阅读说明：本技术 稳定的含病毒组合物 (Stable virus-containing compositions ) 是由 A·S·塞迪克 W·F·托尼斯 M·A·H·卡佩勒 于 2018-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及包含痘病毒的组合物和药物组合物,特别是痘苗病毒例如修饰的痘苗安卡拉(MVA)病毒,浓度为约5mM-300mM的硫酸盐和缓冲液,其中所述组合物pH为约6.0-8.5。其还公开了稳定痘病毒组合物的方法,所述方法包括制备所述病毒制剂。(The present invention relates to compositions and pharmaceutical compositions comprising poxviruses, in particular vaccinia viruses such as Modified Vaccinia Ankara (MVA) virus, sulfate at a concentration of about 5mM to 300mM and buffer, wherein the composition has a pH of about 6.0 to 8.5. It also discloses a method of stabilizing a poxvirus composition comprising preparing the viral formulation.)

稳定的含病毒组合物

政府支持声明

本发明在美国卫生与公众服务部、应急准备和响应办公室、生物医学高级研究开发局的政府支持下进行(授予的合同HHSO100201500008C)。***合众国政府享有本发明的一定权利。

技术领域

本发明涉及适合储存的含痘病毒组合物和相关药物产品的领域。如本文公开的优选组合物是用于长期储存的包含痘病毒例如痘苗病毒或修饰的痘苗安卡拉(modifiedvaccinia Ankara，MVA)病毒、硫酸盐以及缓冲液例如磷酸盐或Tris-缓冲液的组合物。所述组合物特别可以用作针对各种病原体或疾病的疫苗或治疗剂。

背景技术

痘病毒例如痘苗病毒和修饰的痘苗安卡拉(MVA)病毒用作针对天花的预防性疫苗。此外，重组痘苗病毒和MVA目前用于许多临床研究用于针对许多病原体或包括癌症在内的靶标预防性或治疗性免疫接种。像其他活的或灭活的病毒疫苗一样，预防性或治疗性痘病毒药物在它们施用于受体或患者之前需要储存，因此需要储存数天、数周、数月至数年而不失去它们的效力。因为痘病毒的包膜参与细胞进入以及刺激个体中期望的免疫应答，刺激个体中期望的免疫应答是重组抗原复制或表达的前提，病毒滴度的减少与感染性的变化密切相关，因此与产品的有效性密切相关。

通常有包膜的病毒证实在储存期间甚至比缺少包膜的病毒更不稳定，表明脂质双层是病毒不稳定性的主要因素。痘苗病毒不仅特别大(约200-300nm)，而且它们的包膜比来自其他病毒的包膜甚至更复杂。除了细胞内包围膜，当痘病毒从表面脱落时它们需要额外的膜。因此稳定痘苗病毒甚至比其他有包膜的病毒更有挑战性。例如，WO 2016/087457公开了几种测试液体制剂，其具有对MVA的稳定性有负面影响的各种添加剂。因此需要特定的方法为痘病毒找到稳定的制剂，确保在广泛条件下的稳定性。

WO 03/053463和WO 2014/053571公开了包含MVA的冻干制剂。但是，冻干过程更耗时，并且需要添加剂在干燥过程中保护病毒的生物活性以避免活性丢失。此外，在给药之前需要重建步骤，这使给药程序复杂化。

因此，本领域仍需要开发稳定的痘病毒疫苗制剂用于药物应用，允许工业应用和储存较长时间而不影响产品的生物活性。更具体地，应当将病毒滴度丢失和/或可能具有增加的毒性或改变的免疫原性的副产物的形成限制在最低限度。疫苗还应当在应用和临床使用期间防止剪切力以及防止取决于各种气候条件(特别是运输时)的温度升高，以及避免由于观察不当或冷链中断的效力丢失。此外，需要在产品的制造、储存和运输期间的一个或多个冻融循环之后保留活性。因为包含病毒编码的膜蛋白的胞外小泡是重组痘病毒生产的副产品，痘病毒(例如，痘苗病毒或MVA)的制剂甚至更加复杂，并且需要考虑影响病毒感染性的许多变量的特定方法。本发明的这些和其他目的会与本发明的发明详述一起进一步详细描述。

发明内容

为了满足这些和其他需求，本文描述了与以前公开的制剂相比具有提高的热稳定性和提高的抗搅拌应力稳定性的包含痘病毒的组合物。所述组合物中包含的痘病毒保留它们的效力和感染性。这通过向pH为约6.0-8.5的缓冲液中的痘病毒添加浓度为约5mM-300mM的硫酸盐，优选硫酸钠来实现。相对于本领域已知的常规组合物，这些组合物的改善在于表现出较少的病毒聚集和构象变化，在储存时较少的pH变化和/或当储存在例如室温下、在-20℃储存温度下或加速应力之后较少的浊度变化。具体地，本发明预期满足如下目标产品性质特征：在25℃下数周或数月或者在2℃-8℃下和在冷冻条件外更长时间的有效期。本发明还提供0℃以下，特别是在-20℃下数周或数月或更长时间的有效期。

因此，本发明提供一种组合物，其包含a)痘病毒，b)缓冲液，和c)硫酸盐，其浓度为约5mM-300mM；其中所述组合物pH为约6.0-8.5。

在一些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含a)痘病毒，b)缓冲液，和c)硫酸盐，其浓度为约5mM-300mM；其中所述制剂pH为约6.0-8.5。

在一些实施方案中，所述组合物或药物组合物适合通过注射给药，例如，通过肌肉内、皮下、静脉内或鼻内施用。例如，所述药物组合物可以用于治疗或预防病原体或癌症。

在一些实施方案中，本发明涉及一种稳定痘病毒组合物的方法，所述方法包括制备组合物，所述组合物包含a)痘病毒，b)缓冲液，和c)硫酸盐，其浓度为约5mM-300mM；其中所述组合物pH为约6.0-8.5。

在一些实施方案中，本发明涉及一种稳定痘病毒组合物的方法，所述方法包括制备包含痘病毒的组合物的步骤；b)缓冲液；和c)浓度为约5mM-300mM的硫酸盐；其中所述组合物pH为约6.0-8.5，并且将所述组合物储存在2摄氏度-8摄氏度的温度下。

在一些实施方案中，本发明涉及一种稳定痘病毒组合物的方法，所述方法包括向痘病毒组合物添加浓度为约5mM-300mM的硫酸盐的步骤。

附图说明

附图并入并构成本说明书的一部分，其说明本发明的几个实施方案，并且与说明一起用于解释本发明的原理。应当理解本发明不限于图中示出的具体实施方案。

图1：利用Fluoromax 4获得的没有Na₂SO₄(A1-A4,10mM Tris pH 7.5,8.0,8.5和9.0)和具有100mM Na₂SO₄(B1-B4,10mM Tris pH 7.5,8.0,8.5和9.0,100mM Na₂SO₄)的不同制剂的各向异性结果。黑线(用*指示)示出加速应力(1周25℃)之前获得的扫描，并且灰线示出应力之后获得的扫描。

图2：自上而下：示出没有Na₂SO₄(A1-A4；10mM Tris pH 7.5,8.0,8.5和9.0)和具有100mM Na₂SO₄(B1-B4；10mM Tris pH 7.5,8.0,8.5和9.0,100mM Na₂SO₄)的不同制剂在应用加速应力(1周25℃)之后的pH变化、发射峰移位、发射强度变化、Z-平均直径变化和多分散性指数(PDI)变化。

图3：从左至右，图的每条柱示出应用加速应力(1天37℃)之后浊度、Z-平均直径和多分散性指数(PDI)的变化。不同组的制剂排列在垂直面上，即自上而下：不含盐的制剂(制剂A1-A4)、包含100mM Na₂SO₄的制剂(制剂B1-B4)、包含100mM CaCl₂的制剂(制剂C1-C4)、包含100mM MgSO₄的制剂制剂(D1-D4)、包含100mM MgCl₂的制剂(制剂E1-E4)和包含140mMNaCl的制剂(制剂F1-F4)。制剂在实施例3中完全描述。

图4：从左至右，图的每条柱示出应用加速应力(1天37℃)之后浊度、Z-平均直径和多分散性指数(PDI)的变化。不同组的制剂排列在垂直面上，即自上而下：不含盐的制剂(制剂A1-A4)、包含100mM Na₂SO₄的制剂(制剂B1-B4)、包含100mM MgCl₂的制剂(制剂C1-C4)和包含100mM NaCl的制剂(D1-D4)。制剂在实施例4中完全描述。

图5利用Fluoromax 4对4种不同制剂(对照A、1、对照B和3)获得的各向异性、荧光发射和90度光散射结果。用*指示的黑线代表在T0的扫描，而没有*的线代表以在5℃下储存3个月的形式施加应力之后的扫描。制剂在实施例6中完全描述。

图6：利用Fluoromax 4对4种不同制剂(对照A、1、对照B和3)获得的各向异性、荧光发射和90度光散射结果。用*指示的黑线代表在T0的扫描，而没有*的线代表以在-20℃下储存3个月的形式施加应力之后的扫描。制剂在实施例6中完全描述。

图7：利用Fluoromax 4对4种不同制剂(对照A、1、对照B和3)获得的各向异性、荧光发射和90度光散射结果。用*指示的黑线代表在T0的扫描，而没有*的线代表以20个冻融循环的形式施加加速应力之后的扫描。制剂在实施例6中完全描述。

图8：利用Fluoromax 4对5种制剂(对照A、1、对照B、3和7)获得的各向异性、荧光发射和90度光散射结果。用*指示的黑线代表在T0的扫描，而没有*的线代表以200rpm搅拌一天(24h)的形式施加加速应力之后的扫描。制剂在实施例6中完全描述。

图9：从左至右，图的每条柱示出浊度、Z-平均直径和多分散性指数(PDI)。从上至下，图示出制备之后(T0)、在5℃下3个月之后(3M5C)、在-20℃下3个月之后(3M-20℃)、20个冻融循环之后(20FT)和搅拌1天之后(AG)的值。制剂排列在这些图的x-轴上(对照A、1、对照B、3和7)。制剂在实施例6中完全描述。

具体实施方式

本说明书公开了包含本发明的特征的一个或多个实施方案。公开的实施方案仅示例本发明。本发明的范围并不限于公开的实施方案。

在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章、专利申请和专利；这些参考文献每个整体援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本说明书会取代任何这样的材料。本说明书中已包括的文件、条例、材料、装置、文章等的讨论仅为了提供本发明的上下文的目的。这样的讨论不是承认任何或全部这些材料形成关于公开或要求保护的任何发明的现有技术的部分。

应当理解本发明并不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文中使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，并不是为了限制本发明的范围。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。否则，本文使用的某些术语具有如说明书中示出的含义。

必须注意，当用于本文和所附权利要求时，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指称。因此，例如，提到“核酸”包括一个或多个核酸序列，并且提到“方法”包括提到本领域技术人员已知的可以修改或取代所述方法的等同步骤和方法。

除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”应当理解为指该系列中的每个元素。还必须注意，除非另有说明，任何数值，例如本文描述的浓度或浓度范围，应当理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。在整个说明书中，关于任何数量或浓度的术语“约”考虑包括该数量。例如，“约5mM”在本文中考虑包括5mM以及用于描述实体的被理解为大约5mM的值。如本文所用，除非上下文另有明确指示，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括这类范围内的整数和值的分数。相似地，虽然较不推荐，在本发明的上下文中在本文使用的任何数值或范围之前的术语“约”可以删除或用没有术语“约”的数值或范围替换。

