阅读说明：本技术 一种生产胰蛋白酶的方法 (Method for producing trypsin ) 是由 王兴吉 郭庆文 王克芬 伏圣秘 刘胜利 刘文龙 张�杰 于 2019-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物或酶工程领域,具体涉及一种生产胰蛋白酶的方法。该方法使用的发酵菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79,保藏号为CGMCC No.18646,发酵液中酶活达到252U/mL至260U/mL之间,通过提取、精制获得的胰蛋白酶液体酶制剂的酶活达到1000U/mL以上。得到的胰蛋白酶最适pH范围为7.5-9.0,最适作用温度范围为35℃-60℃,并且在55℃保温1h后剩余酶活为92％,保温2h后剩余酶活为85％,具有显著的耐热性,可广泛应用到高温工业生产中,大大地拓宽了胰蛋白酶的应用范围,增加了胰蛋白酶的应用价值。(The invention belongs to the field of microorganism or enzyme engineering, and particularly relates to a method for producing trypsin. The fermentation strain used in the method is Streptomyces sp LDE-79 with the preservation number of CGMCC No.18646, the enzyme activity in the fermentation broth reaches between 252U/mL and 260U/mL, and the enzyme activity of the trypsin liquid enzyme preparation obtained by extraction and refining reaches over 1000U/mL. The obtained trypsin has the optimum pH range of 7.5-9.0, the optimum action temperature range of 35-60 ℃, the residual enzyme activity of 92% after heat preservation for 1h at 55 ℃ and 85% after heat preservation for 2h, has obvious heat resistance, can be widely applied to high-temperature industrial production, greatly widens the application range of the trypsin, and increases the application value of the trypsin.)

一种生产胰蛋白酶的方法

技术领域：

本发明属于微生物或酶工程领域，具体涉及一种生产胰蛋白酶的方法。

背景技术：

胰蛋白酶(Trypsin，EC 3.4.21.4)属于丝氨酸蛋白酶类，有丝氨酸蛋白酶的典型特征，即具备由组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸氨基酸残基所组成的催化三联体。而胰蛋白酶能通过专一的断开精氨酸或赖氨酸羧基端肽键来降解多肽链，并能激活其他胰腺中的酶原。由于其最适催化作用pH在7.0以上，所以胰蛋白酶是一种碱性蛋白酶。胰蛋白酶是一种工业上常用蛋白酶，在医药领域、皮革加工、农业生产及食品加工等领域均发挥着重要应用。

目前，被广泛应用的商品化胰蛋白酶多数来自于动物胰腺，但诸多的缺陷或限制制约了其的应用。从动物的胰腺中提取胰蛋白酶，是胰腺提取胰岛素的副产品，但随着胰岛素的基因工程化生产，使单纯从胰腺中提取获取胰蛋白酶的成本大大增加。

另外，胰腺中还含有较复杂的消化酶系，不可避免地降低了胰蛋白酶的纯度(例如胰凝乳蛋白酶等)，或者需要通过增加成本进行纯化。动物源胰蛋白酶还存在携带动物性病毒的隐患，异味重以及宗教等限制性问题，从而在一定程度上阻碍其在商品化中的应用。与动物源胰蛋白酶相比，由于微生物生长迅速、培养成本低，能在相对较短的时间合成大量目标产物，使微生物源胰蛋白酶有着无法比拟的优势。此外，微生物胰蛋白酶在性质上也呈现出多样性，拓宽了胰蛋白酶的应用领域。并且还可通过基因工程技术，在分子尺度改善酶的产量与催化特性。

然而，目前微生物源胰蛋白酶由于催化活力不高和发酵水平低等限制因素，使其并没有很好的工业中得到应用。因此所以选育一株高产胰蛋白酶的菌株和发酵方法，使其发酵产品耐热性良好，催化作用pH范围较宽，生产成本较低廉，能够大规模机械化生产等具有极大的意义。

