小麦TaARF12基因及其应用
阅读说明：本技术 小麦TaARF12基因及其应用 (Wheat TaARF12 gene and application thereof ) 是由 李爱丽 王芳 耿帅锋 毛龙 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供了小麦TaARF12基因及其应用,属于作物分子生物学领域。本发明设计引物从中国春幼穗的cDNA中克隆TaARF12的编码区序列,TaARF12基因编码区序列在A、B、D同源染色体中的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。本发明选择TaARF12特异性的RNAi片段,构建RNAi载体并转化Fielder。同时,使用CRISPR/Cas9载体构建包含两个靶位点的基因编辑载体并转化野生型Fielder。获得的RNAi转基因株系和基因编辑株系具有类似的表型,表现为株高变矮,穗子变长。说明小麦TaARF12基因能够调控植株高度和穗子长度,该基因被干扰表达后植株表现为植株变矮,穗子增长。(The invention provides a wheat TaARF12 gene and application thereof, belonging to the field of crop molecular biology. The invention designs a primer to clone a coding region sequence of TaARF12 from cDNA of young ears in spring of China, and the sequences of the coding region sequence of the TaARF12 gene in A, B, D homologous chromosomes are respectively shown in SEQ ID NO. 1-3. The invention selects a specific RNAi fragment of TaARF12, constructs an RNAi vector and converts the RNAi vector into Fielder. Meanwhile, a gene editing vector containing two target sites is constructed by using the CRISPR/Cas9 vector and the wild-type Fielder is transformed. The obtained RNAi transgenic line and the gene editing line have similar phenotypes and show that the plant height is shortened and the spike is lengthened. The wheat TaARF12 gene can regulate and control the height and the ear length of the plant, and the plant is shown to be dwarfed and the ear is increased after the gene is interfered to express.)
技术领域
本发明涉及作物分子生物学领域，更具体地，涉及小麦TaARF12基因的克隆、TaARF12 RNAi(RNA interfering)载体的构建方法，CRISPR/Cas9-TaARF12载体的应用、及TaARF12基因在调控植株高度和穗子长度中的应用。
背景技术
普通小麦是重要的粮食作物，全世界约有1/3以上的人口以小麦为主粮。小麦株高和穗长对产量的形成有重要的影响,研究其发育遗传规律有助于了解产量形成的机制。20世纪70年代，利用小麦的半矮秆基因主导的绿色革命给全球小麦产量带来了很大的增长。降低株高可以提高小麦的抗倒性，可以在育种中充分利用矮杆基因选育出抗倒伏、大穗、高产的品种。穗长是小麦的一个重要农艺性状，小麦穗长性状与小麦的三个产量构成因素密切相关，更长的穗为增加小穗数、穗粒数和千粒重提供了可能，有利于小麦产量的提高。
生长素是植物体内普遍存在的植物激素，在植物的顶端优势、根和茎的形态建成等植物生长发育的阶段起重要作用。生长素响应因子(ARF,auxin response factor)是一类可以结合顺式应答元件并介导生长素信号反应的转录因子家族。ARF蛋白包括3个保守的结构域，N端的B3 DNA结合结构域，具有结合下游基因的作用；中间的激活结构域(AD)和抑制结构域(RD)，决定ARF发挥激活还是抑制作用；C端的CTD结构域，决定ARF与其它蛋白的互作。目前ARF基因的研究一般集中在根系方面，比如OsARF12，生长素应答基因的转录激活因子，在水稻中调节根的伸长。然而目前为止，小麦中ARF基因的研究很少，尤其TaARF12在小麦中的功能研究和生产应用。因此有必要在小麦中RNAi及敲除TaARF12，深入研究TaARF12在小麦中的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供小麦TaARF12基因及其应用。
在六倍体小麦中国春的幼穗中扩增TaARF12基因，得到在A、B、D同源染色体上的基因序列，分别如SEQ ID NO.1-3所示，该基因命名为TaARF12，该基因定位于第二染色体同源群上。
本发明提供了小麦TaARF12基因在小麦育种中的应用。
本发明提供了小麦TaARF12基因在调控植株高度中的应用。
本发明提供了小麦TaARF12基因在制备转基因植物中的应用。
本发明提供了小麦TaARF12基因在调控穗伸长中的应用。
本发明提供了小麦TaARF12基因在植物种质资源改良中的应用。
所述植物包括但不限于小麦。
具体地，本发明所述的小麦TaARF12基因位于小麦第二同源群上，其在小麦2A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦2B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦2D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了用于克隆小麦TaARF12基因的引物组合，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4-5所示。
