阅读说明：本技术 用于刺激视网膜细胞和治疗视力损失的方法 (Methods for stimulating retinal cells and treating vision loss ) 是由 R·R·伯奇 N·瓦格纳 J·A·格雷科 于 2018-05-08 设计创作，主要内容包括：蛋白质基视网膜下植入物为由于如年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)等疾病而失明的患者提供了恢复视力的新方法。本发明涉及菌视紫红质基(BR基)视网膜植入物,该植入物可以在视网膜下位置植入以替代退化的感光细胞。(Protein-based subretinal implants provide a new method of restoring vision in patients who are blind due to diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and Retinitis Pigmentosa (RP). The present invention relates to bacteriorhodopsin-based (BR-based) retinal implants that can be implanted in a subretinal location to replace degenerated photoreceptor cells.)

用于刺激视网膜细胞和治疗视力损失的方法

关于联邦资助研究的声明

本发明是在美国国家卫生研究院(GM-34548，1R41 EY023461-01)和国家科学基金会(IIP-1448244，IIP-1632465)的资助下由政府支持而完成。政府在本发明中拥有某些权利。

技术领域

蛋白质基视网膜下植入物为由于年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)等疾病而失明的患者提供了恢复视力的新方法。本发明涉及菌视紫红质基(BR基)视网膜植入物，该植入物可以植入视网膜下位置以替代退化的感光细胞。

背景技术

视网膜是给眼后部的凹形内表面做衬里的多层组织。在视网膜内部的感光细胞被进入眼的光激活并将光信号转换成电化学信号，这些信号被传送至视网膜神经细胞。视网膜神经细胞相应地经由视神经将信号传递至大脑的视觉中心，从而使大脑能够感知视觉图像。感光细胞大体上被分类为视杆细胞和视锥细胞，这些细胞是以它们的形状而命名。然而视锥细胞含有色觉所必需的感光色素，视杆细胞含有对光高度敏感的感光色素视紫红质，因此使在暗淡的光线条件(例如夜间条件)下的视力成为可能。视杆细胞足够敏感以便被单个光子激活，然而视锥细胞需要几十到几百个光子才能被激活。

当被光子激活时，视紫红质(其是视杆细胞的感光色素)会经历构象变化。视紫红质由被称作视蛋白的七次跨膜蛋白组成，该蛋白质以共价键结合到被称作视黄醛(其是维生素A的衍生物)的辅基。未活化的视黄醛以11-顺式的形式存在，然而光刺激会引起构象变化至全反式形式。视网膜中的构象变化引起共价键结合视蛋白多肽中的相应的构象变化，由此触发在感光细胞内部的第二信使级联，这导致信号被传递至适当的视网膜神经细胞。这些信号沿着视神经被传递至大脑的视觉中心，这使大脑能够处理视觉输入并感知视觉图像。

破坏视网膜感光细胞的各种疾病和病症会导致部分或全部的视力损失。视网膜的两种主要疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)和视网膜色素变性(RP)。作为老年人中视力损失和失明的主要原因，AMD导致位于在视网膜中心的黄斑内部的视杆和视锥感光细胞发生退化。此外，AMD会影响中央视觉，并因此导致阅读、驾驶和其他需要高对比度视力的工作中的困难。

另一个疾病RP是其中视杆细胞发生退化由此导致视力损失和失明的遗传性疾病。视杆细胞的损失削弱在暗淡光线中的视觉能力并逐渐降低周围视觉，直到患者出现视隧道视觉和最终失明。

到目前为止，已对用于治疗这种视网膜疾病和病症的许多人工视网膜原型进行了研究，但各原型有明显的缺点。最有希望的设计之一是视网膜前植入物生化眼系统(ArgusII)，其是由南加州大学的研究人员设计并由Second Sight公司销售。该植入物使用安装在一副眼镜上的通过连接电缆连接到微电极阵列的外部摄像头。电极阵列直接地给神经节细胞提供电刺激。在临床试验中，受试者能够用8×8电极阵列感知光线，并且能够检测运动并识别简单的形状。然而，该设计有明显的缺点，即它需要外部硬件，如眼镜和手术植入的外部装置。此外，植入物提供不足以恢复功能性视力的低分辨率，并且植入所要求的手术复杂性限制了视网膜外科医生群体的可采纳性。

所需要的是手术创伤性较小的高分辨率视网膜植入物，该植入物可以至少部分地恢复患有由于视网膜疾病或损伤所导致的感光细胞损失的视力损失的患者的视力质量。

鉴于前述内容，显而易见的是，对于开发安全且有效的治疗视力损失的方法存在着持续的需求。

发明内容

本发明的蛋白质基视网膜下植入物为由于AMD和RP而失明的患者提供了恢复视力的新方法。采用使用P23H转基因大鼠的离体细胞外记录实验证明了这种离子介导的蛋白质基植入物刺激退化视网膜的双极细胞和神经节细胞的能力。

本发明提供了一种植入物，该植入物能够以高分辨率工作并且可以被类似于室内环境照明的光条件所激活，例如用于刺激视网膜细胞和治疗视力损失的高像素分辨率方法。

附图说明

图1示出了蛋白质基视网膜植入物的应用。视网膜退行性疾病(包括AMD和RP)的特征是在视网膜内部感光细胞的损失。受这些疾病影响的个体会损失视力并最终失明。菌视紫红质基(BR基)视网膜植入物替代退化的感光细胞并被放置于视网膜下。在吸收光时，植入物产生离子梯度，该离子梯度刺激其余的视网膜组织。参见Wangner,N.L.et al.InBionanotechnology:Biological Self-Assembly and its Applications；B.A.Rehm,ed.Caister Academic Press,Norfolk,UK 2013,205-240；Greco,J.A.et al.Int.J.HighSpeed Electron.Syst.2017,26,1740012-1-17400120-20；和Chen,Z.；Birge,R.R.TrendsBiotech.1993,11,292-300。