发明内容

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本发明的目的是提供一株高产热稳定胰蛋白酶的链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79及其发酵产酶方法，在确保链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79发酵高产胰蛋白酶稳定性的同时，胰蛋白酶又具备优良的耐热特性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一株高产胰蛋白酶的链霉菌，所述菌株具体为链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79，该菌株己于2019年10月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC No.18646。

所述链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79是原始菌株LDE-A7通过常温常压等离子体诱变选育获得的一株高产热稳定胰蛋白酶的突变菌株LDE-79；菌落形态特征：菌落圆形、菌落较厚、菌丝体为灰白色、褶皱；中央凸起，粉质状。

本发明的另一目的在于提供上述链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79的发酵生产胰蛋白酶的方法，主要包括以下步骤：

发酵培养：将扩大培养后的种子液按照体积比10-15％的接种比例接入到发酵培养基中，30-32℃，转速400-800r/min，设置通风量：0h至6h为0.4-0.5vvm、6h至15h为0.6-0.8vvm，20h至发酵结束为1.0-1.2vvm，发酵过程通过协调补加补料培养基、或液氨、或磷酸来控制发酵液pH，使其维持在7.5～7.8范围内，发酵培养至酶活增长缓慢或不在增长，菌体变形、自溶时结束发酵，发酵周期为120-128h；发酵结束时发酵液中胰蛋白酶酶活达到252U/mL至260U/mL；

将最终发酵液通过提取、精制工艺，制得胰蛋白酶成品酶制剂。

所述发酵培养基组成为(g/L)：豆饼粉20，葡萄糖20，玉米浆20，硫酸镁1，磷酸二氢钾1，余量为水，pH7.5，121℃灭菌30min；

所述补料培养基组成为(g/L)：玉米浆40，玉米粉液化液120，磷酸二氢钾1，氧化钙0.3，余量为水，pH7.5，121-123℃灭菌30min；

所述胰蛋白酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液加0.1％双乙酸钠防腐剂，再加入5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用10000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在所述浓缩液中加入质量百分比30％(m/v)稳定剂、0.3％(m/v)防腐剂，调节pH7.5，然后进行过除菌膜除菌，即得到胰蛋白酶成品液体酶制剂。

优选地，所述稳定剂为重量比2:1的甘油和山梨糖醇，所述防腐剂为质量比为1：1的山梨酸钾和双乙酸钠。

本发明所产的胰蛋白酶酶学性质如下：

(1)最适作用pH范围为7.5-9.0，最适pH为8.0；

(2)最适作用温度范围为35℃-60℃，最适温度为50℃；

(3)温度稳定性：55℃保温1h后剩余酶活为92％，55℃保温2h后剩余酶活为85％。

有益效果：

本发明通过对原始菌株LDE-A7进行常温常压等离子体诱变选育了一株高产热稳定胰蛋白酶的突变菌株链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79，并对链霉菌(Streptomycessp.)LDE-79发酵过程进行50L发酵罐补料条件优化，使其最终发酵液中酶活达到252U/mL至260U/mL之间，通过提取、精制获得的胰蛋白酶液体酶制剂的酶活达到1000U/mL以上。而链霉菌LDE-79原始菌株LDE-A7通过50L发酵罐补料发酵最终发酵液中最高酶活为120U/mL。由此可以看出链霉菌LDE-79显著高于链霉菌LDE-A7原始菌株的酶活。

本发明菌株的发酵方法中所采用的的培养基均属于成本较低的原料，在提高单批次发酵水平和生产效率的同时，大大降低了发酵成本，对工业规模化生产具有极大的促进作用。

链霉菌LDE-79发酵得到的胰蛋白酶最适pH范围为7.5-9.0，最适pH为8.0，最适作用温度范围为35℃-60℃，最适温度为50℃。并且在55℃保温1h后剩余酶活为92％，保温2h后剩余酶活为85％，具有显著的耐热性，可广泛应用到高温工业生产中，大大地拓宽了胰蛋白酶的应用范围，增加了胰蛋白酶的应用价值。

附图说明：

图1：不同pH下的相对酶活：

图2：不同温度下的相对酶活：

图3：55℃下保温0-3h后的相对酶活。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所知晓的常规方法；