相应地，本发明提供了小麦TaARF12基因的克隆方法，利用SEQ ID NO.4-5所示的特异性引物组合，以小麦穗子cDNA为模板，PCR扩增得到小麦TaARF12基因。
本发明提供了一种小麦TaARF12基因的RNAi片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明提供了含有上述小麦TaARF12基因的RNAi片段的RNAi载体。
本发明还提供了小麦TaARF12 RNAi载体的构建方法，其通过以下方法构建得到，包括如下步骤：
(1)以SEQ ID NO.4-5为引物，以中国春幼穗cDNA为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物进行测序；
(2)以SEQ ID NO.6-7为引物，以(1)测序正确质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，用SEQ ID NO.8进行测序；
(3)将(2)的回收产物和pWMB006载体使用BamH I和Kpn I双酶切，回收后连接测序；
(4)以SEQ ID NO.9-10为引物，以(1)测序正确质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，用SEQ ID NO.11进行测序；
(5)将(4)的回收产物和(3)中连接测序成功的载体使用Sac I和Spe I双酶切，回收后连接测序，构建得到中间载体pWMB006-TaARF12；
(6)使用Hind III酶切pWMB006-TaARF12和pWMB111载体，回收带有TaARF12基因序列的片段和pWMB111，连接检测，构建得到pWMB111-TaARF12 RNAi载体。
本发明提供了鉴定小麦RNAi转基因植株的方法，使用引物SEQ ID NO.13-14，以转基因植株的DNA为模板，PCR扩增得到430bp条带的是阳性植株。
本发明提供了鉴定TaARF12基因在RNAi植株中表达量的方法,使用的荧光定量引物为SEQ ID NO.15-16。
本发明提供的TaARF12 RNAi转基因植株的株高与野生型相比显著降低。
本发明提供的TaARF12 RNAi转基因植株的穗子表型与野生型相比，其穗子显著变长。
本发明提供了构建TaARF12 CRISPR/Cas9载体的靶位点及其应用。
本发明提供了小麦TaARF12 CRISPR/Cas9载体的靶位点序列，靶位点核苷酸序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。
含有上述靶位点序列的CRISPR/Cas9载体属于本发明的保护范围。
本发明提供了鉴定小麦TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株的方法，使用引物SEQID NO.13-14，以转基因植株的DNA为模板，PCR扩增得到430bp条带的是阳性植株。
本发明提供了TaARF12基因CRISPR/Cas9转基因植株，其具有株高显著降低的表型。
本发明提供了TaARF12基因CRISPR/Cas9转基因植株，其具有穗子显著变长的表型。
本发明提供了小麦TaARF12基因的克隆方法以及小麦TaARF12基因在调控植物株高和穗长的生物学功能，本发明实验发现小麦TaARF12基因沉默或被干扰表达后，植株表现为株高降低、穗子变长。本发明的小麦TaARF12基因可广泛应用于小麦遗传育种、种质资源改良和培育转TaARF12基因的植物领域，对改进和改良小麦等作物的种质资源具有重要作用。
附图说明
图1是pWMB006载体质粒图谱。
图2是pWMB111载体质粒图谱。
图3是TaARF12 RNAi转化Fielder T3代阳性植株鉴定。M是Marker，WT是野型Fielder作为阴性对照，RNAi-L2,RNAi-L6,RNAi-L3表示TaARF12-ARNAi小麦T3代植株(下同)，所用模板为三叶期幼苗的DNA。图中430bp的条带代表转基因植株是阳性植株。
图4是TaARF12在野生型Fielder和RNAi植株在穗中的表达量。
图5是TaARF12 RNAi转基因植株株高表型图。
图6是TaARF12 RNAi转基因植株株高统计图，***代表差异极显著。
图7是TaARF12 RNAi转基因植株穗长表型图。
图8是TaARF12 RNAi转基因植株穗长统计图，***代表差异极显著。
图9是TaARF12 CRISPR/Cas9转化Fielder T1代阳性植株鉴定。M是Marker，WT是野型Fielder作为阴性对照arf12-2,arf12-5,arf12-11和arf12-9表示TaARF12 CRISPR/Cas9小麦T1代植株(下同)，所用模板为三叶期幼苗的DNA。图中430bp的条带代表转基因植株是阳性植株。
图10是TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株的基因编辑位点信息。
图11是TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株株高表型图，Bar＝10cm。
图12是TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株株高统计图，***代表差异极显著。
图13是TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株穗长表型图，Bar＝1cm。
图14是TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株穗长统计图，***代表差异极显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1小麦TaARF12基因的克隆
1、小麦幼穗总RNA的提取
中国春(Triticum aestivum L.)幼穗总RNA的提取，使用Plant mini Kit(QIAGEN)。
2、cDNA第一条链的合成
按照反转录酶EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix(北京全式金生物技术有限公司)的操作说明进行。
3、从中国春(Triticum aestivum L.)幼穗的cDNA中克隆TaARF12的编码区序列。正向引物序列如SEQ ID NO.4，反向引物序列如SEQ ID NO.5。
PCR体系和程序参考TransStart FastPfu DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)的操作说明进行。