图2示出了视网膜植入物的示意图、以及显示BR和聚阳离子的交替层的布置的图解。参见He,J.-A.et al.1998,14,1674-1679。蛋白质基视网膜植入物是基于在离子渗透膜、聚阳离子和BR之间的静电相互作用。所形成的多层膜产生用于刺激退化的视网膜组织的单向离子梯度。

图3示出了P23H大鼠绿色视锥色素和光适应性菌视紫红质[bR(LA)]的吸收光谱与来自实验中所使用的三个LED的输出的比较。注意到，红色LED以合理的效率与bR(LA)吸收光谱相结合，但较差地与大鼠绿色视锥相结合。因为大鼠没有红色视锥并且P23H大鼠视网膜退化，所以我们可以选择性地用红色LED激活植入物。

图4A和图4B示出了响应于对离子介导视网膜植入物的光激活的切除P23H大鼠视网膜的激活效率。图4A表明当取向成以便将质子朝向视网膜泵送时(具有闭合正方形和三角形的迹线，图4A中的上迹线和图4B中的下迹线)具有高光密度(OD)的视网膜植入物能够以高效率刺激视网膜组织。如果使用较低OD的植入物(具有开放正方形和三角形的迹线，图4A中的下迹线和图4B中的上迹线)，则效率显著地降低。当把植入物取向反转以便泵送质子远离视网膜时，如图4B所示，检测到较小的活性至未检测到活性。正方形和三角形数据点分别指代具有正幅值和负幅值的测量动作电位。所有数据均使用30μV阈值用于分析。

图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F示出了在视网膜植入物的光激活后P23H大鼠的测量RGC的潜伏期分布。图5A、图5C和图5E对应于其中植入物取向成朝向神经组织泵送质子的情况([H⁺]增加)。图5B、图5D和图5F是用于对照，其中以相反的取向放置植入物([H⁺]减少)。y轴被调整使得它是每100次扫描的平均观察次数。入射光(630nm，1ms脉冲)强度从上到下增加(5A/5B：20.5mW/cm²；5C/5D：29.5mW/cm²；5E/5F：49.89mW/cm²)。

图6A和图6B示出了多电极阵列(MEA)的示意图，该多电极阵列用于对蛋白质基视网膜植入物的空间分辨率进行量化(图6A)的细胞外记录实验。还示出了8×8MEA的E行中电极5的选择性激活(图6B)。光诱导动作电位局限于由在阵列内部的电极5所测量的RGC，而所有其他信号都是由于自发活动所产生。入射光束具有200μm的直径并且以电极5为中心。y轴是辐射束的归一化幅值和跨越110.2s的归一化时间范围。

图7A和图7B示出了P23H大鼠绿色视锥(图7A)和光适应性BR(bR；图7B)的吸收光谱与来自使用所采用绿色或者红色干涉滤光片的投影器光的输出的比较。将光源与光谱的耦合效率示于图的右侧。可看见红色干涉滤光片与bR吸收光谱耦合，但与大鼠绿色视锥色素的效率则低得多。

图8A、图8B和图8C示出了以在MEA阵列内部的单个电极为中心的P23H大鼠视网膜的靶向照射。图8A、图8B和图8C分别对应于电极E3、E4和E5的选择激活。各平板中的上图说明了在照射后各电极的信号百分率，并且各图被归一化为最大值。各平板中的下图示出了位置和相对光束斑尺寸。

具体实施方式

本发明涉及用于对由于视网膜细胞损失而导致视力损失的患者进行治疗的方法，包含：

(a)将菌视紫红质基视网膜植入物植入患者的眼睛，和

(b)用光源激活植入物，

其中植入物刺激视网膜细胞，从而以像素尺寸小于约500μm、或小于约350μm、或小于约250μm、或小于约200μm、或小于约150μm、或小于约100μm、或小于约75μm、或小于约50μm、或小于约40μm、或小于约30μm、或小于约25μm的分辨率提供刺激。

在另一方面，本发明涉及用于对由于视网膜细胞损失而导致视力损失的患者进行治疗的方法，包含：

(a)将菌视紫红质基视网膜植入物植入患者的眼睛，和

(b)用光源激活植入物，

其中植入物刺激视网膜细胞，从而以由下列所限制的分辨率提供刺激：(i)光源的衍射极限；或者(ii)当视网膜植入物还包含离子渗透基底(支架)时，离子渗透基底(支架)的孔径和密度。