如本文所用，多个引用元素之间的连接词“和/或”理解为涵盖单独和组合选项。例如，当两个元素通过“和/或”连接时，第一选项是指没有第二元素的第一元素的适用性。第二选项是指没有第一元素的第二元素的适用性。第三选项是指第一和第二元素一起的适用性。这些选项中的任一种均理解为落在含义内，因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。一个以上选项的并发适用性也理解为落在含义内，因此满足术语“和/或”的要求。

在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及其变体例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为意指包括所述的完整实体或步骤或者完整实体或步骤的组但不排除任何其他完整实体或步骤或完整实体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”替代，或者当在本文中使用时用术语“具有”替代。虽然较不推荐，在本发明的方面或实施方案的上下文中无论何时在本文中使用时，任何上述术语(包含、含有、包括、具有)可以术语“由…组成”或“基本上由…组成”替代。

在本文中使用时，“由…组成”排除权利要求元素中未指明的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由…组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

如本文所用的术语“聚集”是指其中两个或更多个蛋白或病毒积累和/或集聚在一起的过程。完整的天然蛋白以及降解的蛋白可能发生聚集。通常蛋白聚集是由蛋白的疏水基团暴露引起的，然后其积累。病毒聚集可能由于病毒包膜上表达的蛋白的修饰而发生。

术语“核酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”和“多核苷酸”可以互换使用，并且是指线性或支化的、单链或双联的RNA或DNA，或者它们的杂合体。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。多核苷酸可以通过化学合成获得或者源自微生物。当与重组病毒关联使用时，术语“外源”核酸序列表示外来核酸序列，其不包含与用于产生重组病毒的非重组病毒中，或者是在产生重组病毒时***病毒基因组的。

术语“药物”、“药物组合物”和“药剂”在本文中可互换用来指用于预防或治疗疾病的物质和/或物质的组合。

“药学可接受的”表示采用的剂量和浓度的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂、稳定剂或赋形剂不会在它们给药的个体中引起任何不需要或有害的效应。

术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用。如本文所用，个体通常是哺乳动物，例如非灵长类(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类(例如，猴和人)，并且在一些优选实施方案中是人。

根据本发明，“病毒”表示病毒、病毒颗粒、病毒载体和病毒疫苗。所述术语全部可以互换使用。这个术语包括野生型病毒、重组和非重组病毒、活病毒和减毒活病毒。

除非另有说明，本发明的实施会采用本领域技术内的分析学、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook,Fritsch andManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2^nd edition,1989；CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel FM,et al.,eds,1987；the series Methodsin Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR2:A Practical Approach,MacPherson MJ,Hams BD,Taylor GR,eds,1995；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow and Lane,eds,1988。

除非另有说明，在整个说明书中，物理参数例如pH的值是在25℃下测量的那些。

本发明涉及一种痘病毒组合物，其包含浓度为约5mM-300mM的硫酸盐和pH为约6.0-8.5的缓冲液。

术语“组合物”是指包含活性药物或生物成分如重组MVA连同一种或多种额外组分的制剂。在本文中术语“组合物”和“制剂”与术语“药物组合物”、“疫苗组合物”、“疫苗”和“疫苗制剂”可互换使用。

在某些实施方案中，所述制剂、组合物、药物组合物、疫苗组合物、疫苗或疫苗制剂是稳定的或稳定化的组合物。

全部可以互换使用的“稳定的”、“稳定化的”、“稳定性”或“稳定化”理解为本发明的组合物中包含的痘病毒在药物组合物的有效期所需的储存中保持其物理稳定性、性质、完整性和/或化学稳定性、性质、完整性、颗粒形态学和/或生物活性或效力。

测量稳定性的各种分析技术是技术人员已知的，并且如实施例中更详细描述的，决定稳定性的所述特征可以通过选自内源荧光、各向异性、动态光散射、pH测量、在350nm的浊度测量和90度光散射的至少一种方法测定。可以在所选温度和其他储存条件下于所选时间测量稳定性。

测定颗粒形态学的方法是技术人员公知的。例如，可以利用例如Schweneker etal.,Recombinant modified vaccinia virus Ankara generating Ebola virus-likeparticles.J.of Virology 22March 2017中描述的透射电镜和免疫电镜(免疫-EM)来测定颗粒形态学。测定颗粒形态学的可选方法是例如Vasco et al.(2010),CriticalEvaluation of Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)by NanoSight for theMeasurement of Nanoparticles and Protein Aggregates.PharmaceuticalResearch.27:796–810中描述的纳米颗粒跟踪分析(NTA)。纳米颗粒跟踪分析(NTA)是一种直接和实时可视化并分析液体中粒径分布和聚集的方法。基于激光照明的显微技术，通过电荷耦合器件(CCD)相机实时分析纳米颗粒的布朗运动，每个颗粒同时但单独可视化并通过专用的颗粒追踪图像-分析程序跟踪。NTA同时测量粒径和颗粒散射强度的能力允许解析异质颗粒混合物并直接估算颗粒浓度。

如本文所用，术语“效力”或“感染性”是指痘病毒(例如，痘苗病毒或MVA)的活性，以感染单位(InfU)表示，通常给作InfU/mL，或者以组织培养感染剂量50(TCID₅₀)表示，给作TCID₅₀/mL。术语“效力”和“感染性”在本发明中可以互换使用。痘病毒例如MVA的效力可以利用技术人员已知的各种方法测定，例如通过荧光激活细胞分选仪(FACS)试验或组织培养感染剂量50(TCID₅₀)试验。如本发明所用的示例性FACS试验和TCID₅₀试验在实施例中描述。

如本文所用，术语“有效期”表示在指定的储存条件下(例如，储存在2℃-8℃下)产品根据产品特征保持活性和/或稳定用作人药物的时间。有效期对应于超过给定规格的下限或上限的时间点。

在某些实施方案中，本发明的任何实施方案的组合物进一步定义为在4℃下储存6个月时具有起始感染性(在第0天)的至少50％、60％、79％、80％或90％的感染性。

在某些实施方案中，本发明的任何实施方案的组合物进一步定义为在25℃下储存3个月时具有起始感染性(在第0天)的至少50％、60％、79％、80％或90％的感染性。

在某些实施方案中，本发明的任何实施方案的组合物进一步定义为在-20℃下储存3个月，优选6个月时具有起始感染性(在第0天)的至少50％、60％、79％、80％或90％的感染性。

在某些实施方案中，本发明的任何实施方案的组合物在4℃下储存6个月时感染性的减少不超过起始感染性(在第0天)的50％、40％、30％、20％、10％或5％。

在某些实施方案中，本发明的任何实施方案的组合物在25℃下储存3个月时感染性的减少不超过起始感染性(在第0天)的50％、40％、30％、20％、10％或5％。

在某些实施方案中，本发明的任何实施方案的组合物在-20℃下储存3个月，优选6个月时感染性的减少不超过起始感染性(在第0天)的50％、40％、30％、20％、10％或5％。

根据特定实施方案，当在25℃(+/-5℃)下3周(优选3个月、6个月或至少1年)的病毒滴度总损失少于0.5log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，优选少于0.4log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，更优选少于0.3log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL时，本发明的组合物是稳定的。

本发明的“病毒滴度的总损失”定义为在所示温度n(例如，在37℃下)和时间t(例如，1周)储存组合物期间测量的病毒滴度的累积损失，给作log₁₀TCID₅₀/mL。或者，其可以给作log₁₀InfU/mL。病毒滴度的总损失给作xlog10(例如，在37℃下1周给作0.5log₁₀)。

在各种实施方案中，可以利用在升高温度下进行的加速稳定性研究测量加速应力以缩短组合物的稳定性评价，例如，37℃下1周。这类加速稳定性研究允许预测在较高温度下的稳定性而不必等待真实数据。

在本发明的优选实施方案中，在5℃+/-3℃下至少3个月储存期间病毒滴度的损失少于0.4log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，优选在5℃+/-3℃下至少3个月少于0.3log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，更优选在5℃+/-3℃下至少3个月少于0.2log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL。

在本发明的优选实施方案中，在-20℃+/-3℃下至少3个月储存期间病毒滴度的损失少于0.4log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，优选在-20℃+/-3℃下至少3个月少于0.3log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，更优选在-20℃+/-3℃下至少3个月少于0.2log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL。

在本发明的优选实施方案中，在-50℃+/-3℃下至少3个月储存期间病毒滴度的损失少于0.4log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，优选在-50℃+/-3℃下至少3个月少于0.3log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，更优选在-50℃+/-3℃下至少3个月少于0.2log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL。

在本发明的优选实施方案中，在-80℃+/-3℃下至少3个月储存期间病毒滴度的损失少于0.4log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，优选在-80℃+/-3℃下至少3个月少于0.3log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL，更优选在-80℃+/-3℃下至少3个月少于0.2log₁₀InfU/mL或TCID₅₀/mL。

测定痘病毒滴度的试验例如在Kaufmann and Kabelitz(2002),Methods inMicrobiology Volume 32:Immunology of Infection,Academic Press,ISBN 0125215320中描述。试验得到的滴度记录为空斑形成单位/毫升(PFU/mL)。用于本发明的FACS试验和TCID₅₀试验在实施例中描述，并且可以可选地与任何其他合适的方法一起使用。

根据优选的实施方案，本发明的组合物是水性组合物。在某些实施方案中，所述组合物适合储存在室温下(例如，在环境温度下)、约-20℃-25℃、约-20℃-4℃、约2℃-25℃或者约2℃-8℃。任何实施方案的组合物可以是液体或冷冻液体。本发明的组合物能够在约-20℃-25℃、约-20℃-4℃、约2℃-25℃或者约2℃-8℃延长储存，在每个指定温度范围下超过3个月、6个月、9个月、12个月、24个月或更多。在本发明的优选实施方案中，包含痘病毒的组合物能够在2℃-8℃下延长储存，超过6个月、9个月、12个月、24个月或更多。

如本文所用，“室温”或环境“温度”是25℃+/-3℃的温度。

本发明的痘病毒

本发明的痘病毒是指能够感染人的任何痘病毒属(例如，正痘病毒属、禽痘病毒属、副痘病毒属、亚塔痘病毒属和软疣痘病毒属)。

在各种实施方案中，痘病毒选自正痘病毒属和禽痘病毒属。

在本公开的各种施方案中，痘病毒优选是禽痘病毒。禽痘病毒包括金丝雀痘病毒(CNPV)和鸡痘病毒(FWPV)。

在本公开的各种施方案中，痘病毒优选是正痘病毒(OPV)。本发明的正痘病毒可以包括但不限于天花病毒(也称作variola virus)、痘苗病毒、牛痘病毒和猴痘病毒。

在本发明的各种实施方案中，痘病毒是痘苗病毒或FWPV。

许多FWPV毒株适合本发明。它们是技术人员已知的并且例如在WO 2016/034678中描述为FPV。合适的FWPV包括FP1、FP5、FP9、FPV M、FPV S、