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79的诱变

取原始菌株LDE-A7转接到的新鲜的固体培养基上，30℃恒温培养至长出菌落，用接种环将孢子刮取到盛有玻璃珠的三角瓶中，振荡使孢子分散，制备孢子悬浮液，孢子浓度控制在10⁷-10⁸个/ml。

开启ARTP系统，用酒精对操作室内外杀菌消毒，并开启紫外灯进照射杀菌，待灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，在无菌条件下将移至操作室台内。开启阀门，通入氮气，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为20s、30s、40s、50s、60s。每次诱变结束后将诱变后的孢子转移到盛有无菌生理盐水的EP管中，离心收集孢子。

实施例2菌株的筛选

诱变选育培养基如下：

固体初筛培养基(g/L)：脱脂奶粉20，氯化钠1，硫酸镁0.2，琼脂20，余量为水，pH7.5；

固体划线培养基(g/L)：蛋白陈10，葡萄糖20，氯化钠1，琼脂20，余量为水，pH值7.5；

摇瓶复筛培养基：蛋白陈12，酵母膏5，硫酸钠0.8，硫酸镁0.5，氧化钙0.3，磷酸氢二号钠0.5，余量为水，pH7.5，121℃灭菌20min。

将诱变后的孢子，稀释10³-10⁷倍，并涂布到固体初筛培养基上，置于30℃培养箱中培养。用透明圈法初步定性筛选透明圈大、形状、颜色具有典型特征的单菌落，并在固体划线培养基上进行划线分离纯化，反复3次后，挑取典型单菌落在固体培养基试管斜面上划线，30℃培养72h后于4℃冰箱中保存。

菌株摇瓶产酶复筛：将诱变后定性选出的菌株接种到摇瓶复筛培养基中再进行摇瓶发酵复筛，每株接5瓶，接种在含100mL产酶培养基的500mL三角瓶中，30℃，260r/min摇床培养62h，5000r/min离心5min收集上清检测酶活力。

通过摇瓶复筛选出5株发酵酶活较高的突变株；原始菌株与具有较高酶活的突变株的发酵液酶活如下表1。

实施例3对酶活最高LDE-79菌株进行遗传稳定性试验

将LDE-79菌株在平板上连续划线传代培养，并分别取种子接至摇瓶培养基中，30℃，260r/mim培养72h，取发酵液，5000r/min离心5分钟，取上清在25℃，pH8.0条件下测酶活。该菌传代10次摇瓶发酵活力如下表2。

实施例4链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79发酵产酶

链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79的发酵产酶方法，主要包括以下步骤：

斜面培养：挑取一环突变的链霉菌LDE-79接种到固体斜面培养基，在30℃下恒温培养36h；

摇瓶培养：取一环斜面培养的菌株接入种子培养基中，恒温30℃，摇床转速260r/min条件下培养36h，获得种子液；

种子扩大培养：将摇瓶种子按照体积比5％的接种量比例转接到种子罐中，培养温度30℃，转速600r/min条件下继续培养18h；

发酵培养：将扩大培养后的种子液按照体积比10％的接种量比例接入到发酵培养基中，在30℃，转速600r/min，设置通风量：0h至6h为0.4vvm、6h至15h为0.8vvm，20h至发酵结束为1.2vvm，发酵过程通过协调补加补料培养基、液氨、磷酸来控制发酵液pH，使其维持在7.5～7.8范围内，发酵培养至酶活增长缓慢或不在增长，菌体变形、自溶时结束发酵，发酵周期为128h，发酵结束时，发酵液中胰蛋白酶酶活达到260U/mL.