PCR产物切胶回收纯化后按照北京全式金生物技术有限公司提供的Blunt ZeroCloning Kit克隆方法克隆连接到Blunt Zero Cloning载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得TaARF12。对获得的片段送测序公司测序后，与六倍体小麦的TaARF12参考序列比较，确定TaARF12基因在A、B、D同源染色体序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。
实施例2 TaARF12 RNAi载体的构建及转基因植株的鉴定和统计
a.pWMB006-TaARF12中间载体构建
(1)使用引物SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，以已测序的TaARF12-A质粒为模板，扩增带有BamH I和Kpn I酶切位点的TaARF12-A一段特异序列，双酶切纯化后的PCR产物，使用胶回收试剂盒回收目的片段；
(2)双酶切pWMB006载体(见图1)，使用胶回收试剂盒回收线性化后的载体；
(3)连接，反应体系为：步骤(1)获得的目的片段2μL,线性化载体pWMB0062μL,T4连接酶1μL，T4连接Buffer 1μL，用ddH2O补足至10μL，16℃过夜连接；
(4)连接产物的转化及挑选阳性克隆测序。
(5)另一个反向互补的片段构建方法同上，酶切位点为Sac I和Spe I，使用酶切、连接的方法把反向互补片段构建到步骤(4)中测序正确的载体，最终构建得到中间载体pWMB006-TaARF12。
b.pWMB111-TaARF12 RNAi载体构建
(1)用HandIII酶切a(5)中测序正确的质粒即pWMB006-ARF12和pWMB111质粒(见图2)，使用胶回收试剂盒回收目的片段及线性化后的载体。
(2)连接、转化及阳性克隆测序同a(3)-(4)，测序正确的即构建成pWMB111-ARF12。
c.转基因植株的鉴定和统计
(1)使用核苷酸序列SEQ ID NO.13-14在转基因小麦叶片中进行PCR鉴定，430bp条带代表阳性植株(见图3)。
(2)利用野生型Fielder和转基因植物的幼穗，使用荧光定量引物SEQ ID NO.15-16进行表达鉴定，RNAi-L2和RNAi-L6表达量显著降低(见图4)。
(3)和野生型Fielder相比，转基因植株RNAi-L2和RNAi-L6株高显著降低(见图5和图6)。
(4)和野生型Fielder相比，转基因植株RNAi-L2和RNAi-L6穗长显著变长(见图7和图8)。
实施例3 TaARF12 CRISPR/Cas9转基因植株基因编辑检测
(1)根据靶位点的位置信息，设计跨越靶位点的引物，针对靶位点1的引物为SEQID NO.19-20，针对靶位点2的引物为SEQ ID NO.21-22。
(2)使用核苷酸序列SEQ ID NO.13-14在转基因小麦叶片中进行PCR鉴定，430bp条带代表阳性植株(见图9)。
(3)在转基因植株中的DNA中分别使用引物SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22进行PCR。PCR体系和程序参考TransStart FastPfu DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)的操作说明进行。
(4)PCR产物切胶回收纯化后按照Blunt Zero Cloning Kit(北京全式金生物技术有限公司)克隆方法连接到Blunt Zero Cloning载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆进行测序。
(5)把克隆测序序列和野生型Fielder的序列使用DNAMAN进行比对，得到基因编辑信息(见图10)。本发明中共获得12棵转基因植株，经检测，靶位点2中有9棵植株检测到A、B、D 3个拷贝同时被编辑，其余3棵只编辑了1个或2个拷贝。靶位点1中只有3棵植株检测1个拷贝的编辑。
(6)和野生型Fielder相比，基因编辑植株株高显著降低(见图11和图12)。
(7)和野生型Fielder相比，基因编辑植株穗长显著变长(见图13和图14)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 小麦TaARF12基因及其应用
<130> KHP191115676.7
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2496
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgagctcct cgtcgggggc cagcctcggc ggccagccgc cgcccgccgc gccgccggag 60
gaagagaaga agaacctcaa ctcggagctg tggcacgcct gcgccggccc gctcgtctgc 120
ctccccaccc tcggcacgcg cgtcgtctac ttcccgcagg gccacagcga gcaggtggcg 180
gcgtcgacga acaaggaggt ggaggggcac atccccaact acccaaacct gccgccgcag 240
ctcatctgcc agctgcacga tgtcacaatg catgctgatg tggagaccga tgaagtgtac 300
gcgcagatga cgctgcagcc gctgaaccca caagagcaaa acgacgccta cctgccggcg 360
gagatgggga tcatgagcaa gcagccgacc aactacttct gcaagacgct gacggccagc 420
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gaatttgtca taccactctc aaagtacatc aaggctgttt ttcacacccg gatatcggtt 900
ggcatgcggt tcaggatgct ctttgagacc gaggaatcta gtgttcgcag gtatatgggg 960
acgataacag aagtgagtga tgccgatcca gtgcgttggg ctagttccta ctggagatca 1020
gttaaggttg gttgggatga atcaactgct ggggaaaggc cgcctagagt ttctttatgg 1080