VR-229、

VR-250、USDA毒株和POXVAC-TC。

在本发明的优选实施方案中，痘病毒是痘苗病毒(VACV)。合适的VACV包括例如安卡拉(Ankara)、VACV Western Reserve(WR)、VACV Copenhagen(VACV-COP)、Temple ofHeaven、Paris、Budapest、Dairen、Gam、MRIVP、Per、Tashkent、TBK、Tian Tan、Tom、Bern、Patwadangar、BIEM、B-15、EM-63、IHD-J、IHD-W、Ikeda、DryVax(例如美国专利7,410,644中描述的，也称作VACV Wyeth或New York City Board of Health[NYCBH]毒株)、NYVAC、ACAM1000、ACAM2000、Vaccinia Lister(也称作Elstree)、LC16mO、LC16m8、修饰的痘苗安卡拉(MVA)、如国际专利申请PCT/EP01/02703(WO 01/68820)中表征的MVA-Vero、ACAM3000MVA以及修饰的痘苗病毒Ankara-Bavarian Nordic(MVA-BN)。

在一些实施方案中，VACV选自DryVax、ACAM1000、ACAM2000、Lister、EM-63、VACV-COP、WR、NYCBH、NYVAC和MVA。

在本发明的一些实施方案中，痘病毒是修饰的痘苗安卡拉(MVA)病毒。修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)

在各种实施方案中，MVA和用于产生适合本发明的重组子的MVA是MVA-572、MVA-575、MVA-I721、保藏为

VR-1508^TM的MVA、保藏为

VR-1566^TM的MVA、ACAM3000MVA、MVA-BN或任何相似的减毒MVA毒株。在优选的实施方案中，用于产生重组子的MVA是MVA-575、保藏为

VR-1508^TM的MVA、保藏为

VR-1566^TM的MVA、ACAM3000MVA和MVA-BN。更优选地，用于产生重组子的MVA是MVA-BN。

MVA-572于1994年1月27日保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC,VaccineResearch and Production Laboratory,Public Health Laboratory Service,Centrefor Applied Microbiology and Research,Porton Down,Salisbury,Wiltshire SP40JG,United Kingdom)，保藏号ECACC V94012707。MVA-575于2000年12月7日保藏在ECACCV00120707下。Acam3000MVA于2003年3月27日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，在登录号PTA-5095下(American Type Culture Collection,10801University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209,USA)。MVA-I721在Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms,Institute Pasteur保藏为CNCM I721。MVA-BN于2000年8月30日在ECACC保藏在编号V00083008下。MVA-BN已在国际PCT公开WO 02/042480中描述(还参见例如U.S.Pat.No.6,761,893和6,913,752)。

本发明还涵盖本文描述的任何MVA病毒或MVA-BN的衍生物或变体。MVA或MVA-BN的“衍生物”或“变体”是指表现出与其所指的MVA或MVA-BN基本上相同的复制特征，但是在它们基因组的一个或多个部分表现出差异的MVA或MVA-BN病毒。与保藏的病毒具有相同的“复制特征”的病毒是在CEF细胞和HaCat细胞系(Boukamp et al.[1988],J Cell Biol 106:761-771)、人骨肉瘤细胞系143B(ECACC No.91112502),、人胚肾细胞系293(ECACCNo.85120602)和人子***细胞系HeLa(ATCC No.CCL-2)中以与保***株相似的扩增比例复制的病毒。测定MVA、其衍生物和变体的这些特性的测试和试验是技术人员公知的，例如WO 02/42480中描述的细胞系允许性试验。在示例性细胞系允许性试验中，以低感染复数/细胞，即0.05感染单位/细胞(5x 10⁴TCID₅₀)用亲本以及衍生物或变体MVA病毒感染哺乳动物细胞系。吸收1小时之后，去除病毒接种物并将细胞洗涤3次以去除任何剩余的未吸收的病毒。添加补充了3％FCS的新鲜培养基并且感染持续总计4天(在37℃、5％CO₂下)，这里可以制备病毒提取物。通过将平板在-80℃下冷冻3次终止感染。随后在CEF细胞上利用技术人员公知的方法例如Carroll and Moss[1997],Virology 238,198-211中描述的那些方法测定病毒增殖和细胞病变效应(CPE)。

更特别地，MVA-BN或者MVA-BN的衍生物或变体优选具有在鸡胚成纤维细胞(CEF)中繁殖复制的能力，但是没有在人角质形成细胞系HaCat(Boukamp et al(1988),J.CellBiol.106:761-771)、人骨肉瘤细胞系143B(ECACC保藏号91112502)、人胚肾细胞系293(ECACC保藏号85120602)和人子***细胞系HeLa(ATCC保藏号CCL-2)中繁殖复制的能力。此外，MVA-BN的衍生物或变体在Hela细胞和HaCaT细胞系中具有不超过MVA-575的1/2，更优选不超过1/3的病毒扩增比例。MVA变体的这些特性的测试和试验在WO 02/42480中或在如上文所述的示例性细胞系允许性试验中描述。

术语“不能繁殖复制”或“没有繁殖复制的能力”例如在WO 02/42480中描述，其还教导怎样获得如上文提到的具有期望特性的MVA。该术语应用于这样的病毒，采用WO 02/42480或美国专利6,761,893中描述的试验，所述病毒在感染之后4天具有少于1的病毒扩增比。

术语“无法繁殖复制”是指在感染之后4天具有少于1的病毒扩增比的病毒。WO 02/42480或美国专利6,761,893中描述的试验可用于测定病毒扩增比。

病毒的扩增或复制通常表示为产生自感染细胞的病毒(输出)与最初用来感染细胞的量(输入)的比例，称作“扩增比”。“1”的扩增比定义如下的扩增状态：产生自感染细胞的病毒的量与最初用来感染细胞的量相同，表示感染细胞允许病毒感染和繁殖。相反，少于1的扩增比，即，与输入水平相比输出减少，表明缺少繁殖复制，因此病毒衰减。

在某些实施方案中，包含在任何组合物中的MVA是MVA-BN，优选如保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号V00083008下的MVA-BN或其衍生物。

在一些实施方案中，包含在任何组合物中的MVA是MVA-BN病毒或其衍生物，其在体外于鸡胚成纤维细胞(CEF)中具有繁殖复制的能力，但是在人角质形成细胞细胞系HaCat、人骨肉瘤细胞系143B、人胚肾细胞系293和人子***细胞系HeLa中没有繁殖复制的能力。

在一些实施方案中，包含在任何组合物中的MVA是保藏在欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECACC)登录号V00083008下的MVA-BN病毒或其衍生物，其优选在体外于鸡胚成纤维细胞(CEF)中具有繁殖复制的能力，但是在人角质形成细胞细胞系HaCat、人骨肉瘤细胞系143B、人胚肾细胞系293和人子***细胞系HeLa中没有繁殖复制的能力。

在优选的实施方案中，本文公开的痘病毒或任何优选病毒是纯化或部分纯化的病毒。制备和纯化痘病毒例如VACV或MVA的方法是本领域技术人员已知的，并且在下文进一步描述。

任何实施方案的痘病毒可以是重组或非重组痘病毒，优选重组痘病毒，更优选重组MVA。术语“重组”是指包含***其基因组的外源核酸序列的病毒，更特别是痘病毒，所述外源核酸序列不天然存在于亲代病毒中。因此重组病毒(例如，痘病毒，例如但不限于MVA)是指通过将合成或半合成来源的核酸序列的两个或更多个片段人工组合来制备的核酸或病毒，所述片段不天然存在或以自然中未发现的排列连接至另一核酸。人工组合最常见是通过人工操作核酸的分离片段完成的，利用成熟的遗传工程技术。如本文所述的“重组”痘病毒通常是指通过标准遗传工程方法制备的痘病毒，例如，本发明的MVA因此是遗传工程化或遗传修饰的MVA。术语“重组MVA”因此包括在它们的基因组中具有稳定整合的重组核酸(优选为转录单元形式)的MVA(例如，MVA-BN)。转录单元可以包括启动子、增强子、终止子和/或沉默物。本发明的重组MVA可以在调节元件诱导时表达异源抗原决定簇、多肽或蛋白(抗原)。

术语“抗原决定簇”是指刺激宿主的免疫系统产生抗原特异性免疫应答的任何分子，无论细胞应答或体液抗体应答。抗原决定簇可以包括在宿主中引发免疫应答并形成抗原的部分的蛋白、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位，蛋白、多肽、抗原蛋白片段和表位的同源物或变体，包括例如糖基化的蛋白、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位，以及编码这类分子的核苷酸序列或基因。因此，蛋白、多肽、抗原蛋白片段和表位不限于特定天然核苷酸或氨基酸序列，而是涵盖与天然序列相同的序列以及对天然序列的修饰，例如缺失、添加、***和取代。

当用于抗原决定簇的上下文时，术语“衍生物”和“变体”优选地在核苷酸或氨基酸序列水平与特定蛋白、多肽、抗原蛋白片段、抗原和表位中的参考抗原决定簇具有至少约50％，至少约60％或65％，至少约70％或75％，至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更典型地，至少约90％、91％、92％、93％和94％，甚至更典型地至少约95％、96％、97％、98％或99％，最典型的，至少约99％相同性。确定核酸和氨基酸之间的序列相同性的技术是本领域已知的。两个或更多个序列可以通过确定它们的“百分比相同性”进行比较。无论核酸或氨基酸序列，两个序列的百分比相同性是两个比对的序列之间完全匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。

术语“表位”是指B-和/或T-细胞应答的抗原上的位点，单独或连同另一蛋白，例如，主要组织相容性复合物(“MHC”)蛋白或T-细胞受体。表位可以由以下氨基酸形成：连续氨基酸或者通过蛋白的二级和/或三级折叠并列的不连续氨基酸。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常在独特的空间构象中包括至少5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸，但是一般少于20个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如x-射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol.66,Glenn E.Morris,Ed(1996)中的“表位作图方案”。

在某些实施方案中，本发明的重组病毒是包含***其基因组的编码外源核酸序列的核酸的重组病毒。

当用于本文时，术语“外源”表示将提到的分子引入病毒基因组。例如，可以通过将编码核酸引入病毒基因组来引入所述分子。因此，当提及表达外源核酸时，使用该术语是指将可表达形式的编码核酸引入病毒。相反，术语“内源”是指宿主中存在的参考分子。

在某些实施方案中，本发明的重组病毒是包含***其基因组的表达外源核酸序列的核酸的重组病毒。

如本文所用，可以互换使用的术语“表达(expressed)”、“表达(expressed)”、“表达(expressing)”、“表达(expressing)”等表示单独的转录以及所关注的序列的转录和翻译。因此，当提到以DNA形式存在的核苷酸序列的表达时，这种表达所得的产物可以是RNA(由待表达的序列仅转录得到)或多肽序列(由待表达的序列转录并翻译得到)。因此术语“表达”还包括RNA和多肽产物均来自所述表达并在相同的共享环境中保持在一起的可能性。例如，当mRNA在其翻译为多肽产物之后持续存在时情况就是这样。