将最终发酵液通过提取、精制工艺，制得胰蛋白酶成品酶制剂。

上述培养过程所使用培养基如下：

固体斜面培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15，余量为水，自然pH，121℃灭菌20min；

种子培养基(g/L)：蛋白陈12，酵母膏5，硫酸钠0.8，硫酸镁0.5，氧化钙0.3，磷酸氢二号钠0.5，余量为水，pH7.5，121℃灭菌20min；

种子罐培养基(g/L)：豆饼粉5，葡萄糖20，酵母膏12，磷酸二氢钾1.2，氧化钙0.3，余量为水，pH 7.5，121℃灭菌30min；

发酵培养基(g/L)：豆饼粉，20，葡萄糖20，玉米浆20，硫酸镁1，磷酸二氢钾1，余量为水，pH7.5，121℃灭菌30min；

补料培养基(g/L)：玉米浆40，玉米粉液化液120，磷酸二氢钾1，氧化钙0.3，余量为水，pH7.5，121-123℃灭菌30min；

所述胰蛋白酶的提取与精制方法如下：

先将最终发酵液加0.1％双乙酸钠防腐剂，再加入5％珍珠岩助滤剂，压滤得到澄清压滤酶液；

用10000分子量超滤膜对所述澄清压滤酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液；

在所述浓缩液中加入质量百分比30％(m/v)稳定剂、0.3％(m/v)防腐剂，调节pH7.5，然后进行过除菌膜除菌，即得到胰蛋白酶成品液体酶制剂。

所述稳定剂为重量比2:1的甘油和山梨糖醇，所述防腐剂为质量比为1：1的山梨酸钾和双乙酸钠。

实施例5链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79发酵性能验证

按照实施例4链霉菌(Streptomyces sp.)LDE-79发酵产酶及其所产胰蛋白酶的提取精制方法，进行50L发酵罐验证实验，发酵周期120-128h，其6批次的发酵产酶试验最终发酵液酶活(在25℃，PH8.0条件下)如下表3。表3数据表明菌株不仅高产胰蛋白酶而且其发酵水平具有显著的稳定性。

表3 6批次高产胰蛋白酶菌株的发酵产酶情况

发酵批次	发酵周期	最终发酵液活力U/ml
			F1	123h	254
F2	125h	258
			F3	120h	253
F4	124h	259
			F5	128h	260
F6	126h	256

实施例6本发明胰蛋白酶酶活测定方法

底物溶液的制备：用称取一定量的BAEE，溶于pH8.0的磷酸盐缓冲液中，配制浓度为0.2mM的BAEE底物待用。

具体测定方法：在25℃下，取3mL底物溶液加入1cm光径的石英比色皿中，加入0.2ml酶液，立即混匀，放入分光光度计中，以pH 8.0的磷酸盐缓冲液做空白，在253nm处检测吸光值，每隔30s读1次数，共5min。以时间(min)为横坐标，吸光值为纵坐标作图，进行线性拟合，其斜率即为吸光值每分钟变化率。测量过程中，时间与吸光值呈线性关系的时间不得少于3min，若不符要求，应调整酶液浓度，重新测量。

酶活定义：在一定温度和pH下，以BAEE为底物在253nm处的吸光值每分钟升高0.001为一个酶活单位。

其中：

V为酶液体积(ml)

n为稀释倍数

实施例7发酵产胰蛋白酶的最适作用pH范围

以本发明所产的胰蛋白酶，在50℃条件下，分别在不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)下测定酶活力，以pH8.0酶活为100％，绘制相对酶活力变化曲线，如图1所示，酶的最适作用pH范围为7.5-9.0，最适pH8.0。

实施例8发酵产胰蛋白酶的最适作用温度范围

以酶活力186U/mL的胰蛋白酶为测定对象，在pH为8.0条件下，分别在不同温度(25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃)下，测定酶活力，以50℃酶活为100％，绘制相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的最适作用温度范围为35℃-60℃，最适温度50℃。

实施例9胰蛋白酶的耐热性

以酶活力252U/mL的胰蛋白酶为测定对象，在pH为8.0条件下，55℃下保温3h，每30分钟取样在50℃，pH8.0条件下检测酶活，以初始酶活力为100％，绘制相对酶活力变化曲线，如图3所示，在55℃保温1h后剩余酶活为92％，55℃保温2h后剩余酶活为85％，具有良好的耐热性，可广泛应用于高温生产中，显著地拓宽了胰蛋白酶的应用范围，提高了胰蛋白酶的应用价值。