在另一方面，本发明涉及对由于视网膜细胞损失而导致视力损失的患者进行治疗的方法，包含：

(a)将菌视紫红质基视网膜植入物植入患者的眼睛，和

(b)用光源激活植入物，

其中植入物刺激视网膜细胞，从而以约4像素/mm²的像素密度和约500μm的像素尺寸、或者约8像素/mm²的像素密度和约350μm的像素直径、或者约16像素/mm²的像素密度和约250μm的像素直径、或者约25像素/mm²的像素密度和约200μm的像素直径、或者具有约44像素/mm²的像素密度和约150μm的像素直径、或者具有约100像素/mm²的像素密度和约100μm的像素直径、或者具有约178像素/mm²的像素密度和约75μm的像素直径、或者具有约400像素/mm²的像素密度和约50μm的像素直径、或者具有约625像素/mm²的像素密度和约40μm的像素直径、或者具有约1111像素/mm²的像素密度和约30μm的像素直径、或者具有约1600像素/mm²的像素密度和约25μm的像素直径的分辨率提供刺激。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中菌视紫红质基视网膜植入物包含至少一个基质层(支架)和菌视紫红质膜，其中菌视紫红质膜包含天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体的多个单独层，其中天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体的各单独层与阳离子聚合层交替，并且其中菌视紫红质突变体选自由氯离子泵突变体、偶极突变体、光循环突变体、金结合突变体(gold-binding mutant)、离子泵突变体，Q态突变体及其组合组成的组。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中光源是以人可见波长，即约400至约700nm发射的光源。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中光源的强度(功率密度)小于约100mW/cm²、50mW/cm²、40mW/cm²，或小于约30mW/cm²，或小于约20mW/cm²，或小于约10mW/cm²，或小于约5mW/cm²，或小于约1mW/cm²。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中光源是脉冲光源。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中光源是连续光源。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中植入物是生物相容的、离子渗透的视网膜植入物。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中植入物用逐层组合体制成。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中将植入物植入选自视网膜下位置或视网膜前位置的位置。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中将植入物植入视网膜下位置。

在另一方面，本发明涉及一种方法11，其中将植入物植入视网膜前位置。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜细胞选自视网膜神经节细胞、视网膜双极细胞、视网膜感光细胞及其组合。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜细胞选自视网膜神经节细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜细胞选自视网膜双极细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜细胞选自视网膜感光细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物包含至少约100层天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体，或至少1约50层天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体，或至少约200层天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物还提供至少约30毫秒的时间分辨率。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物还提供至少约20毫秒的时间分辨率。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物还提供至少约10毫秒的时间分辨率。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物引发(提供)约40μV的动作电位给细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物引发(提供)约30μV的动作电位给细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物引发(提供)约20μV的动作电位给细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物提供单向质子梯度。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中单向质子梯度指向视网膜细胞，其中视网膜细胞选自视网膜神经节细胞或视网膜双极细胞。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中将植入物植入选自视网膜下位置或视网膜前位置的位置。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中菌视紫红质基视网膜植入物包含菌视紫红质分子，使得它们一致地(同样地)取向。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物在生理温度(～37℃)或低于生理温度下使用。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视网膜植入物在生理pH值(约7.0至约7.2)下使用。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中视力损失由视网膜感光细胞的损失导致。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中基底层是离子渗透层，并且是在植入物的一侧或两侧上。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中基底层选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-苯乙基酯(PEM)、聚乙二醇(PEG)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)大分子单体、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(对二甲苯基)(也称为聚对二甲苯)、聚乙烯醇(PVA)水凝胶及其组合。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中基底层(支架)的厚度小于100μm，并且含有直径小于约100μm的均匀分布的孔阵列。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中菌视紫红质基视网膜植入物基于天然菌视紫红质。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中菌视紫红质基视网膜植入物基于菌视紫红质突变体。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中突变体是Q态突变体。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中突变体已被优化为具有高偶极矩。

在另一方面，本发明涉及一种方法，其中突变体已被优化以便形成高效Q态。

在另一方面，本发明涉及用于刺激视网膜细胞的方法，包含：

(a)使视网膜细胞与菌视紫红质基视网膜植入物接触，和

(b)用光源激活植入物，

其中

(i)植入物刺激视网膜细胞，从而以像素尺寸小于约500μm、或小于约350μm、或小于约250μm、或小于约200μm、或小于约150μm、或小于约100μm、或小于约75μm、或小于约50μm、或小于约40μm、或小于约30μm、或小于约25μm的分辨率提供刺激；或者

(ii)其中植入物刺激视网膜细胞，从而以由下列所限制的分辨率提供刺激：(i)光源的衍射极限；或(ii)当视网膜植入物还包括离子渗透基底(支架)时，离子渗透基底(支架)的孔径和密度；或者

(iii)其中植入物刺激视网膜细胞，从而以具有约4像素/mm²的像素密度和约500μm的像素尺寸、或者约8像素/mm²的像素密度和约350μm的像素直径、或者约16像素/mm²的像素密度和约250μm的像素直径、或者约25像素/mm²的像素密度和约200μm的像素直径、或者约44像素/mm²的像素密度和约150μm的像素直径、或者约100像素/mm²的像素密度和约100μm的像素直径、或者约178像素/mm²的像素密度和约75μm的像素直径、或者约400像素/mm²的像素密度和约50μm的像素直径、或者约625像素/mm²的像素密度和约40μm的像素直径、或者约1111像素/mm²的像素密度和约30μm的像素直径、或者约1600像素/mm²的像素密度和约25μm的像素直径的分辨率提供刺激。

在另一方面，本发明涉及用于对由于视网膜细胞损失而导致视力损失的患者进行治疗的视网膜植入物，包含刺激视网膜细胞从而以具有小于约500μm、或小于约350μm、250μm、或小于约200μm、或小于约150μm、或小于约100μm、或小于约75μm、或小于约50μm、或小于约40μm、或小于约30μm、或小于约25μm的像素尺寸的分辨率提供刺激的视网膜植入物。