根据其他实施方案，任何实施方案的外源核酸序列可以编码抗原，优选所述抗原是病毒抗原或肿瘤相关抗原(TAA)。

优选地，病毒抗原源自病毒，例如丝状病毒(优选例如WO 2016/034678中描述的马尔堡病毒(MARV)和/或埃博拉病毒(EBOV))，人免疫缺陷病毒I型(HIV-1；例如gp 120或gp160)，***(FMD)病毒(参见WO 2016/202828)，人或动物疱疹病毒，优选来自HSV1或HSV2，巨细胞病毒(CMV)，水痘带状疱疹病毒(VZV)，或者来自肝炎病毒例如乙型肝炎病毒(HBV)，例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物(参见WO 2011/015656和WO 2013/007772)，甲型肝炎病毒(HAV)，丙型肝炎病毒(HCV；参见WO 04/111082；优选来自基因型1b毒株的非结构HCV蛋白)；戊型肝炎病毒(HEV)，人***瘤病毒(HPV；参见WO 90/10459、WO 95/09241、WO 98/04705、WO 99/03885和WO 07/121894；优选来自HPV16和HPV18毒株的E6和E7蛋白)，呼吸道合胞病毒(RSV；参见WO 2014/019718)，或者流感病毒(WO 2012/048817)。

根据本发明的某些实施方案，所述抗原优选选自HCV、HBV、HIV-1、HPV、RSV、EBOV和/或MARV，优选EBOV和MARV。

在某些实施方案中，重组MVA和外源核酸序列可以是如WO 2016/034678所述编码丝状病毒的抗原蛋白或抗原决定簇的任何重组MVA和核酸，因此该申请完全援引加入本文。如果援引加入的材料与本说明书矛盾或不一致，则本发明的说明书会如上文已提到的取代任何这样的材料。援引加入的还包括WO 2016/034678中的序列表。

在特定实施方案中，本发明的重组病毒(优选MVA)是包含编码一种或多种丝状病毒蛋白(优选一种或多种丝状病毒糖蛋白)，优选3种丝状病毒糖蛋白的核酸的重组病毒。

在进一步的特定实施方案中，丝状病毒糖蛋白选自苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)和马尔堡病毒(MARV)。

在进一步的特定实施方案中，丝状病毒糖蛋白选自苏丹埃博拉病毒(SEBOV)、扎伊尔埃博拉病毒-Mayinga(ZEBOV-Mayinga)和马尔堡病毒(MARV-Musoke)。在其他特定实施方案中，本发明的重组病毒(优选MVA)是包含编码SEBOV、ZEBOV-Mayinga和MARV-Musoke的丝状病毒糖蛋白的核酸的重组病毒。

在某些实施方案中，本发明的重组病毒(优选MVA)包含进一步编码丝状病毒核蛋白的核酸，优选埃博拉病毒的丝状病毒核蛋白，更优选象牙海岸埃博拉病毒的核蛋白(NP-EBOV-CdI)。

在某些优选实施方案中，用于本发明的组合物的重组病毒是如WO 2016/034678描述的命名为MVA-mBN226、MVA-mB255、MVA-mBN254的重组MVA。

在某些实施方案中，肿瘤相关抗原选自癌胚抗原(CEA)、粘蛋白-1(MUC-1)、***酸性磷酸酶(PAP)、B7-1(也称作CD80)、胞内粘附分子-1(ICAM-1，也称作CD54)、淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3，也称作CD58)、***特异性抗原(PSA)、HER-2和brachyury或者它们的任何组合。优选地，TAA选自CEA、MUC-1、B7-1、ICAM-1、LFA-3、HER-2和brachyury。这些重组子的进一步细节例如WO 2015/175340和WO 2008/045346中描述。

制备非重组和重组痘病毒的方法

获得重组痘病毒(例如，VACV或MVA)或者将外源编码序列***痘病毒(例如，VACV或MVA)的方法是本领域技术人员公知的。例如，标准分子生物学技术的方法例如DNA的克隆、DNA和RNA分离、蛋白印记分析、RT-PCR和PCR扩增技术在Molecular Cloning,Alaboratory Manual 2^nd Ed.(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))中描述，并且处理和操作病毒的技术在Virology Methods Manual(B.W.J.Mahy et al.(eds.),Academic Press(1996))中描述。相似地，痘病毒的处理、操作和遗传工程的技术和诀窍在Molecular Virology:A Practical Approach(A.J.Davison&R.M.Elliott(Eds.),The Practical Approach Series,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford,UK(1993)，参见，例如，Chapter 9:Expression of genes byVaccinia virus vectors)；Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Son,Inc.(1998)，参见，例如，Chapter 16,Section IV:Expression of proteins inmammalian cells using vaccinia viral vector)；和Genetic Engineering,RecentDevelopments in Applications,Apple Academic Press(2011),Dana M.Santos，参见，例如，Chapter 3:Recombinant-mediated Genetic Engineering of a BacterialArtificial Chromosome Clone of Modified Vaccinia Virus Ankara(MVA))中描述。重组MVA的构建和分离还在Methods and Protocols,Vaccinia Virus and Poxvirology,ISBN 978-1-58829-229-2(Staib et al.),Humana Press(2004)参见,例如第7章中描述。

制备和纯化基于病毒的材料例如根据本发明使用的病毒载体和/或病毒的方法是本领域技术人员已知的。可用方法包括在CEF细胞或细胞系中复制病毒，特别是DF-1(US 5,879,924)、EBx鸡细胞系(WO 2005/007840)、EB66鸭细胞(WO 08/129058)或番鸭(Cairinamoschata)永生化禽细胞(WO 2007/077256或WO 2009/004016)。它们可以在本领域技术人员公知的条件下培养。在CEF细胞中病毒培养和病毒扩增的无血清方法例如在WO 2004/022729中描述。制备病毒的上游和下游过程可以获得自WO 2012/010280或2016/087457。可用于纯化本申请的病毒的方法在WO 03/054175、WO 07/147528、WO 2008/138533、WO 2009/100521和WO 2010/130753中详细公开。在鸭胚源细胞中增殖和纯化重组痘病毒的示例性方法在Leon et al.[2016],The EB66cell line as a valuable cell substrate for MVA-based vaccines production,Vaccine 34:5878-5885中描述。

在一些实施方案中，所述组合物包含的病毒滴度为约1x10⁶InfU/mL-约2x10⁹InfU/mL，优选约1x10⁷InfU/mL-约2x10⁹InfU/mL，更优选约1x10⁷InfU/mL-约4x10⁸InfU/mL。在某些其他实施方案中，滴度约为0.1x10⁸InfU/mL-约4x10⁸InfU/mL。

硫酸盐

在某些实施方案中，硫酸盐是单价阳离子盐。本发明的单价阳离子是例如钠阳离子、钾阳离子、镁阳离子或铵阳离子。

在某些实施方案中，本发明的硫酸盐选自硫酸钠(sodium sulfate)、硫酸钾(potassium sulfate)、硫酸镁(magnesium sulfate)和/或硫酸铵(ammonium sulfate)。

在优选的实施方案中，硫酸盐是硫酸钠、硫酸镁和/或硫酸铵，优选硫酸钠。在某些实施方案中，硫酸钠盐(sodium sulfate salt)是一元和/或二元硫酸盐。优选地，硫酸盐是硫酸二钠(disodium sulfate,Na₂SO₄)和/或硫酸氢钠(sodium hydrogen sulfate,NaHSO₄)盐，优选地，硫酸盐是硫酸二钠(Na₂SO₄)盐。

在某些实施方案中，硫酸盐(例如，硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁和/或硫酸铵)浓度是约5mM-300mM、约5mM-250mM、约5mM-220mM、约5mM-200mM、约5mM-180mM、约5mM-150mM、约5mM-120mM、约10mM-300mM、约20mM-300mM、约30mM-300mM、约40mM-300mM、约50mM-300mM、约70mM-300mM、约80mM-300mM、约80mM-150mM、约90mM-150mM、约90mM-120mM、约90mM-110mM、约48mM-110mM或约10mM-110mM。在某些实施方案中，本发明的组合物包含浓度为约100mM的硫酸盐，优选硫酸钠(特别是Na₂SO₄和/或NaHSO₄)、硫酸钾、硫酸镁和/或硫酸铵，更优选硫酸钠和/或硫酸铵，最优选硫酸钠。

在某些实施方案中，硫酸钠(特别是Na₂SO₄和/或NaHSO₄)的浓度在如上文对其他硫酸盐描述的浓度范围之一中，优选如本文所述的组合物中的Na₂SO₄和/或NaHSO₄盐以约50-150mM的浓度，优选约100mM的浓度存在。

在本发明的某些实施方案中，如本文所述的硫酸盐和任何优选的硫酸盐是无机盐，优选其中所述无机盐不含碳原子。

在本发明的某些实施方案中，硫酸盐是药学可接受的硫酸盐。

在某些实施方案中，本发明的组合物不含或基本上不含十二烷基硫酸钠。术语“基本上不含十二烷基硫酸钠”意图表示，十二烷基硫酸钠即使存在，对制剂中病毒的稳定也没有多大作用，本领域技术人员不会从稳定角度判断其存在是有益的。

pH和缓冲液

本发明的组合物pH为约6.0-8.5，优选为约6.5-8.5。

在某些实施方案中，本发明的组合物pH为约6.5-8.5、约6.6-8.0、约6.8-7.5、6.8-7.2、约6.8-8.2、约6.9-8.2、约7.0-8.5、约7.2-8.2、约7.4-8.2、约7.6-8.2或约7.5-8.5。

为了保持这个pH，本发明的组合物包含在组合物的pH下具有缓冲能力的缓冲液。如本文所用的术语“缓冲液”或“缓冲溶液”是指由弱酸及其共轭碱的混合物或者反之组成的水性溶液。当向其添加少量或适量强酸或强碱时其pH变化很小，因此其用来防止溶液pH的变化。缓冲溶液在广泛的应用中用作保持pH在几乎恒定值的一种方法。对于酸性区域中的缓冲液，可以通过向缓冲剂添加强酸例如盐酸将pH调整至期望值。对于碱性缓冲液，可以添加强碱；例如氢氧化钠。或者，缓冲液混合物可以制备自酸及其共轭碱的混合物。例如，乙酸缓冲液可以制备自乙酸和乙酸钠的混合物。相似地，碱性缓冲液可以制备自碱及其共轭酸的混合物。优选地，所述缓冲液是药学可接受的缓冲液。

缓冲液的实例包括但不限于磷酸缓冲盐水(例如PBS)、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液(例如SSC)、柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液、TES、DIPSO、TEA、EPPS、Bicine、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl)、Tricine(N-[三(羟甲基)甲基)-甲基]-甘氨酸)、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、POPSO、MES、琥珀酸缓冲液。磷酸缓冲盐水(缩写PBS)是水基盐溶液，包含磷酸钠、氯化钠，以及在一些组合物中，氯化钾和磷酸钾。优选地，缓冲液选自TRIS、TRIS-HCL、Tricine、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐/磷酸盐和磷酸盐缓冲液。在进一步优选的实施方案中，缓冲液是TRIS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、柠檬酸盐/磷酸盐或磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液优选包含Na₂HPO₄和KH₂PO₄的混合物或者Na₂HPO₄和NaH₂PO₄的混合物。柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液优选包含Na₂HPO₄和柠檬酸钠。在某些实施方案中，缓冲液包含Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。

