一种羊口疮灭活疫苗的制备方法
阅读说明：本技术 一种羊口疮灭活疫苗的制备方法 (Preparation method of orf inactivated vaccine ) 是由 赵玄多 于 2021-03-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种羊口疮灭活疫苗的制备方法,属于免疫工程技术领域。本发明公开的一种羊口疮灭活疫苗的制备方法,包括细胞制备、病毒转瓶培养及收获、病毒液灭活、疫苗制备。本发明公开的一种羊口疮病毒的灭活疫苗的制备方法,获得的疫苗具有良好的免疫效果,填补了国内羊口疮灭活疫苗的空白。(The invention discloses a preparation method of an orf inactivated vaccine, and belongs to the technical field of immune engineering. The invention discloses a preparation method of an orf inactivated vaccine, which comprises cell preparation, virus spinner flask culture and harvest, virus liquid inactivation and vaccine preparation. The vaccine obtained by the preparation method of the orf virus inactivated vaccine disclosed by the invention has a good immune effect, and fills the gap of the orf inactivated vaccine in China.)
技术领域
本发明涉及免疫工程技术领域，更具体的说是涉及一种羊口疮灭活疫苗的制备方法。
背景技术
目前，在我国养羊业进入快速发展期，同时各种疫病防控工作也被大家所重视。羊口疮，又称为羊传染性脓疱，是由病毒引起的一种接触性传染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征。羊口疮普遍存在于各种羊群(包括奶山羊、绒山羊以及肉羊)中，并对其造成严重的后果，带来巨大的损失，尤其是新生羔羊发病率可达60％，死亡率最高达10％。疫苗作为其有效的最预防手段，保护效果达到80％以上。
因此，提供一种羊口疮灭活疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种羊口疮灭活疫苗的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
(1)细胞制备
从工作细胞库中取出冻存的山羊睾丸细胞GT-26，置37℃水浴中解冻，1000-1500r/min离心5-8min，弃掉上清，用含8-10％新生牛血清的MEM培养基重悬后，接种25cm3细胞瓶，置37℃、含5％CO2培养箱中培养至细胞长成致密单层，用0.25％胰酶消化，按1：3～4传代，扩大培养；将扩大培养的山羊睾丸细胞GT-26接种到细胞转瓶中，置37℃培养至细胞长成致密单层，转速为8-11r/h；
(2)病毒转瓶培养及收获
将转瓶中已长成良好单层的山羊睾丸细胞GT-26，弃去培养基，按1％(V/V)的比例加入羊口疮病毒ORFV-WF-3，并按照转瓶10％的容积加入MEM培养基，置37℃温室培养，转速为8-11r/h，每天观察细胞病变，培养48～72h收获病毒液，置-20℃以下保存；
(3)病毒液灭活
BPL(β-丙内酯)灭活病毒(保存于-20℃)
加待灭活病毒液总体积0.1％-0.25％的BPL于待灭活病毒液中，轻轻混匀后，置于4℃恒温震荡作用12-24h(或者期间轻轻混匀6-8次)，灭活完全后，将灭活好的病毒液置于37℃水浴震荡2-3h，使佐剂失活，获得灭活病毒液；
(4)疫苗制备
A、配苗
取滴度为10-7～10-7.5TCID50的灭活病毒液和佐剂Montanide ISA206，分别加热至30±2℃；将Montanide ISA206倒入双层夹套容器并将温度保持在28-32℃；以150-250r/min低速搅拌，并按照1：1的质量比，逐渐将加热后的灭活病毒液加入Montanide ISA206中，流速5～6L/min；
B、乳化
待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至250-500r/min，28-32℃持续搅拌20～30min；将容器冷却至4-15℃，并在冷却过程中持续搅拌；停止搅拌，将乳液在4-15℃静置16-36h，获得羊口疮灭活疫苗。