在另一方面，本发明涉及用于对由于视网膜细胞损失而导致视力损失的患者进行治疗的视网膜植入物，包含刺激视网膜细胞从而以由下列条件所限制的分辨率提供刺激的视网膜植入物：(i)光源的衍射极限；或者(ii)当视网膜植入物还包含离子渗透基底(支架)时，离子渗透基底(支架)的孔径和密度。

在另一方面，本发明涉及用于对由于视网膜细胞损失而导致视力损失的患者进行治疗的视网膜植入物，包含刺激视网膜细胞从而以具有约4像素/mm²的像素密度和约500μm的像素尺寸、或者约8像素/mm²的像素密度和约350μm的像素直径、或者约16像素/mm²的像素密度和约250μm的像素直径、或者约25像素/mm²的像素密度和约200μm的像素直径、或者约44像素/mm²的像素密度和约150μm的像素直径、或者约100像素/mm²的像素密度和约100μm的像素直径、或者约178像素/mm²的像素密度和约75μm的像素直径、或者约400像素/mm²的像素密度和约50μm的像素直径、或者约625像素/mm²的像素密度和约40μm的像素直径、或者约1111像素/mm²的像素密度和约30μm的像素直径、或者具有约1600像素/mm²的像素密度和约25μm的像素直径的分辨率提供刺激的视网膜植入物。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中菌视紫红质基视网膜植入物包含至少一个基质层(支架)和菌视紫红质膜，其中菌视紫红质膜包含天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体的多个单独层，其中天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体的各单独层与阳离子聚合物层交替，并且其中菌视紫红质突变体选自由氯离子泵突变体、偶极突变体、光循环突变体、金结合突变体、离子泵突变体、Q态突变体及其组合组成的组。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中光源是以人可见波长，即约400至约700nm发射的光源。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中光源的强度(功率密度)小于约100mW/cm²、50mW/cm²、40mW/cm²，或小于约30mW/cm²，或小于约20mW/cm²，或小于约10mW/cm²，或小于约5mW/cm²，或小于约1mW/cm²。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中光源是脉冲光源。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中光源是连续光源。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中植入物是生物相容的、离子渗透的视网膜植入物。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该植入物用逐层组合体制成。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中将该植入物植入选自视网膜下位置或视网膜前位置的位置。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中将该植入物植入视网膜下位置。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中将该植入物植入视网膜前位置。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜细胞选自视网膜神经节细胞、视网膜双极细胞、视网膜感光细胞及其组合。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜细胞选自视网膜神经节细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中视网膜细胞选自视网膜双极细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中视网膜细胞选自视网膜感光细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中视网膜植入物包含至少约100层天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体，或至少约150层天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体，或至少约200层的天然菌视紫红质或菌视紫红质突变体。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中视网膜植入物还提供至少约30毫秒的时间分辨率。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物还提供至少约20毫秒的时间分辨率。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物还提供至少约10毫秒的时间分辨率。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物引发(提供)约40μV的动作电位给细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物引发(提供)约30μV的动作电位给细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中视网膜植入物引发(提供)约20μV的动作电位给细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物提供单向质子梯度。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中单向质子梯度指向视网膜细胞，其中视网膜细胞选自视网膜神经节细胞或视网膜双极细胞。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中将该植入物植入选自视网膜下位置或视网膜前位置的位置。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中菌视紫红质基视网膜植入物包含菌视紫红质分子，使得它们一致地(同样地)取向。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物在生理温度(～37℃)或低于生理温度下使用。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中该视网膜植入物在生理pH值(约7.0至约7.2)下使用。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中视力损失由视网膜感光细胞损失所导致。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中基底层是离子渗透层，并且在植入物的一侧或两侧上。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中基底层选自聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸2-苯乙基酯(PEM)、聚乙二醇(PEG)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)大分子单体、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(对二甲苯基)(也称为聚对二甲苯)、聚乙烯醇(PVA)水凝胶及其组合。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中基底层(支架)的厚度小于100μm，并且含有直径小于约100μm的均匀分布的孔阵列。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中菌视紫红质基视网膜植入物基于天然菌视紫红质。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中菌视紫红质基视网膜植入物基于菌视紫红质突变体。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中突变体是Q态突变体。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中突变体已被优化为具有高偶极矩。

在另一方面，本发明涉及一种视网膜植入物，其中突变体已被优化以便形成高效Q态。

基于本文中的公开内容，本发明的这些和其他方面将变得显而易见。

菌视紫红质基视网膜植入物：

本发明的视网膜植入物(图1)使用光激活蛋白质(菌视紫红质(BR))作为光活性介质来吸收入射光并引发质子动力以激活退化视网膜的其他神经回路从而刺激视觉反应。参见Birge,R.R.；Nollenberger,M.Ranaghan,M.J.；Sandberg,D.J.；Wagner,NicoleL.Protein-Based Artificial Retinas，美国专利8,563,026；和Chen,Z.；Birge,R.R.,Protein Based Artificial Retinas.Trends Biotech.1993,11,292-300。菌视紫红质是用于此用途的极优异的候选者，因为蛋白质的质子泵送功能以与天然视觉色素视紫红质相同的高量子效率(65％)起作用。该蛋白质也在高温(>80℃)、强光强度、和高盐环境下起作用。视网膜植入物的结构允许蛋白质的光密度能够吸收足量的入射光以产生用于视网膜刺激的离子梯度。该性能特征由用于形成高度均匀薄膜的逐层(LBL)静电吸附方法而促进。结果是可以产生单向质子梯度的薄膜。为该自底向上的制造方法开发了自动LBL系统，用以形成多层植入物。视网膜植入物的高光密度避开了采用基因治疗和光遗传学方法所固有的表达水平问题，这些方法试图表达用于在退化视网膜中的光捕获的类似的光敏蛋白。采用使用P23H转基因大鼠的离体细胞外记录实验来证明这些离子介导的蛋白质基修复术刺激退化视网膜的双极细胞和神经节细胞的能力。