所述缓冲液优选以约5mM-40mM的浓度存在。在某些实施方案中，所述缓冲液以约5mM-25mM、约8mM-22mM、约8mM-15mM mM或约5mM-15mM的浓度存在。在某些实施方案中，所述缓冲液以约10mM的浓度存在。

在进一步优选的实施方案中，所述缓冲液是Tris缓冲液，其pH为约6.5-8.5，优选约7.5-8.5，最优选pH为约8.0。

在进一步优选的实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液，其pH为约6.5-8.5，pH为约6.5-7.5，pH为约7.0-8.5，pH为约6.9to 7.6，pH为约7.3-7.6，pH为约6.9-7.2，更优选pH为约7.0，更优选pH为约7.5。

在进一步优选的实施方案中，所述缓冲液是柠檬酸盐缓冲液或柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液，pH为约6.0-8.0，优选pH为约6.5-7.5。

其他成分

本发明的组合物可以进一步包括一种或多种药学可接受和/或批准的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、抗氧化剂、稀释剂和/或稳定剂。这类辅助物质可以是但不限于一种或多种糖、糖醇、多元醇、去污剂、一种或多种氨基酸、粘度增强剂、一种或多种额外的盐、抗氧化剂、乙醇、EDTA等。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含糖、糖醇和/或多元醇。

在某些其他实施方案中，本发明的组合物包含糖，其选自蔗糖、乳糖、甘露糖和海藻糖。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含多元醇，其选自山梨醇、甘油或甘露醇，优选甘油和/或山梨醇。在某些实施方案中，本发明的组合物包含山梨醇。在某些实施方案中，本发明的组合物包含甘油。

在某些实施方案中，任何组合物中所述糖或糖醇的浓度为约1％(w/w)-10％(w/w)。在优选的实施方案中，所述组合物中糖或糖醇的所述浓度为约2％(w/w)-10％(w/w)、3％(w/w)-10％(w/w)、4％(w/w)-10％(w/w)、1％(w/w)-9％(w/w)、1％(w/w)-8％(w/w)、1％(w/w)-7％(w/w)、1％(w/w)-6％(w/w)、2％(w/w)-6％(w/w)、2.5％(w/w)-6％(w/w)、4％(w/w)-6％(w/w)、5％(w/w)-7％(w/w)，或者是约6％(w/w)。在某些实施方案中，所述组合物中蔗糖的浓度是约6％(w/w)。

在某些实施方案中，所述组合物中多元醇的浓度为约1％(w/w)-6％(w/w)。在优选的实施方案中，所述组合物中多元醇的所述浓度为约2％(w/w)-6％(w/w)、3％(w/w)-6％(w/w)、4％(w/w)-6％(w/w)、1％(w/w)-4％(w/w)、1％(w/w)-3％(w/w)、1％(w/w)-2.5％(w/w)或者是约5％(w/w)。在某些实施方案中，所述组合物中甘油的浓度为约1％(w/w)-6％(w/w)。在优选的实施方案中，所述组合物中多元醇的所述浓度为约2％(w/w)-6％(w/w)、3％(w/w)-6％(w/w)、4％(w/w)-6％(w/w)、1％(w/w)-4％(w/w)、1％(w/w)-3％(w/w)、1％(w/w)-2.5％(w/w)或者是约5％(w/w)。在某些实施方案中，所述组合物中甘油的浓度为约1％(w/w)-6％(w/w)，优选5％(w/w)。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含去污剂，优选非离子去污剂。已显示非离子去污剂(例如通过减少聚集)使液体状态的各种病毒稳定(Evans et al.[2004],J.Pharm Sci.93:2458-75,US 7,456,009,US 2007/0161085)，或者用于添加以使至容器表面的吸附减少。

在某些实施方案中，去污剂选自聚山梨酯、月桂基硫酸钠和泊洛沙姆，优选聚山梨酯选自聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60和聚山梨酯-80。

在某些实施方案中，聚山梨酯(特别是聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60和聚山梨酯-80具有约0.001％(w/w)-约1％(w/w)的浓度，优选约0.001％(w/w)-约0.5％(w/w)。在优选的实施方案中，聚山梨酯具有约0.001％(w/w)-约0.1％(w/w)、约0.001％(w/w)-约0.008％(w/w)、约0.001％(w/w)-约0.005％(w/w)的浓度。聚山梨酯浓度优选高于0.001％(w/w)但优选低于0.005％(w/w)。

在某些实施方案中，所述泊洛沙姆选自泊洛沙姆182、泊洛沙姆188、泊洛沙姆121、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和/或泊洛沙姆407。

在某些实施方案中，泊洛沙姆(特别是泊洛沙姆182、泊洛沙姆188、泊洛沙姆121、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和/或泊洛沙姆407)的浓度为约0.001％(w/w)-1％(w/w)，优选约0.005％(w/w)-0.5％(w/w)，约0.01％(w/w)-0.1％(w/w)，约0.01％(w/w)-0.05％(w/w)，约0.015％(w/w)-0.03％(w/w)，或者是约0.025％(w/w)。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含氨基酸，优选其中氨基酸选自精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酸盐、谷氨酸和天冬氨酸或者它们的任何组合。在优选的实施方案中，氨基酸选自谷氨酸、精氨酸或甘氨酸。氨基酸优选是L-异构体，优选L-精氨酸、L-甘氨酸和或L-组氨酸。所述氨基酸不是由本发明的重组或非重组病毒编码的氨基酸。因此，氨基酸不通过病毒(例如，VACV或MVA)的纯化过程包含在组合物中，而是在制备组合物用于制造疫苗期间添加。

氨基酸优选以约0.1％(w/w)-约10％(w/w)的浓度存在于组合物中，优选约0.1％(w/w)-约5％(w/w)。在进一步的实施方案中，氨基酸优选以约0.1％(w/w)-约2.5％(w/w)的浓度存在于组合物中，优选约2.0％(w/w)-约5％(w/w)。

已发现氨基酸，特别是组氨酸、精氨酸或甲硫氨酸，使液体状态的各种病毒稳定(参见EVANS et al.J Pharm Sci.2004Oct,93(10):2458-75,US 7,456,009,US 2007/0161085,US 7,914,979,WO 2014/029702,WO 2014/053571)。当组氨酸存在于液体组合物中以提高稳定性时，组氨酸一般以至少5mM的浓度存在，并且优选至少10mM(参见EVANS etal.J Pharm Sci.2004Oct,93(10):2458-75,US 7,456,009,WO 2014/029702)。当精氨酸存在于液体组合物中以提高稳定性时，精氨酸一般以至少50mM的浓度存在(参见US 2007/0161085，至少1％(w/v)精氨酸对应于至少约57.4mM)，并且有时优选至少150mM，特别是约300mM(参见WO 2014/029702)。当甲硫氨酸存在于液体组合物中以提高稳定性时，甲硫氨酸一般以至少25mM的浓度存在，并且优选约67mM(参见WO 2014/029702)。

在某些实施方案中，氨基酸(优选精氨酸，更优选L-精氨酸)以低于300mM的浓度存在，优选低于150mM，低于100mM，低于75mM，或者甚至低于50mM。而且，当甲硫氨酸存在于本发明的液体组合物中时，其优选以低于60mM的浓度存在，优选低于50mM，低于40mM，低于30mM，或者甚至低于25mM。更一般地，当一种或多种氨基酸存在于本发明的组合物中时，氨基酸优选以低于300mM的浓度存在，优选低于150mM，低于100mM，低于75mM，低于50mM，低于40mM，低于30mM，低于25mM，低于20mM，低于10mM，低于9mM，低于8mM，低于7.5mM，低于7mM，低于6mM，或者甚至低于5mM。

在某些实施方案中，本发明的组合物不含组氨酸、精氨酸和/或谷氨酸。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含一种或多种额外的药物添加剂例如粘度增强剂。本发明的粘度增强剂包括但不限于聚乙二醇(PEG)、纤维素例如甲基纤维素(MC)或羧甲基纤维素(CMC)、明胶、琼脂和/或琼脂糖及其衍生物。例如，粘度增强剂的浓度可以为本发明的组合物的约0.1％(w/w)-10％(w/w)，优选约1％(w/w)-5％(w/w)。

此外，粘度增强剂可以增加溶液的粘度。

在本发明的某些实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含药学可接受的盐。在某些优选的实施方案中，所述盐是氯化钠(NaCl)。氯化钠优选以约10mM-100mM的浓度存在于本发明的组合物中，优选约20mM-100mM、约40mM-100mM或约50mM-100mM。在一优选实施方案中，氯化钠以约70mM的浓度存在。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含一种或多种抗氧化剂。

在某些实施方案中，抗氧化剂选自甲硫氨酸、抗坏血酸、α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、anoxomer；丁羟茴醚、丁羟甲苯、柠檬酸、柠檬酸盐和叔丁基氢醌。抗氧化剂赋形剂可以以痘病毒组合物的0.01％(w/w)、0.05％(w/w)、0.1％(w/w)、0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)的浓度存在，包括其间的所有值和范围。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含螯合剂，优选药学可接受的螯合剂。螯合剂可以进一步提高组合物的稳定性，特别是液体状态的组合物。

在某些实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(o-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基丁二酸(DMSA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)，优选所述螯合剂是EDTA。

在某些实施方案中，螯合剂以至少50μM的浓度存在，优选浓度为50μM-1mM、50μM-750μM、50μM-500μM、50μM-250μM、50μM-150μM、50μM-100μM、50μM-75μM、100μM-300μM、100μM-250μM、100μM-200μM、100μM-150μM、150μM-1mM、150μM-750μM、150μM-500μM或150μM-250μM，优选所述螯合剂可以以50μM-150μM的浓度存在。

在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含乙醇。在某些实施方案中，本发明的组合物进一步包含浓度为0.05％(v/v)-5％(v/v)的乙醇，优选浓度为0.01％(v/v)-5％(v/v)、0.01％(v/v)-2,5％(v/v)、0.01％(v/v)-1,5％(v/v)、0.1％(v/v)-5％(v/v)、0.1％(v/v)-2,5％(v/v)、0.1％(v/v)-1,5％(v/v)或0.25％(v/v)-0.75％(v/v)。

渗透压

在一些实施方案中，本发明的组合物具有宿主生理上可接受的离子强度。在组合物中包括盐的目的是达到期望的离子强度或渗透压以稳定组合物以及减少作为疫苗的组合物的副作用或在注射部位的局部反应。在一些实施方案中，本发明的组合物的总渗透压(溶液中分子的总数量)为约200mOsm/L-约1000mOsm/L，为约200mOsm/L-约900mOsm/L，约200mOsm/L-约800mOsm/L，约200mOsm/L-约700mOsm/L，约200mOsm/L-约600mOsm/L，约200mOsm/L-约500mOsm/L。在一些实施方案中，本发明的组合物具有为约250mOsm/L-约450mOsm/L的总渗透压，优选约300mOsm/L的总渗透压。所述渗透压促进在2℃-8℃或更高的温度下长期储存，同时还使得组合物适合肠胃外，特别是肌肉内或皮下注射。对离子强度的贡献可以来自缓冲化合物产生的离子以及非缓冲盐的离子。优选地，溶液的渗透压和离子浓度与人体匹配(等渗)。

