阅读说明：本技术 一种亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺 (A kind of technique that affinity chromatography prepares high purity chymotrypsin ) 是由 叶昀 林克 范伟伟 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺,其主要步骤包括：(1)取糜蛋白酶原,用去离子水溶解并调节pH值,加入高比活性的胰蛋白酶,低温酶解后的溶液离心得到酶解液；(2)制备低分子尿蛋白酶抑制剂亲和层析介质,然后装柱,并用0.1M Tris-Hcl,pH8.0缓冲液进行平衡,平衡后用酶解液上样；上样完毕后用平衡后的缓冲液冲柱,冲至流出液的OD<Sub>280</Sub>值小于0.1,然后换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl,pH2.2的缓冲液洗脱,收集洗脱峰；(3)超滤浓缩,然后过滤除菌；(4)除菌后的酶液装冻干盘,真空冷冻干燥,得到成品。本发明开发出了新的亲和层析法,可以一步从糜蛋白酶原粗品纯化糜蛋白酶,操作方便,专一性更好,糜蛋白酶效价更高。(The invention discloses the techniques that a kind of affinity chromatography prepares high purity chymotrypsin, its key step includes: that (1) takes chymotrypsinogen, with deionized water dissolving and pH value is adjusted, the trypsase of high specific acitivity is added, the solution after low temperature enzymatic hydrolysis is centrifuged to obtain enzymolysis liquid；(2) low molecule Ulinastatin affinity chromatography medium is prepared, then fills column, and with 0.1M Tris-Hcl, pH8.0 buffer is balanced, and enzymolysis liquid loading is used after balance；Column is rushed with the buffer after balance after loading, is rushed to the OD of efflux 280 Then value uses the buffer elution of 0.1mol/L formic acid -0.05mol/L KCl, pH2.2 instead, collects eluting peak less than 0.1；(3) it is concentrated by ultrafiltration, then filtration sterilization；(4) enzyme solution after degerming fills lyophilized plate, and vacuum freeze drying obtains finished product.The present invention has developed new affinity chromatography, can be with a step from chymotrypsinogen purifying crude chymotrypsin, and easy to operate, specificity is more preferable, and chymotrypsin potency is higher.)

一种亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺

技术领域

本发明涉及生化分离和纯化技术领域，具体地涉及药用胰蛋白酶的亲和层析制备方法，尤其涉及一种新亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺。

背景技术

糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶它在药理和临床上的功用主要有两方面：一、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，有报道在抗癌增效上有效率超过50％，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、***、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。

中国专利CN200610117613.9提供了一整套工艺稳定、质量保证的高纯度糜蛋白酶制备方法。该生产工艺主要包括两个部分，一是由新鲜冷冻牛胰或猪胰制备糜蛋白酶原粗品，二是通过慈菇蛋白酶抑制剂亲和层析柱制备高纯度糜蛋白酶(效价达到1400u/mg以上)。十几年来，随着糜蛋白酶的广泛使用，高端客户对品质的要求也越来越高，糜蛋白酶效价要达到1600u/mg以上。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种新的亲和层析法——低分子尿蛋白酶抑制剂亲和层析柱——来制备高纯度糜蛋白酶，该亲和层析法专一性更好，糜蛋白酶效价更高。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有技术制得的糜蛋白酶效价无法满足高端需求，需要提供一种新的制备工艺。

为实现上述目的，本发明提供了一种亲和层析法制备高纯度糜蛋白酶的工艺，包括以下步骤：

(1)取糜蛋白酶原，用去离子水溶解并调节pH值至7.5-8.5，加入高比活性的胰蛋白酶，在2-8℃环境中酶解24-48h，酶解后的溶液离心得到酶解液；

(2)制备低分子尿蛋白酶抑制剂亲和层析介质，然后装柱，并用0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡，平衡后用酶解液上样，控制流速为30-120cm/h；上样完毕后用平衡后的缓冲液冲柱，冲至流出液的OD280值小于0.1，然后换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2的缓冲液洗脱，流速为50-120cm/h，收集洗脱峰；

(3)收集的洗脱峰用超滤膜系统进行超滤浓缩，然后通过膜过滤除菌；

(4)除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术将酶液直接冷冻干燥，得到成品。

进一步地，步骤(1)中，糜蛋白酶原由新鲜冷冻牛胰或猪胰经粉碎、提取蛋白、分级盐析、结晶后过滤得到。

具体地，糜蛋白酶原的获取经过如下的步骤：

(a)选取新鲜冷冻牛胰或猪胰，称重后按照原料重量加入2-3倍体积的含25mmol/LCaCl₂的预冷Tris-Hcl缓冲液，用高速组织研磨仪由低速至高速进行研磨，得到均匀的粗浆；