BR蛋白在视网膜植入物结构的各层内的分子堆积导致高像素密度，这导致仅受扩散速率和经过离子渗透支架的质子侧向扩散所限制的空间分辨率。重要的是，视网膜植入物是由入射光提供动力，这与需要外部电缆、电极、或电源的其他电子型植入物相比是一个优势。因此，本发明的视网膜植入物在手术中创伤性较小，这大大地减少植入所需的时间以及由于机械固定而发生感染的机会。植入物还将允许患者利用自然眼球运动来扫描视景，并且在没有信号传输延迟的情况下提供正常的视知觉。

多层薄膜的构造和设计：本发明的BR基视网膜植入物(图2)是由多层BR薄膜组成，该多层BR薄膜是通过使用定制LBL浸渍机的顺序LBL静电吸附而形成。BR的LBL沉积使用市售的离子渗透微纤维(商品名为

)作为视网膜植入物中的支架。

已成功地应用于眼中，并且可以用于将蛋白质直接地附着和取向于表面上。为了利用BR产生充分的pH梯度以便刺激视网膜的能力，蛋白质以最优密度在

表面区域一致地取向，并且含有足够的BR层用以充分地吸收入射光，同时也形成pH梯度。此外，我们已发现提供具有适当尺寸间距的支架是有益的，如下文所述。

视网膜植入物的稳定性和生物相容性：在文献中详细记录了BR对热降解和光化学降解的长期稳定性。蛋白质可以承受高于80℃的温度，这远远超过正常人体温度。此外，蛋白质的循环性(即，在样品降解达1/e之前蛋白质可以光化学循环的次数)大约为106次。这个值比大多数合成光致变色材料大得多。该稳定性通过在由天然脂质膜包围的三聚体(紫膜)的二维晶格内的蛋白质分离而实现。逐层(LBL)组装的视网膜植入物通过高效的静电相互作用而结合在一起，静电相互作用使BR结合到聚阳离子。

作用机制的概述：微生物视紫红质用作治疗遗传性视网膜疾病的潜在发光工具。发光方法使用在朝向双极细胞和神经节细胞的AAV中表达的光激活蛋白，包括视紫红质通道蛋白-2(ChR-2)和菌视紫红质(hR)，以替代退化感光细胞的光敏性。这些疗法利用了以下事实，即尽管有感光细胞的损失，对于RP和AMD两者而言神经网络大体上保持完整。已使用理论模型来证明改变在视网膜细胞周围的Na⁺、K⁺和Cl^-离子的离子浓度可以触发神经冲动，并且可以分别使用光激活离子通道及诸如ChR-2(Na⁺/K⁺通道)和HR(Cl^-泵)的泵使这些神经细胞去极化和超极化。视网膜神经节细胞(RGC)含有嵌入神经细胞膜中的上皮Na⁺通道的质子门控类似物。因此，质子泵(如BR)也已被认为是恢复视网膜退变患者视力的光遗传工具。Lilley等人测量了质子诱导视网膜刺激的阈值(～pH6.5)，并且可重复地证明细胞外酸化的快速毫秒脉冲引起RGC的正常电活动模式。参见Lilley,S.；LeTissier,P.；Robbins,J.,The Discovery and Characterization of a Proton-Gated Sodium Current in RatRetinal Ganglion Cells.J.Neurosci.2004,24,1013-1022；Lilley,S.；Robbins,J.,Characterisation of a Novel Proton-Gated Sodium Current in Rat RetinalGanglion Cells.J.Physiol.2001,531,83P-84P。约10ms的BR光循环持续时间和调节局部酸度的能力使BR成为视网膜的离子介导刺激的另一可行候选物。本发明通过创建一个稳定的生物相容的可植入假体而利用了这个原理，该假体以与感光细胞中的天然色素相同的效率起作用。

本发明的BR基视网膜植入物采用部分的与离子介导的光遗传疗法相同的原理，然而该植入物具有克服基因治疗方法的固有缺点的假体的一些关键优势。首先，主要地作为光遗传疗法的对象的RPE65基因突变仅影响全世界约6000人，而本发明具有治疗受各种基因突变影响的全球150万RP人群的潜力。另外，光学遗传工具(如ChR-2)具有在可见光谱的蓝色边缘(～470nm)的λ_max，而BR具有在570nm处的宽λ_max，该λ_max跨越可见光谱的大部分中心部。这个特性提供更高的灵敏度，同时也无需依赖于与光谱UV区邻接的较短波长。最后，非天然ChR-2和HR蛋白的表达水平可以是受限制的和不稳定的，这导致需要危险的高强度光源来激活靶向神经细胞。多层蛋白质基视网膜假体通过使用数百层的BR而避开这个问题，这需要较低的光强来形成足够的离子梯度。