山羊睾丸细胞GT-26的保藏编号为CCTCC NO：C201734，参见专利201710372048.9，一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系及其建立方法。
羊口疮病毒ORFV-WF-3的保藏编号为CGMCC No.17993，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年06月14日，分类命名为羊口疮病毒。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种羊口疮病毒的灭活疫苗的制备方法，获得的疫苗具有良好的免疫效果，填补了国内羊口疮灭活疫苗的空白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1的疫苗免疫后中和抗体检测结果；
其中，对照为未免疫羊血清；
图2附图为本发明实施例2的疫苗免疫后中和抗体检测结果；
其中，对照为未免疫羊血清。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
(1)细胞制备
从工作细胞库中取出冻存的山羊睾丸细胞GT-26，置37℃水浴中解冻，1000r/min离心8min，弃掉上清，用含8-10％新生牛血清的MEM培养基重悬后，接种25cm3细胞瓶，置37℃、含5％CO2培养箱中培养至细胞长成致密单层，用0.25％胰酶消化，按1：3～4传代，扩大培养。将扩大培养的山羊睾丸细胞GT-26接种到细胞转瓶中，置37℃培养至细胞长成致密单层，转速为11r/h。
(2)病毒转瓶培养及收获
将转瓶中已长成良好单层的山羊睾丸细胞GT-26，弃去培养基，按1％(V/V)的比例加入羊口疮病毒ORFV-WF-3，并按照转瓶10％的容积加入MEM培养基，置37℃温室培养，转速为11r/h，每天观察细胞病变，培养48～72h收获病毒液，置-20℃以下保存。
(3)病毒液灭活
BPL(β-丙内酯)灭活病毒(保存于-20℃)
加待灭活病毒液总体积0.1％-0.25％的BPL于待灭活病毒液中，轻轻混匀后，置于4℃恒温震荡作用12h(或者期间轻轻混匀6-8次)，灭活完全后，将灭活好的病毒液置于37℃水浴震荡3h，使佐剂失活，获得灭活病毒液；
(4)疫苗制备
A、配苗
取滴度为10-7TCID50的灭活病毒液和佐剂Montanide ISA206，分别加热至30±2℃。将Montanide ISA206倒入双层夹套容器并将温度保持在28-32℃。以250r/min低速搅拌，并按照1：1的质量比，逐渐将加热后的灭活病毒液加入Montanide ISA206中，流速5～6L/min。
B、乳化
待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至500r/min，28-32℃持续搅拌20～30min。将容器冷却至4-15℃，并在冷却过程中持续搅拌。停止搅拌，将乳液在4-15℃静置16h，获得羊口疮灭活疫苗。
试验例(在山东青岛进行)
(1)免疫后中和抗体水平检测
免疫对象：产前2月孕羊
免疫途径：皮下注射
免疫剂量：2ml羊口疮灭活疫苗/次
免疫部位：脊柱两侧，避开血管神经，避开被毛丰富处
免疫次数:2次，间隔2周
免疫程序完成后2周，第一次采血分离血清，以后每隔两周采血，进行中和试验，具体步骤如下：
A、将山羊睾丸细胞GT-26铺于96孔板中，每孔10万个细胞；
B、按照2倍梯度稀释采集血清(作为抗体)，并将病毒液梯度稀释至100个TCID50；将2倍梯度稀释的每个浓度的血清100μl分别与100μl 100个TCID50病毒液混合，37℃静置1h；
C、将抗体和病毒液混合物200μl加入到铺好的96孔板中，每个抗体稀释度4个重复；
D、将96孔细胞培养板置37℃、5％CO2温箱中孵育，每日观察细胞病变效应(CPE)。
E、50％血清中和终点的计算：50％细胞不产生细胞病变(CPE)的血清稀释度。根据细胞病变程度，用Reed-Muench法计算50％血清中和终点。结果见图1。
(2)免疫后血液中病毒含量检测
孕羊194只，免疫组114只孕羊，未免疫组80只孕羊。免疫前采血进行PCR检测，阳性分别为114只/72只。产前40-45天用羊口疮灭活疫苗免疫，每次免疫间隔14天，共免疫2次，免疫方式为颈部皮下注射2ml。提取血样DNA，PCR检测免疫前的孕羊、免疫后的孕羊、新生羔羊、新生羔羊脐带血中的带毒情况以及观察新生羔羊1月内的发病情况，结果见表1。
表1
注：未免疫组前后检测孕羊阳性数减少，是因为PCR检测结果受到多种因素影响，尤其是血液中的病毒含量，而病毒含量在动物体内不是一成不变的；也有一些会因为营养加强，环境优化，使羊的免疫力提高，病毒会被清除；导致部分检测结果发生变化是正常的。
其中，发病率＝发病羔羊/新生羔羊总数。
其中，羊口疮病毒(ORFV)PCR检测方法如下：
①采样准备