进一步优选的组合物

在一实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含a)痘病毒，b)缓冲液，和c)硫酸盐，其浓度为约5mM-约300mM，其中所述组合物pH为约6.0-约8.5，优选地，所述痘病毒是MVA，更优选地，所述痘病毒是表达丝状病毒抗原的MVA。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约5mM-25mM的Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，浓度为约5-150mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约7.0-8.5。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约5mM-25mM的Tris缓冲液，浓度为约5-150mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约7.5-8.5。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约8mM-12mM的Tris缓冲液，以及浓度为80mM-100mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约7.7-8.2的。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约8mM-12mM的Tris缓冲液，浓度为90mM-110mM的硫酸钠，有或无4％(w/w)-6％(w/w)蔗糖或甘油，其中所述组合物pH为约7.6-8.2。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约8mM-12mM的Tris缓冲液，浓度为45mM-55mM的硫酸钠和浓度为约60mM-80mM的氯化钠，其中所述组合物pH为约7.6-8.0。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的Tris缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约8。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的Tris缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠与4％(w/w)-6％(w/w)蔗糖或甘油，其中所述组合物pH为约8。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的Tris缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠和浓度为约6％(w/w)的蔗糖，其中所述组合物pH为约8。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的Tris缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠和浓度为约5％(w/w)的甘油，其中所述组合物pH为约8。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的Tris缓冲液，浓度为约50mM的硫酸钠和约70mM氯化钠，其中所述组合物pH为约7.7。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约5mM-25mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约5-150mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约6.8-7.5。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约7.5mM-12mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约90mM-110mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约6.8-7.2。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约6.8-7.8。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约7。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠，其中所述组合物pH为约7.5。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约7.5mM-12mM的磷酸盐缓冲液，浓度为90mM-110mM的硫酸钠，有或无4％(w/w)-6％(w/w)蔗糖或甘油，其中所述组合物pH为约6.8-7.2。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠,有或无4％(w/w)-6％(w/w)蔗糖或甘油，其中所述组合物pH为约7。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠和浓度为约6％(w/w)的蔗糖，其中所述组合物pH为约7。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠和浓度为约5％(w/w)的甘油，其中所述组合物pH为约7。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠,有或无4％(w/w)-6％(w/w)蔗糖或甘油，其中所述组合物pH为约7.5。

在本发明的另一实施方案中，所述组合物包含浓度为约10mM的磷酸盐缓冲液，浓度为约100mM的硫酸钠和浓度为约5％(w/w)的甘油，其中所述组合物pH为约7.5。

在某些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的任何实施方案的组合物。

在某些实施方案中，包含任何实施方案的组合物的药物组合物是适合肠胃外给药的药物组合物。

在本发明的某些实施方案中，包含任何实施方案的组合物的药物组合物是适合肌肉内、皮下、静脉内或鼻内施用的药物组合物。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含在小瓶中。术语“小瓶”是指能够储存活性药物成分如本文公开的病毒的任何容器、器皿、药筒、装置、玻璃安瓿或注射器。术语小瓶、容器、器皿、药筒、装置、玻璃安瓿或注射器因此可以互换使用。小瓶通常由惰性材料制成，特别是玻璃(例如DIN 2R I型硼硅酸盐玻璃小瓶)或聚合材料。在优选的实施方案中，所述组合物包含在注射器中。

本发明的组合物可以通过本领域已知的任何方式给药至个体，优选人。给药途径包括但不限于肌肉内注射、皮下注射、皮内注射、静脉内施用、鼻内给药、透皮给药、经皮(transcutaneous)给药或经皮肤(percutaneous)给药。给药模式、给药的剂量和数量可以由本领域技术人员以已知方式优化。

在某些实施方案中，本申请的组合物包含剂量范围为10⁴-10⁹TCID₅₀/mL、10⁵-5x10⁸TCID₅₀/mL、10⁶-10⁸TCID₅₀/mL或10⁷-10⁸TCID₅₀/mL的病毒。个体(优选人)的优选剂量包含10⁶-10⁹TCID₅₀，包括10⁶TCID₅₀、10⁷TCID₅₀或10⁸TCID₅₀的剂量。优选地，人的剂量包含至少2x10⁷TCID₅₀、至少3x 10⁷TCID₅₀、至少5x 10⁷TCID₅₀、至少1x 10⁸TCID₅₀、至少2x 10⁸TCID₅₀，优选在0.1mL-0.5mL的体积中。

本发明还涉及本发明的任何实施方案的组合物或药物组合物用于治疗和/或预防疾病或者抗病原体，优选地，疾病选自癌症或传染性疾病。

本发明还涉及本发明的任何实施方案的组合物或药物组合物在制造用于治疗和/或预防疾病或者抗病原体的药物中的用途，优选地，疾病选自癌症或传染性疾病。

另一实施方案涉及一种用本发明的任何实施方案的组合物或药物组合物免疫接种有此需要的个体(优选人)的方法。

另一实施方案涉及一种治疗和/或预防疾病或者抗病原体的方法，优选选自癌症或传染性疾病的疾病，所述方法包括向有此需要的个体(优选人)给药如本文所述的组合物或药物组合物。

在某些实施方案中，本发明涉及一种稳定痘病毒组合物的方法，所述方法包括制备任何实施方案的组合物。

在某些实施方案中，本发明涉及一种稳定痘病毒组合物的方法，所述方法包括制备任何实施方案的组合物并在范围为2摄氏度-8摄氏度的温度下储存所述组合物。

在某些实施方案中，本发明涉及一种稳定痘病毒组合物的方法，所述方法包括向痘病毒组合物添加浓度为约5mM-300mM的硫酸盐的步骤，优选添加浓度为约10mM-140mM的硫酸盐。

在某些实施方案中，本发明涉及一种稳定任何实施方案的痘病毒组合物的方法，其中所述痘病毒组合物包含缓冲液，并且其中所述组合物pH为约6.5-8.5。

下面的详细实例是为了有助于更好地理解本发明。但是，本发明不受实例限制。考虑到本文公开的本发明的说明和实施，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。

实施例

实施例1

包含药物物质的液体痘病毒的制备

以下实施例中使用的MVA-BN-FILO(MVA-mBN266)已在WO 2016/034678中详细描述。MVA编码3种丝状病毒糖蛋白，苏丹埃博拉病毒(GP-SEBOV)、Zaire-Mayinga埃博拉病毒(GP-ZEBOV-Mayinga)和Musoke马尔堡病毒(GP-MARV-Musoke)的糖蛋白以及象牙海岸埃博拉病毒(NP-EBOV-CdI)的核蛋白。将GP-ZEBOV-Mayinga和GP-MARV-Musoke的表达盒***基因间隔区IGR 148/149。如WO 2016/034678所述将GP-SEBOV和NP-EBOV-CdI的表达盒***痘病毒启动子下的基因间隔区IGR 88/89。利用技术人员已知的标准方法纯化重组病毒。将具有5x10⁸InfU/mL的病毒浓度的MVA-BN-FILO原料药(bulk drug substance,BDS)储存在含有140mM NaCl的pH 7.7的10mM Tris中，为了提高产品在2℃-8℃下的稳定性，利用各种盐、糖添加剂、氨基酸和缓冲液已分析了超过200种不同制剂。用硫酸钠(Na₂SO₄)获得了最佳结果。

实施例2

pH、缓冲液和硫酸盐的影响

已利用超滤/渗滤将MVA-BN-FILO BDS缓冲液置换为MilliQ级水。然后掺入特定体积的浓缩Tris缓冲液(在不同pH)和硫酸钠(Na₂SO₄)溶液以便获得最终制剂。这种制剂，制剂B，由10mM Tris缓冲液和100mM Na₂SO₄组成，并且分为分别具有pH 7.5、8、8.5和9的制剂B1、B2、B3和B4。

没有100mM Na₂SO₄(制剂A1、A2、A3和A4)的相同组合物作为比较物。表1给出制备的制剂的综述。所有制剂均具有3.75x10⁸InfU/mL的MVA病毒效价。

表1:本研究中制备的制剂的组成

	组成
		制剂A1	10mM Tris pH 7.5
制剂A2	10mM Tris pH 8
		制剂A3	10mM Tris pH 8.5
制剂A4	10mM Tris pH 9
		制剂B1	10mM Tris pH 7.5+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
制剂B2	10mM Tris pH 8+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
		制剂B3	10mM Tris pH 8.5+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
制剂B4	10mM Tris pH 9+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>

使每种制剂处于加速应力条件在25℃下1周，其为已知导致MVA降解的条件。在施加加速应力之前和之后测量样品。在Fluoromax 4荧光分光光度计(Jobin Yvon Horiba,UK)上进行各向异性(图1)和内源荧光(表示为图2的发射峰移位和发射强度变化)的测量。在Zetasizer上进行动态光散射测量(表示为图2的Z-平均直径变化和多分散性指数(PDI)变化)。此外，在施加加速应力之前和之后还测量pH。

结果和结论

各向异性测量的结果在图1中示出。显示在施加加速应力之后所有各向异性扫描均改变。对于所有制剂，各向异性扫描在应力之后减少，这表明MVA的蛋白中的激发基团变得更加柔性。柔性的这种增加可以归因为蛋白的那些特定基团的展开和/或蛋白构建体的解离。但是，当溶液中有硫酸盐存在时，这种变化的程度不太明显。此外，在包含硫酸盐的制剂中，在不同pH下变化相似，表明硫酸盐的强健稳定效应。考虑到各向异性与蛋白浓度和光散射无关，这表明用这种方法获得的结果非常可靠。

图2示出制剂A1-A4(没有Na₂SO₄)和B1-B4(有Na₂SO₄)在加速应力之后的pH变化、发射峰位移、发射强度变化、Z-平均直径和多分散性指数(PDI)变化的结果。硫酸盐的存在对胶体稳定性有显著影响，这可以从Z-平均直径和PDI的变化看到，其在包含硫酸盐的制剂中更低。提高的胶体稳定性表示颗粒混合物不容易聚集或解离。因为MVA-BN-FILO的胶体不稳定性和病毒效力降低之间有相关性，提高的胶体稳定性正面影响病毒的活性。观察到的pH和发射强度的变化是有限的，特别是对于包含Na₂SO₄的制剂在pH 7.5和8.0下。因为发射强度可以受样品的散射特性影响，发射强度可以由于样品的散射特性增加而减少。与发射强度相反，峰位移不依赖于光的散射，并且结果显示对于所有硫酸盐制剂，峰位移小。这表明在这些制剂中蛋白结构的构象变化是有限的，并且硫酸盐具有稳健的稳定效应。

实施例3

实验设计和方法

为了进一步研究硫酸盐对MVA病毒稳定性的影响，我们测试了具有不同盐的几种额外制剂。这些额外制剂的综述在表2中示出。

表2:测试制剂的组成

使每种制剂处于已知导致MVA降解的加速应力条件(在37℃下1周)。在施加加速应力之前和之后从每种制剂采集样品并测量。在BioTek Neo酶标仪上进行浊度测量。在Zetasizer上进行动态光散射(DLS)(表示Z-平均直径变化和PDI变化)测量。