使用Q态突变体的像素调节：除了定义光激活蛋白的质子泵送机制的光化学外，BR还可以经由顺序双光子过程而进入分支光循环。Q态含有9-顺式视网膜发色体(与在BR静止状态中的全反式发色体相反)，该发色体是由蛋白质水解并产生分离的蓝移光产物，该光产物在环境温度下稳定大约数年。参见Birge,R.R.；Gillespie,N.B.；Izaguirre,E.W.；Kusnetzow,A.；Lawrence,A.F.；Singh,D.；Song,Q.W.；Schmidt,E.；Stuart,J.A.；Seetharaman,S.et al.,Biomolecular Electronics:Protein-Based AssociativeProcessors and Volumetric Memories.J.Phys.Chem.B 1999,103,10746-10766。Q态防止蛋白质经历光诱导的光循环，这提供了将蛋白质基视网膜植入物中的活性像素转换成非活性像素的方法。该特征对于在手术植入之前或者之后调节植入物的像素密度和使特定区域无效以防止与感光细胞的干扰而言可能是有利的。天然的野生型蛋白质不能高效地获得该光产物，并且已鉴定出BR的各种突变体提供更大的Q态的获得性和稳定性。Birge,R.R.；Rangarajan,R.；McCleary,K.N.菌视紫红质蛋白变体和用于长期数据存储的方法(Bacteriorhodopsin protein variants and methods of use for long term datastorage).美国专利8883719。在本发明中描述的视网膜植入物可以使用蛋白质的野生型形式或者使用Q态突变体而同样地制造，并且可以基于此独特的光化学来调节在本发明中描述的功能和刺激方法。

实施例

以下实施例进一步描述并说明了在本发明范围内的实施方式。所给出的实施例仅仅是为了说明的目的而不应被解释为对本发明的限制，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明的许多变型是可能的。

离体研究设计：对本发明的蛋白质基视网膜植入物的评估集中在对这些植入物的空间敏感性进行量化，以证明相较于竞争技术提高的分辨率。这些竞争技术(即基于电极的视网膜假体)利用人工手段捕捉图像，将光能转换成电信号，并刺激退化视网膜的其余神经回路。有几种基于电极的视网膜植入物正在开发中，其中最值得注意的技术由SecondSight，Pixium Vision和Retinaal Implant AG开发。尽管有在电极阵列制造、硬件接口和手术过程中的改进，但这些视网膜植入物具有固有的缺点。最重要的是，由于更高的视觉灵敏度需要小尺寸的电极的要求，因此复制有助于正常视觉感知的神经感觉网络的空时模式是一个挑战。与电极阵列相关的有限分辨率加剧了这个问题，从而仅导致视觉灵敏度的微小改善。

本发明的蛋白质基假体的重要方面是恢复高分辨率视觉的可能性，这通过基于电极的技术是非常难以实现的。本发明中用于刺激酸敏感离子通道(ASIC)的质子的方向梯度提供刺激双极细胞和神经节细胞的独特方法。然而，因为刺激的机制是通过定向离子而不是与电极的直接接触，所以受损神经网络的激活是复杂的，并且依赖于多个因素，包括蛋白质的分子堆积、BR的光循环持续时间、视网膜下腔中的扩散速率和侧向扩散的程度。我们在此证明，离子介导的视网膜植入物能够具有对于促成接近自然视知觉的响应度所必需的空间敏感性和时间分辨率。

此外，这些实验已证明了对这些pH介导的视网膜下植入物的时间激活进行监测以表明RGC激活的定时大约为150ms(这类似于天然的、未受损的视网膜组织)的能力。我们也已测量了200层蛋白质基视网膜植入物在小于＜7.2mW/cm²的光强度(这与室内环境光强度相似)下的相对激活效率。此外，使用多电极阵列(MEA)的一系列细胞外记录实验的结果对本发明的离子介导刺激方法的空间敏感性和激活潜伏期进行了量化。在目前为止，实验已证明蛋白质基视网膜植入物可以在与室内环境光相当的光强度下刺激视网膜。为了实验性地确定侧向扩散影响RGC的相邻簇程度，使用窄光束(FWHM直径约为200μm)选择性地激活在MEA内在单个电极周围的区域。我们的发现结果证明了选择用于实验的电极分离的高灵敏度，该灵敏度的上限约为200μm。根据电极间距和所选择的阵列，可以实现其他灵敏度。

对视网膜植入物的激活效率和时间分辨率的分析：利用P23H转基因大鼠的离体细胞外记录实验来证明离子介导的蛋白质基人工视网膜刺激退化视网膜的双极细胞和神经节细胞的能力。细胞外记录实验表明，150层或200层BR基视网膜植入物可以刺激P23H大鼠视网膜的退化视网膜。在本研究中使用P23H系1纯合大鼠，这些大鼠是人型常染色体显性RP的模型。所使用的大鼠的年龄在8至12个月的范围内，此时大部分(>98％)的感光细胞损失。Jensen和Rizzo详细地描述了用于动物和组织制备的方案。参见Jensen,R.J.；Rizzo III,J.F.,Effects of Gaba Receptor Agonists on Thresholds of P23H Rat RetinalGanglion Cells to Electrical Stimulation of the Retina.J.Neural Eng.2011,8,1-8。在除去视网膜后，将视网膜植入物放置在视网膜下构造中并且取向成使质子泵送的方向朝向双极细胞或者远离双极细胞。监测RGC在吸收脉冲LED光后由视网膜植入物所引发的动作电位。在这些研究期间使用单个记录电极，同时对来自多只P23H大鼠的若干神经节细胞进行监测，以测试视网膜植入物结构的效率和时间分辨率。