(b)粗浆于2-8℃冷库中放置过夜，次日将粗浆于高速冷冻离心机按4℃、10000-15000rpm离心40-60min，取上清液，分离后的残渣装袋后按照环保要求处理，上清液在2-8℃冷库中放置过夜后用滤纸过滤去除脂肪等，得到的清液即为提取液；

(c)在提取液中补充硫酸铵至60％饱和度，在2-8℃冷库中放置过夜，次日吸取上清液弃去，用离心法收集底层沉淀；

(d)用1-4倍重量的冰水溶解上述沉淀，再加入0.1-1倍重量的饱和硫酸铵溶液，调节pH至4.5-6.5，在20-30℃下保温静置24-48h使糜蛋白酶原充分结晶，过滤得到糜蛋白酶原。

进一步地，步骤(1)中的胰蛋白酶取自牛胰蛋白酶或猪胰蛋白酶，且胰蛋白酶的效价大于3000u/mg。

进一步地，步骤(1)中糜蛋白酶原和去离子水的重量比为1:8-13。

进一步地，步骤(1)中加入的胰蛋白酶的重量为糜蛋白酶原的0.004-0.01％。

进一步地，步骤(2)中亲和层析介质的制备方法为：采用GE Health Sepharose 4B凝胶，在碱性条件下(pH 8.0-8.5)与低分子尿蛋白酶抑制剂反应24小时后得到。

进一步地，步骤(3)中超滤浓缩采用截流量10000的超滤膜系统。

进一步地，步骤(3)中浓缩液通过0.25-0.35μm的滤膜过滤除菌。

进一步地，成品的酶活力高于1750u/mg。

本发明开发出了新的亲和层析法——低分子尿蛋白酶抑制剂亲和层析柱，用于制备高纯度糜蛋白酶，可以一步从糜蛋白酶原粗品纯化糜蛋白酶，操作方便，并且相比于已有的慈菇蛋白酶抑制剂亲和层析法，专一性更好，糜蛋白酶效价更高，满足了1600u/mg以上的需求。

以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

具体实施方式

实施例1

牛胰糜蛋白酶原粗品5公斤。粗品用50L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入225mg牛胰蛋白酶(效价：3400u/mg)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将20L自制的亲和层析介质装柱，用60L 0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h；上样完毕，用60L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰40L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至5L，将浓缩液通过0.25μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到1750u/mg。

实施例2

猪胰糜蛋白酶原粗品5公斤。粗品用50L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入450mg猪胰蛋白酶(效价：4100u/mg)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将20L自制的亲和层析介质装柱，用60L 0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在30cm/h；上样完毕，用60L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为50cm/h，收集洗脱峰40L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至5L，将浓缩液通过0.22μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到2050u/mg。

实施例3

牛胰糜蛋白酶原粗品15公斤。粗品用150L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入675mg牛胰蛋白酶(效价：3400u/mg)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将60L自制的亲和层析介质装柱，用200L 0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在80cm/h；上样完毕，用200L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为100cm/h，收集洗脱峰80L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至10L，将浓缩液通过0.35μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到1780u/mg。

实施例4

猪胰糜蛋白酶原粗品20公斤。粗品用200L去离子水溶解，调节pH到8.0，再加入1.8g猪胰蛋白酶(效价：4100u/mg)，在4度冷库中酶解48小时。离心得到酶解液。将80L自制的亲和层析介质装柱，用250L 0.1M Tris-Hcl，pH8.0缓冲液进行平衡；平衡后直接用酶解液上样，控制流速在120cm/h；上样完毕，用250L上述平衡液冲柱，冲至流出液的OD₂₈₀值小于0.1。换用0.1mol/L甲酸-0.05mol/L KCl，pH2.2缓冲液洗脱，流速为120cm/h，收集洗脱峰100L。用截流量10000的超滤膜系统进行超滤浓缩，浓缩至10L，将浓缩液通过0.3μm的滤膜过滤除菌。除菌后的酶液装冻干盘，采用真空冷冻干燥技术，将酶液直接冷冻干燥，得到成品。成品取样，参照中国药典2015年版第二部的要求，进行全项测定，全项指标完全符合中国药典的要求，酶活力达到2100u/mg。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。