结果和结论

这个实验中获得的所有结果的综述在图3中示出。每个图代表在不同pH下每种制剂获得的结果。图的每个柱示出一个单独测定获得的测量结果。

从浊度结果看到包含MgCl₂的制剂(制剂E1-4)在加速应力之后表现出最少变化，然后是Na₂SO₄制剂(直接B1-4)和MgSO₄制剂(制剂D1-4)，它们看来浊度变化有限。应当注意由于溶液中存在颗粒，浊度是光的总体散射的结果。这种散射的程度或浊度取决于许多因素，粒径、颗粒浓度和颗粒形状等。胶体的额外信息由DLS结果(Z-平均直径和PDI)提供。

加速应力之后，包含CaCl₂的制剂(制剂C1-4)的Z-平均直径的变化最小。但是，这些制剂中的初始Z-平均直径超过900nm。对于MVA制剂这是相对大的(MVA大小为约200nm)，表明在施加加速应力之前存在初始聚集。不管包含CaCl₂的制剂的结果，在应力之后包含NaCl的制剂(制剂F1-4)的Z-平均直径表现出最少变化。有趣的是，Na₂SO₄制剂(制剂B1-4)看来表现与包含NaCl的制剂一样好，然后是MgSO₄制剂(制剂D1-4)。这个观察表明制剂中硫酸盐的存在提高胶体稳定性。与MgSO₄相反，MgCl₂(E1-4)的存在看来对Z-平均直径具有负面影响，与测试的pH无关。关于PDI的变化，Na₂SO₄制剂(制剂B1-4)表现出最少变化，然后是MgSO₄制剂(制剂D1-4)和包含NaCl的制剂(制剂F1-4)。与上文对Z-平均直径变化给出的相同的解释也可以应用于PDI结果，表明硫酸盐的存在至关重要，并且基于所示数据，Na₂SO₄是最优选的。

实施例4

实验设计和方法

在这个研究中，在不同pH的磷酸盐缓冲液中测试与实施例3中相同的盐的效应。这些额外制剂的综述在表3中示出。

使每种制剂处于加速应力条件(在37℃下1天)。在施加加速应力之前和之后测量样品。在BioTek Neo酶标仪上进行浊度测量。在Zetasizer上测量动态光散射(DLS)(表示Z-平均直径变化和PDI变化)。

表3:测试制剂的组成

	组成
		制剂A1	10mM磷酸盐pH 7
制剂A2	10mM磷酸盐pH 7.5
		制剂A3	10mM磷酸盐pH 8
制剂A4	10mM磷酸盐pH 8.5
		制剂B1	10mM磷酸盐pH 7+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
制剂B2	10mM磷酸盐pH 7.5+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
		制剂B3	10mM磷酸盐pH 8+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
制剂B4	10mM磷酸盐pH 8.5+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
		制剂C1	10mM磷酸盐pH 7+100mM MgCl<sub>2</sub>
制剂C2	10mM磷酸盐pH 7.5+100mM MgCl<sub>2</sub>
		制剂C3	10mM磷酸盐pH 8+100mM MgCl<sub>2</sub>
制剂C4	10mM磷酸盐pH 8.5+100mM MgCl<sub>2</sub>
		制剂D1	10mM磷酸盐pH 7+140mM NaCl
制剂D2	10mM磷酸盐pH 7.5+140mM NaCl
		制剂D3	10mM磷酸盐pH 8+140mM NaCl
制剂D4	10mM磷酸盐pH 8.5+140mM NaCl

结果和结论

这个实施例中获得的所有结果的综述在图4中示出。每个图代表在不同pH下每种制剂获得的结果。图的每个柱示出一次单独测定获得的测量结果。

总的来说，可以从浊度结果得出结论，包含Na₂SO₄的制剂看来在所有4种试剂(B1-4)中变化最小。MgCl₂制剂(C1-4)比Na₂SO₄制剂表现出更小的浊度，然后是包含NaCl的制剂(D1-4)。通过DLS获得的结果再次显示Na₂SO₄对MVA-BN-FILO稳定性的显著有益效果，对所有测试的pH值均观察到这样，所述DLS提供胶体特性的额外信息。在MgCl₂制剂(C1-4)中观察到应力之后Z-平均直径的特别大的不期望的增加，表明含氯盐制剂中Mg²⁺离子对MVA-BN-FILO的胶体稳定性的负面影响。因此，可以得出结论，包含Na₂SO₄的制剂的稳定效应比其他测试制剂更稳健。

实施例5

实验设计和方法

在这个实验中，制备来自较早研究的有前途的制剂以及新制剂和不含硫酸盐的对照制剂。这些制剂的综述在表4中示出。

使每种制剂处于加速应力条件(即在25℃下2周；2W25C)。将制剂5、6和8额外暴露于另一加速应力条件，即在37℃下1天(1D37C)。在施加加速应力之前和之后测量样品的效力。通过荧光激活细胞分选仪(FACS)试验进行效力测量，如下文所述并表示为相对效力差异(见表5)。

表4:测试制剂的组成

	组成
		对照制剂	10mM Tris pH 7.7+140mM NaCl
制剂1	10mM Tris pH 8+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
		制剂2	10mM Tris pH 8+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+6％蔗糖
制剂3	10mM Tris pH 8+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+5％甘油
		制剂4	10mM Tris pH 7.7+50mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+70mM NaCl
制剂5	10mM磷酸盐pH 7+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
		制剂6	10mM磷酸盐pH 7+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+6％蔗糖
制剂7	10mM磷酸盐pH 7.5+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
		制剂8	10mM磷酸盐pH 7+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+5％甘油
制剂9	10mM磷酸盐pH 7+50mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+70mM NaCl
		制剂10	10mM磷酸盐pH 7+50mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+70mM NaCl+5％甘油
制剂11	10mM磷酸盐pH 7+50mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+5％甘油

结果和结论

表5中示出每种测试制剂由于加速应力条件的效力损失的综述。

表5：效力分析结果综述

总的来说，结果表明加速应力之后，测试组合物中硫酸盐的存在对效力损失有正面影响。此外，硫酸盐和相对较高pH(>7.5)的组合进一步提高稳定性(见制剂1、2、3、4和7)。此外，制剂中甘油的存在看来也减少效力损失。这通过对制剂3和8观察到的效力损失证实(特别是对制剂8在1D37C之后)。

实施例6

实验设计和方法

在这个实验中，制备来自较早研究的有前途的包含硫酸盐的制剂(实施例5，表5：制剂1、3和7)以及没有硫酸盐的对照制剂。已利用超滤/渗滤对MVA-BN-FILO药物物质进行缓冲液置换。将浓度在期望药物产品左右的制剂装入玻璃小瓶、密封并盖上。制剂的综述在表6中示出。使每种制剂处于以下应力条件：i)在5℃下3个月，ii)在-20℃下3个月，iii)20个冻融循环，iv)以200rpm搅拌1天。在所示应力条件之一之前和之后通过各种光谱方法(例如各向异性、内源荧光、90度光散射、磷光、动态光散射和浊度)测量样品。此外，测量样品的效力。

在BioTek Neo酶标仪上测量浊度。在Zetasizer上测量动态光散射(DLS)(表示Z-平均直径变化和PDI变化)。在Fluoromax 4荧光分光光度计(JobinYvon Horiba,UK)上于石英比色杯中测量各向异性、内源荧光、90度光散射和磷光。通过荧光激活细胞分选仪(FACS)试验进行效力测量并表示为感染单位/mL(表7)，以及相对效力差异(表8)。

表6：测试制剂的组成

制剂	组成
		对照A	10mM Tris pH 7.7+140mM NaCl
对照B	10mM Tris pH 7.7+70mM NaCl+5％甘油
		1	10mM Tris pH 8.0+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
3	10mM Tris pH 8.0+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>+5％甘油
		7	10mM Na/K磷酸盐pH 7.5+100mM Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>

结果和结论

施加应力条件之前和之后制剂的效力在表7和8中示出。图5、6、7和8包含制备之后和分别处于5℃下3个月、-20℃下3个月、20个冻融循环和200rpm搅拌1天的应力条件之后MVA制剂的各向异性、荧光发射和90度光散射谱。图9包含测试样品的浊度、Z-平均直径和PDI。制剂3在-20℃下3个月之后、在20个冻融循环之后和在1天搅拌之后显示没有效力损失(表7和8)。测量到的变化在试验误差内。制剂7在1天搅拌之后显示没有效力损失，然而在-20℃下3个月或20个冻融循环之后大幅减少(表7和8)。

MVA制剂是感染性MVA颗粒(活性物质)以及各种宿主细胞蛋白和其他过程衍生的杂质的内在组合；一起形成包含小和大颗粒的白色悬浮液，通过平均直径和PDI测量所述颗粒的大小。浊度和90度光散射提供关于这些悬浮液的颗粒性质的额外信息。一般来说，可以得出结论，制剂中的硫酸盐导致浊度减少，对于制剂1这是最明显的(图9)。在该实例中，在所示应力条件下，通过测量得到与对照A相比甚至更低的浊度、光散射、Z-平均和PDI值(图5-9)，硫酸盐的破坏效应(减少制剂1中较大颗粒)与对照A相比进一步增强。

制剂3，具有硫酸钠和甘油的Tris中的MVA在以下应力条件之后的各向异性谱、荧光发射谱、90度光散射、浊度、Z-平均直径和PDI表现出没有变化或最小变化：i)在-20℃下3个月，ii)20个冻融循环和iii)以200rpm搅拌1天(图6-9)。这与效力损失没有变化的观察一致(在试验误差内)。硫酸盐与Tris和甘油组合正面影响MVA制剂，并且关于悬浮液的颗粒性质和胶体特性建立了适当平衡，例如当与T0相比时，制剂保持其浊度以及所示的一定的异质性(PDI为0.3左右)(图9)。

制剂7，具有硫酸钠的磷酸盐缓冲液中的MVA，具有高PdI和高Z-平均值(图9)，这表示存在许多小和大颗粒。制剂7以与制剂3相似的方式针对搅拌诱导的应力稳定MVA。搅拌不诱导制剂7的荧光发射、90度光散射或浊度的变化，虽然测量到各向异性值略有下降。这表明平均而言，Trp环境变得较少刚性(例如解离或展开)，不影响MVA胶体悬浮液的总颗粒性质。搅拌不诱导制剂7的效力变化；观察到的变化可能是由非MVA相关蛋白的解离或降解引起的。此外，搅拌1天之后制剂7的PdI和Z-平均值与5℃下3个月或-20℃下3个月之后的值相比较低，表明颗粒及其大小分布与由纯化的MVA颗粒预期的更一致，纯化的MVA颗粒没有大量聚集物或团。制剂7与制剂1相比表明：与Tris与硫酸盐组合相比，磷酸盐与硫酸盐组合的存在对搅拌诱导的应力更具保护性(表7和8)。

在这个实施例中，对照制剂B(Tris、甘油和NaCl)的效力损失与对照制剂A(Tris和NaCl)相比相似，或结果更差，表明甘油的存在不改善不含硫酸盐的对照制剂的物理和生物特性。但是，当用硫酸钠代替对照制剂B的氯化钠时(制剂3)，MVA制剂的稳定导致效力变化最小至无变化；表7和8中示出的-20℃、20x冻融和搅拌条件的值在试验误差内。