为了刺激蛋白质基视网膜植入物并证明没有剩余的感光细胞负责吸收入射光，使用脉冲LED装置在三个波长处产生精确的光能脉冲：绿色(530nm)、黄色(590nm)、或红色(630nm)，使用在从模拟室内环境光(7.2mW/cm²)到中午室外阳光(100mW/cm²)范围内的脉冲能量(图3)。该脉冲LED装置与神经监测电生理学设备接合，用于视网膜植入物的选择性刺激。为了确保所产生的信号是来自植入物而不是来自剩余的感光细胞，用高强度绿光使视网膜褪色达3分钟。该步骤还具有使在植入物内的BR光适应的优点，这提高了在光吸收后质子泵送的效率。随后，用红光脉冲照射植入物，与用大鼠绿色视锥细胞色素的较低耦合效率(0.004，图3)相比，该红光与BR具有较高的耦合效率(0.173，图3)。褪色过程和红光与剩余大鼠绿色视锥细胞色素的低效耦合有助于确保使用红光所产生的信号与视网膜植入物相关。

这些结果表明，视网膜植入物可以通过调节在剩余双极细的胞胞外区域附近的pH值可重复地刺激RGC。该分析要求对合适的阈值(30μV)进行选择以便在光诱导动作电位与研究中退化视网膜所固有的背景噪声之间进行区分。通过激活在这些神经细胞上的ASIC，促进通过增加环境中的[H⁺]所产生的阳性反应，从而导致信号转导级联反应，该级联反应具有诱导视觉感知的可能性。图4提供了对从采用红光(630nm)激发的这些实验中所收集数据的概述，其中将具有各种多层密度的植入物定位成以便以朝向或者远离P23H大鼠的退化视网膜组织的方式泵送质子。图4A表明就高OD(150层)植入物而言随着光强度的增加实现高激活效率，而就低OD(100层)植入物而言该效率减半。此结果进一步证明，可再现激活需要充分数量的层数。其最小值通常约为150至200层。应当理解的是，在所采用的最小层数与要实现的可重复激活之间存在着平衡。降低[H⁺](通过使植入物的取向反转)的对照实验引起很少的或者不引起神经电路的激活(图4B)。这个结果对于研究中所调查的高OD和低OD样品都是显而易见的。

在这些单记录实验中所获得的数据也用于获得视网膜植入物的时间分辨率的定量表征。约10ms的BR光循环持续时间和调节局部酸度的能力使得BR基薄膜成为离子介导视网膜植入的优异候选物。Lilley等人以前已测量了在约pH6.5下质子诱导视网膜刺激的阈值，并且已证明对以毫秒尺度发出酸性刺激的脉冲时可重复动作电位的控制。参见Lilley,S.；LeTissier,P.；Robbins,J.,The Discovery and Characterization of a Proton-Gated Sodium Current in Rat Retinal Ganglion Cells.J.Neurosci.2004,24,1013-1022；和Lilley,S.；Robbins,J.,Characterisation of a Novel Proton-Gated SodiumCurrent in Rat Retinal Ganglion Cells.J.Physiol.2001,531,83P-84P。然而，激活ASIC的时间进程至今未知，并且由视网膜植入物产生的pH梯度非常大地取决于光强度和入射光脉冲的持续时间。换句话说，包含在蛋白质层内的BR会需要经历多个光循环，以便在双极细胞环境的附近积聚充分的H⁺。执行这些实验以证明RGC激活以相关的时间尺度发生以促进视觉敏锐度。

图5提供了一系列直方图，这些直方图示出了在光激活后作为时间函数的所观察到的动作电位。在来自630nm光源的各1ms光脉冲之后，每100次测量(或扫描)求出观察次数的平均值，并且对若干大鼠和神经节细胞进行监测以求出数据的平均值。图5A、图5C和图5E中的迹线总结了当利用视网膜放置使视网膜植入物取向在将质子朝向双极细胞泵送时的数据。直方图示出了随着光强度的增加(左图，从上到下)激活增加，这与以前所报告的激活效率相似。各测量光强度的平均激活延迟约为150ms，这与天然功能性视网膜的时间分辨率相当。当以相反的取向放置植入物时(图5B、图5D和图5F)，将质子从视网膜组织中泵送出，没有观察到超过存在于所绘制的所有直方图中的背景噪声的明显激活。这些结果表明，获得的RGC激活的定时可以支持典型的视觉感知。

使用多电极阵列(MEA)的蛋白质基视网膜植入物的阈值和激活效率：采用全视场照明执行了一系列实验以测试视网膜植入物的激活效率，其中使用多电极阵列(MEA)(电极直径30μm，间距200μm，8×8矩形网格)来代替单电极装置，这允许同时对64个电极进行监测(参见图6A)。对用于这些实验的光源进行了调整，使得光束通过被切除视网膜/植入物/MEA组合体正上方的显微镜物镜。全视场照明由光源投影仪提供，该光源投影仪分别采用一系列的干涉滤光片和中性密度滤光片来调节入射波长和光强度。也使用可变光阑孔径调节束斑大小，然而，对于这种分析，整个电极阵列被照亮。图7示出了绿色和红色干涉滤光片与大鼠绿色视锥细胞的光谱和BR的光谱的耦合效率。采用脉冲红光选择性地激活在退化视网膜内的任何剩余的绿色视锥细胞(图7A；耦合效率＝0.0041)的BR(图7B；耦合效率＝0.2337)。因此，用MEA测量的任何活化有可能是通过由BR基植入物产生的离子梯度诱发。

