttttcg tggtggtcag 60
cagcaagtag aaagtgtaat acctacaatg acggttttac aatttctgcg agagtatatt 120
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<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
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<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
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Gly Gly Val Met Trp Leu Leu Phe Glu Lys Ile Ser Pro Ala Thr Val
100 105 110
Thr Ser Asp Leu Ser Met Ser Leu Gln Ala Trp Arg Ala Gly Arg His
115 120 125
Ile Trp Arg Thr Val Ser Asn Gln Tyr Ala Ser Thr Trp Gln Thr Met
130 135 140
Asp Ile Lys Gln Gln Pro Ser Phe Glu Phe His Pro Val Asn Ser Glu
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Glu Trp Gln Phe Gly Gln Gln Ile His Pro Tyr Ala Met Gln Val Leu
165 170 175
Ile Cys Gly Ala Gly His Val Gly Glu Ala Ile Val Arg Cys Leu Leu
180 185 190
Pro Ile Gly Val Arg Val Lys Trp Ile Asp Pro Arg Asp Asp Ile Phe
195 200 205
Pro Ser Asp Leu Leu Glu Gln Val Gln Cys Leu Thr Thr Asp Thr Leu
210 215 220
Asp Ala Glu Ile Glu His Phe Asp Arg Leu Gly Ala Ile Leu Ile Leu
225 230 235 240
Thr His Asp His Gln Leu Asp Leu Gln Leu Cys Phe Ser Ala Leu Lys
245 250 255
Pro Ala Ala Lys Pro Phe Ala Tyr Val Gly Met Ile Gly Ser Lys Ser
260 265 270
Lys Arg Ala Ile Phe Glu Lys Arg Met Gln Ile Arg Gly Tyr Thr Gln
275 280 285
Glu Thr Leu Gln Arg Leu Val Cys Pro Ile Gly Val Glu Gly Ile Ser
290 295 300
Ser Lys Gln Pro Ala Met Ile Ala Ile Ala Val Val Ala Gln Leu Leu
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Gln Val Phe Asp Val Lys Lys
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<210> 15
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<212> DNA
<213> 鲍氏不动杆菌(A.baumannii)
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gtagtcacag accatgcttt aacgattgga gcaaatgtaa gtttgagcga tgcactcatt 840
aaaatttcag atttttattc cgactttcaa gaattgcagc gccgttttgc ttccatgccg 900
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aacgattcaa gatgcaatta aaaaagaatc gtgggtgtta ccgcctgttg aatttagcca 1980
tggtgaagtt gaacaggcat ttcaaaacgc agcccatcaa ctttctggaa ccattgagct 2040
gggtgggcaa gagcattttt atcttgaagg acagatttct tatgcgattc cacaagaaaa 2100
tcagagttta aaagtctatt gctcgacaca acatccaacc gaaatgcagt tactgatttg 2160
tcatgcatta ggcatgaata tgcatcaggt aagtgtggaa agtcgccgta tgggtggcgg 2220
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gcaaggcatg tttgtcatcg aaaatattat tgatgacatt gctcgttatt taggttgtga 2640
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gcattacaat caggcaggtg cactggtcta tgtctacatg gatggcactg tcgcgattac 2940
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aaaatga 4867