gagattgaac cattgacaac ctttcctatg tatccgtctt tgtttccgct gagggttaaa 1140
catccctggt attctggtgt agcaggcctt caagatgaca gcaatgcttt gatgtggctg 1200
agaggagttg ctggagatgg aggttatcag tctatgaact ttcagtcacc tggtattggc 1260
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cagcaggtgc accaggtgca gcaggcgcag caggcccaca ttgatcagaa gcagaagatt 1620
caatcagatc aaacatatca tgttcctact agtgcgtctc tcccaagtcc aacgtcgcta 1680
ccaagccatc tgcgtgaaaa atttggcttc tctgatccta atgctaattc gtcaagcttc 1740
accacttcta gcagcagcga caacatgctg gaatcgaact tccttcaggg gaattcgaaa 1800
gctgtgaact tgtctagatt caatcagcca gtagctagcg atcagcagca gcagcaacaa 1860
cagcaacagc aacagcaggc ttggaagcaa aagtttatgg gttcacaatc actgtctttt 1920
gggggctcgg gtttgcttaa ctcacccaca agtaaagacg gttctcttga gagcaaaatt 1980
ggttctgatg tgcaacatca gtcccttttt agtcctcaag ttgattcttc ctccctactg 2040
tacaacatgg tgcctaacat gacttcaaat gttgcggata ataacatgtc tacgattcct 2100
tctgggtcaa catatctgca aagtcccatg tatggttgtt tggacgactc ttctggtatt 2160
tttcagaata caggagagaa tgacccaaca agcagaacat tcgtgaaggt ttataagtca 2220
ggatcagtgg ggaggtcctt ggacatcacc cggttctcca attatgctga acttcgtgaa 2280
gaactgggtc agatgtacgg catcaggggt cagttggatg accccgatag atcaggctgg 2340
cagcttgtat tcgtcgacag ggagaatgat gtgcttctcc ttggagacga cccttgggag 2400
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<210> 2
<211> 2502
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagtaccaag ctgtagttgc tgctgctgcc gccgcctccc agtctggtgg ttatatgaaa 1380
caacaattcc taaaccttca gcagcctatg cagtcgcctc aagaacactg caacctcaac 1440
ccgctcttgc agcaacagat cttgcagcaa gcaagccaac aacaaaccgt tagtgctgat 1500
agtcagaata ttcaggcaat gctgaactca agtgctatgc agcaccaact tcaacagctc 1560
cagcaactgc agcaggtgca ccaggtgcag caggcgcagc aggctcacat tgatcagaag 1620
cagaagattc aatcagatca aacatatcat gttcctacta gtgcgtctct cccaagtcca 1680
acatcactac caagccatct gcgtgaaaaa tttggcttct ctgatcctaa tgctaattcg 1740
tcaagcttca ccacttctag cagcagcgac aacatgctgg aatcgaactt ccttcagggg 1800
aattcgaaag ctgtagactt gtctagattc aatcagccag tagctagcga tcagcagcag 1860
cagcagcaac aacagcaaca gcaggcttgg aagcaaaagt ttatgggttc acaatcactg 1920
tcttttgggg gctcgggttt gcttagctca cccacaagta aagacggttc tcttgagagc 1980
aaaattggtt ctgatgtgca aaatcagtcc ctttttagtc ctcaagttga ttcttcctcc 2040
ctactgtaca acatggtgcc taacatgact tcaaatgttg cggataacaa catgtctacg 2100
attccttctg gatcaacata tctgcaaagt cccatgtatg gttgtttgga cgactcttct 2160
ggtatatttc agaatacagg agagaatgac ccaacaagca gaacattcgt gaaggtttat 2220
aagtcaggat cagtggggag gtccttggac atcacccggt tctccaatta tgctgaactt 2280
cgggaagaac tgggtcagat gtacggcatt aggggtcagt tggatgaccc cgatagatca 2340
ggctggcagc ttgtattcgt cgacagggag aatgatgtgc ttctccttgg agacgaccct 2400
tgggagtcat ttgtcaatag tgtatggtac atcaagatac tttcaccaga ggatgtgcac 2460
aagttgggca agcaaggaaa tgatccacgt tacctttcct aa 2502
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