如在上述的实验中，将P23H大鼠视网膜切除。以前的实验已证实使用离体细胞外记录的150层至200层蛋白质基视网膜植入物的取向的性能功效。使用脉冲红光(100ms脉冲，640nm)来激活电极阵列内的电极的全视场。

使用多电极阵列(MEA)确定视网膜植入物的空间分辨率：

通过减小用于全场刺激的束斑以便仅激活电极阵列内的单电极确定本发明视网膜植入物的空间灵敏度(参见图6A)。使用可变光阑孔径和显微镜物镜执行该减小，从而定位入射光束。也使用x、y、z、θ显微镜接口以高选择性来定位束斑。因为所使用的电极直径为30μm并且各电极之间的间距为200μm，所以用直径为200μm的光束将单个电极作为靶，同时地对整个电极阵列进行监测，预期未发光的电极将会不显示活性的变化。然后，使光束在相邻电极之间移动，以进一步显示响应度和分辨率。

图8中所示的结果是在MEA内部的一组相邻的三个电极。在这些测量的整个过程中，使受照电极沿着8×8MEA中的行E平移。红色LED的光点尺寸具有约200μm的直径，和相当于电极之间间距的半高全宽(FWHM)。在该附图中在各平板的下图中给出照明的位置。各平板的上图示出了在MEA内各电极的相对激活率(信号/秒)。图8A示出了当仅电极E3被照亮时，RGC激活局限在由高相对信号速率所支配的一个点。在靠近和远离E3电极的位置观察到一些活动，然而该活动有可能是由于收集期间在视网膜内的自发活动所导致。当使光束平移到电极E4和E5时(分别参见图8B和8C)，结果重现，其中测量最高激活率的目标电极在别处观察到很少的信号至未观察到信号。

图8示出了由各平板中的归一化信号代表的最大信号速率。电极E3、E4和E5分别测量到12.06/s、9.62/s、和3.17/s的信号速率。将每个图归一化为受照电极的最大信号速率(信号/秒)。所观察到的最大速率与各平板中所观察到的最大噪声不直接地相关，这些速率也不与RGC的相对效率相关。

图6B进一步示出了在整个归一化持续段(110.2秒)中来自动作电位图的空间灵敏度效应，同时用窄光束(直径约为200μm)瞄准8电极行阵列(行E)中的电极E5，从而选择性地激活与该电极接触的RGC。从神经节细胞中测量的光激活动作电位被示出定位于这一个电极上，并且在相邻的电极上观察到很少的活性至未观察到活性。因为仅与单个电极接触的靶向神经元显示光响应，所以可以估计RGC收集区的直径具有200μm的上限。这些结果支持所产生的离子梯度位于视网膜植入物的被照射区域。在对应于装置内的电极最小间距的直径为200μm处对最大灵敏度区域进行了测量。这些结果还验证了在视网膜植入物的界面处的侧向扩散，验证了双极细胞被最小化并且在光激活期间不影响周围的神经组织，并且验证了植入物可以产生接近衍射极限的分辨率。

这些结果表明，本发明的蛋白质基视网膜植入物能够实现相对于基于电极的视网膜植入物更高的空间分辨率。

刺激视网膜细胞

方法：利用层-层静电吸附制造由离子渗透膜、交替的BR层和聚阳离子粘附层组成的视网膜植入构建体。在吸收光时，BR层产生单向质子梯度，该质子梯度激活存在于双极细胞和神经节细胞的外膜中的ASIC。将视网膜植入物放置在相对于P23H转基因大鼠的切除视网膜的视网膜下位置，并且使用脉冲LED系统在选择性地激活BR的波长处产生精密脉冲。使用单电极和多电极阵列两者执行细胞外记录，以验证离子介导的作用机制并研究视网膜假体的空间敏感性。

在本文中有用的视网膜植入物和菌视紫红质突变体在2013年10月22日公布的Birge等人的美国专利号8,563,026B2和2014年11月11日公布的Birge等人的美国专利号8,883,719B2中有进一步描述，这些专利的全部内容通过引用的方式并入本文中。

结果：对使用在切除P23H大鼠视网膜中的视网膜神经节细胞的细胞外记录的研究表明，本发明的视网膜下植入物能够通过定向质子梯度来刺激视网膜组织。蛋白质基假体的激活效率随着入射红光强度(～640nm)的增加而增加。实验表明，该植入物可以使用与室内环境光相当的光强度(～7.2mW/cm²)刺激视网膜，并且还证明植入物的时间分辨率类似于激活的生理潜伏期(～150ms)。此外，使用多电极阵列证明激活可以集中到200μm像素直径。这些结果表明BR基视网膜植入物可以刺激P23H视网膜的其余神经回路，从而证明在AMD和RP的治疗中的潜在功效。

以引用方式的并入

每个专利文件(包括修正证书、专利申请文件、科学论文、政府报告、网站和本文中提及的其他参考文献)的全部公开内容为了所有目的以其全部内容以引用的方式并入本文中。在术语发生矛盾的情况下，以本说明书为准。

等同物

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以具体化为其他特定形态。前述实施方式在所有方面被认为是说明性的而不是限制本文所描述的发明。在其中使用术语“包含”的本发明的各种实施方式中，还可以想到实施方式基本上由所陈述步骤或部件组成，或由所陈述步骤或部件组成。此外，只要本发明仍然切实可行，那么步骤的顺序或执行某些操作的顺序并不重要。此外，可以同时地执行两个或多个的步骤或操作。

在本说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文明确指出。除非另有规定，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，以本说明书为准。