总之，通过向制剂添加硫酸盐稳定了MVA的效力和物理稳定性。硫酸盐与甘油的组合稳定冷冻状态和冻融时的MVA颗粒。提高的MVA稳定性可以有利于供应链，包括长期储存、实地储备和使用。

表7：在T0和应力条件之后的制剂效力

表8：与T0的效力(＝100％)相比测试制剂在应力之后的相对效力损失(％)

用于测定稳定性的方法

内源荧光试验

MVA蛋白包含激发之后再发光的芳香氨基酸(荧光团)，特别是色氨酸以及在较少程度上酪氨酸和苯丙氨酸。色氨酸的最大发射和量子产率强烈依赖于其环境的极性。在极性、水性环境中(例如球状蛋白的表面，或者处于解离和游离状态)，量子产率相对较低，而在极性环境中(例如聚集体内，或者在亲脂性病毒包膜内)，量子产率增加。这种特征使得色氨酸荧光成为研究蛋白构象变化、聚集、降解、解离和分子相互作用的可用工具。

本领域已知荧光强度是蛋白稳定性的灵敏度量。在应力时可以观察到增加或减少，取决于样品中发生的变化的性质。蛋白展开和衣壳解离预期导致内源荧光减少，而聚集预期导致增加。最大发射位置的变化提供荧光团环境的额外信息。一般来说，在荧光团暴露于更加水性环境的情况下发生红移(最大强度向较长波长位移)。当荧光团与水更为隔离时，通常发生蓝移(最大强度向较低波长位移)。

获得的应力样品的荧光通常应当与对照样品进行比较。与t＝0样品相比的变化(较高或较低)是较不稳定制剂的指示。保持接近t＝0样品值的应力样品更稳定。

应用两种不同荧光技术，基于比色杯的荧光分光光度计和基于微孔板的酶标仪。在使用的范围中两种技术的精度为<5％(CV％)。

用Fluoromax-4荧光分光光度计(Jobin Yvon Horiba,UK)进行基于比色杯的稳态荧光测量。利用恒温比色杯架在25℃下进行测量。使用Hellma石英比色杯。对于稳态发射测量，将样品在290nm下激发，并且用2nm(激发)和4nm(发射)的带通和0.1的积分时间监测300nm-450nm的发射。

用Biotek Neo 2酶标仪测量基于微孔板的内源荧光测定。将样品一式三份转移至UV-透明的平底微孔板。在280nm下激发之后测量色氨酸荧光，并且带宽10nm，发射在310nm-450nm。

各向异性

稳态荧光各向异性测量荧光团转偏振光的能力。激发波长在一个方向上偏振，随后在通过荧光团发射时转向。滤镜用来测量与激发波长相同平面上的发射波长，这表示仅检测与激发波长相同平面上的光。偏振光转向越多，检测仪上的信号越低。使光转向的能力取决于单个荧光团的平均柔性；荧光团柔性越大，光转向越多，并且检测仪上的信号越低。这使得各向异性成为研究蛋白构象变化、聚集、降解、解离和分子相互作用的可用工具。

本领域已知各向异性是蛋白稳定性的灵敏度量。在应力时可以观察到增加或减少，取决于样品中发生的变化性质。蛋白展开和衣壳解离预期导致各向异性减少，而聚集预期导致增加。获得的应力样品的各向异性通常应当与对照样品进行比较。因为施加应力之后增加或减少取决于降解途径，并且是每种活性药物成分(API)特异性的，所以其不可以预测。与t＝0样品相比的变化(较高或较低)是较不稳定制剂的指示。保持接近t＝0样品的值的应力样品更稳定。

用Fluoromax-4-荧光分光光度计(Jobin Yvon Horiba,UK)进行稳态荧光各向异性测量。利用恒温比色杯架在25℃下进行测量。使用Hellma石英比色杯。利用具有Glan-Thompson棱镜偏振器的T-形式配置进行稳态各向异性测量。在290nm下激发所致的发射峰范围(333–375nm)中测量各向异性。荧光各向异性A计算自等式：

其中G是校正系数，G＝I_90,0/I_90,90。Im,n是在给定波长的荧光强度，并且下标是指偏振器在激发(m)和发射(n)光束中相对于垂直轴的位置。用1.0s积分时间/光谱步进记录光谱。

90度光散射

用Fluoromax-4荧光分光光度计(Jobin Yvon Horiba,UK)进行基于比色杯的90度光散射测量。利用恒温比色杯架在25℃下进行测量。使用Hellma石英比色杯。通过利用优化的带通组合和0.01s的积分时间监测在激发波长的发射，在500-750nm的波长测量90度角的光散射。光散射谱提供溶液中颗粒的浓度、折射率和大小的信息。已显示这种技术对聚集状态的生物制剂的小变化灵敏。例如，光散射减少可以解释为颗粒浓度的减少，或者相同数量颗粒的大小减少，或其组合。光散射的增加常与聚集有关，这是由于颗粒数量的增加，或相同数量颗粒的大小增加，或其组合。

动态光散射

动态光散射(DLS)是用来测量悬浮液或溶液中颗粒的大小分布的技术。偏振激光进入样品并被样品中存在的颗粒散射。随后通过光电倍增管收集散射光。这里分析了强度随时间的波动。因为较小颗粒比较大颗粒更快穿过溶液，由于它们较强的布朗运动，较小颗粒的强度波动更大。因为MVA是颗粒并散射偏振激光，所以DLS可以用来测定MVA颗粒大小的增加(例如聚集)和/或减少(解离)，这使得DLS成为检测聚集或解离的可用工具。

在DLS中，将样品一式三份转移至UV-透明的平底微孔板。利用装有10mV He-Ne激光(830nm)并以90°角操作的DLS设备Zetasizer APS(Malvern,UK)测量粒径和分布。

将获得的应力样品的大小分布与对照样品进行比较。与t＝0样品相比的变化(较高或较低)是较不稳定制剂的指示。保持接近t＝0样品值的应力样品更稳定。

在350nm的浊度测量

比浊法测量由于样品中的颗粒散射的透射光强度损失(表观吸光度)，在样品中的分子不吸收光的波长检测(例如对于其中蛋白是主要发色团的样品，350nm)。当来自单独颗粒时，光散射随机，当分子聚集或形成超分子复合物时，光散射变得连贯，从而测量的强度增加。这使得光散射和比浊法成为检测聚集以及复合物形成或解离的可用工具。

在浊度测定中，将样品一式三份转移至UV-透明的平底微孔板。通过酶标仪记录230-500nm的吸收光谱，并且测量在975nm的吸光度以确定光路长度，并可能修正其差异。如果需要，测定中包括由没有MVA的制剂组成的对照样品以校正散射或吸收基质组分。在350nm的表观吸光度用作浊度的定量度量。

浊度测定表明MVA样品的稳定性。MVA聚集导致浊度增加，而衣壳解离导致减少。在浊度值>1NTU，测定精度是<5％(CV％)。

获得的应力样品的浊度通常应当与对照样品进行比较。与t＝0样品相比的变化(较高或较低)表明制剂较不稳定。应力后与t＝0样品相若的样品预期更稳定。

磷光

磷光是指从激发三线态发射，而荧光是指从激发单线态发射。磷光基本上是与荧光相似方式的辐射发射(ns级别)，但是时间更长(ms至ms)，从而在激发停止之后发射继续。根据Jablonski图表，荧光团吸收光并从基态到单线态，然后系统间交叉至三线态。与荧光相比，从三线态发射(磷光)能量较低，因此波长更长。磷光信号可以是活性药物成分(API)的特殊特性，并且在减少的情况下提供构象变化、降解或解离的指示。当形成较大和刚性结构时，例如在蛋白聚集的情况下，可以发生磷光发射增加。

用Fluoromax-4-荧光分光光度计(Jobin Yvon Horiba,UK)进行磷光测量。利用恒温比色杯架在25℃下进行测量。使用Hellma石英比色杯。将样品在343nm下激发，并且用2nm(激发)和4nm(发射)的带通和0.5s的积分时间监测360nm-550nm的磷光。

测定感染性(效力)的方法

荧光激活细胞分选仪(FACS)试验

通过荧光激活细胞分选仪(FACS)试验测定重组或非重组MVA的滴度(InfU/mL)。将MVA感染的幼仓鼠肾细胞21(BHK-21)细胞用痘苗病毒(VACV)特异性的荧光色素缀合的抗体免疫染色，随后利用装有BD FlowSensor的用于定量细胞计数的FACSVerse^TM(BDBioscience)仪器获得并定量。

更详细地，将GMEM/9％FBS/1.8％Ala-Gln中的2.5x10⁵个BHK 21细胞(来源ATCC)接种至12孔板。第二天用待测的MVA病毒原液的系列稀释液感染细胞。在37度下温育1h之后，添加利福平(在GMEM/9％FBS/1.8％Ala-Gln中100μg/mL)。在感染之后19±2h收获细胞，固定并用BD Perm/Wash^TM试剂盒透化，然后抗体染色。将固定的细胞用抗痘苗FITC(Fitzgerald Industries International,Cat#60-v68)温育60–90分钟。然后，利用BDFACSVerse^TM流式细胞仪通过流式细胞术测定病毒阳性细胞的百分比。在平行固定的未染色的细胞上利用BD FACSVerse^TM Flow Sensor确定总细胞计数。测定的InfU/mL的计算是基于病毒阳性细胞的百分比、感染期间使用的病毒稀释、感染体积和平均细胞数/孔。为了限制细胞计数孔间可变性的影响，通过平均多个孔的细胞计数建立细胞数量。对于病毒样品的InfU/mL的计算，仅包括含有2-35％VACV阳性细胞的稀释液。根据下式进行InfU/mL每样品稀释液的计算：

组织培养感染剂量50(TCID₅₀)MVA感染性测定

TCID₅₀是一种滴定MVA感染性的方法，如WO 03/053463的实施例2所述利用96-孔形式的10倍稀释液。在基于TCID₅₀的测定中利用96-孔形式的10倍稀释液进行MVA的稀释。在测定结束时，利用抗痘苗病毒抗体和适当的染色溶液使感染细胞可见。将2-3日龄原代CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞在7％RPMI中稀释至1x10⁵个细胞/mL。用8个重复/稀释进行10倍稀释。稀释之后，将100μL接种96-孔板的每个孔。然后将细胞在37℃和5％CO₂下温育过夜。

利用没有胎牛血清的RPMI以10倍步骤制备包含病毒的溶液的稀释液。然后，将100μL的每个病毒样品添加至包含细胞的孔。将96-孔板在37摄氏度与5％CO₂下温育5天以允许感染和病毒复制。感染之后5天将细胞用痘苗病毒特异性抗体染色。对于特异性抗体的检测，使用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗。MVA特异性抗体是抗痘苗病毒抗体，兔多克隆，IgG级分(Quartett,Berlin,Germany#9503-2057)。二抗是抗兔IgG抗体，HRP偶联的山羊多克隆(Promega,Mannheim,Germany,#W4011)。根据已知技术进行颜色反应。将具有在颜色反应中阳性的细胞的每个孔标记为阳性，用于TCID₅₀的计算。利用Spearman-Kaerber计算方法计算滴度。数据还可以表示为病毒滴度的对数，其是任何给定时间点与T＝0时间点的相对差异。

本发明的真正范围和精神通过所附权利要求书示出，上述实施例仅认为是示例性的。