配制EDTA抗凝剂：称1.5g EDTA粉末，加入100ml纯水中，调pH值至8左右。将抗凝剂分装至2ml EP管中，每管200μl，可抗凝2ml血液。
配制0.9％生理盐水：称9g NaCl，溶解于1000ml纯水中。高压121℃灭菌30min。
②从血样中提取DNA(NaI法)
A、从4℃中取出EDTA抗凝血样，每份取200μl加到2ml EP管中，再加200μl ddH2O，混匀20s。
B、加入400μl 6mol/L NaI，混匀20s。
C、加入800μl氯仿-异戊醇，混匀，12000r离心5min。
D、将水相(约300μl)移到另一1.5ml EP管中，加入0.6体积异丙醇，再加入1/10体积(异丙醇+水相)3mol/L醋酸钠，混匀，静置-20℃，5min。12000r离心5min，弃上清。
E、加1ml 70％乙醇洗涤一次，12000r离心5min，弃上清。
F、晾干残余乙醇，约10-15min后，不等完全干燥时，加入10μl ddH2O。短期4℃保存，长期-20℃保存。
③PCR扩增
所用引物序列如下：
上游引物：5’-CACGGCCACGAACATCCACCTCAA-3’；SEQ ID NO.1；
下游引物：5’-TCGCGCACGAAGACCGCAGTCAG-3’；SEQ ID NO.2。
PCR扩增体系如下：模板2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，Mix 12.5μl，DMSO0.25μl，ddH2O 9.5μl。
PCR反应程序：94℃，5min；94℃35s，60℃30s，72℃，35s，共35个循环；72℃，10min。
④核酸凝胶电泳
2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪中观察结果；扩增获得目的条带的为阳性，反之为阴性。
实施例2
一种羊口疮灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：
(1)细胞制备
从工作细胞库中取出冻存的山羊睾丸细胞GT-26，置37℃水浴中解冻，1500r/min离心5min，弃掉上清，用含8-10％新生牛血清的MEM培养基重悬后，接种25cm3细胞瓶，置37℃、含5％CO2培养箱中培养至细胞长成致密单层，用0.25％胰酶消化，按1：3～4传代，扩大培养。将扩大培养的山羊睾丸细胞GT-26接种到细胞转瓶中，置37℃培养至细胞长成致密单层，转速为8r/h。
(2)病毒转瓶培养及收获
将转瓶中已长成良好单层的山羊睾丸细胞GT-26，弃去培养基，按1％(V/V)的比例加入羊口疮病毒ORFV-WF-3，并按照转瓶10％的容积加入MEM培养基，置37℃温室培养，转速为8r/h，每天观察细胞病变，培养48～72h收获病毒液，置-20℃以下保存。
(3)病毒液灭活
BPL(β-丙内酯)灭活病毒(保存于-20℃)
加待灭活病毒液总体积0.1％-0.25％的BPL于待灭活病毒液中，轻轻混匀后，置于4℃恒温震荡作用24h(或者期间轻轻混匀6-8次)，灭活完全后，将灭活好的病毒液置于37℃水浴震荡2h，使佐剂失活，获得灭活病毒液；
(4)疫苗制备
A、配苗
取滴度为10-7.5TCID50的灭活病毒液和佐剂Montanide ISA206，分别加热至30±2℃。将Montanide ISA206倒入双层夹套容器并将温度保持在28-32℃。以150r/min低速搅拌，并按照1：1的质量比，逐渐将加热后的灭活病毒液加入Montanide ISA206中，流速5～6L/min。
B、乳化
待灭活病毒液全部加入后，提高搅拌速度至250r/min，28-32℃持续搅拌20～30min。将容器冷却至4-15℃，并在冷却过程中持续搅拌。停止搅拌，将乳液在4-15℃静置36h，获得羊口疮灭活疫苗。
试验例(在陕西咸阳进行)
(1)免疫后中和抗体水平检测
免疫对象：产前2月孕羊
免疫途径：皮下注射
免疫剂量：2ml羊口疮灭活疫苗/次
免疫部位：脊柱两侧，避开血管神经，避开被毛丰富处
免疫次数:2次，间隔2周
免疫程序完成后2周，第一次采血分离血清，以后每隔两周采血，进行中和试验，具体步骤如下：
A、将山羊睾丸细胞GT-26铺于96孔板中，每孔10万个细胞；
B、按照2倍梯度稀释采集血清(作为抗体)，并将病毒液梯度稀释至100个TCID50；将2倍梯度稀释的每个浓度的血清100μl分别与100μl 100个TCID50病毒液混合，37℃静置1h；
C、将抗体和病毒液混合物200μl加入到铺好的96孔板中，每个抗体稀释度4个重复；
D、将96孔细胞培养板置37℃、5％CO2温箱中孵育，每日观察细胞病变效应(CPE)。
E、50％血清中和终点的计算：50％细胞不产生细胞病变(CPE)的血清稀释度。根据细胞病变程度，用Reed-Muench法计算50％血清中和终点。结果见图2。
(2)免疫后血液中病毒含量检测
孕羊332只，免疫组215只孕羊，未免疫组117只孕羊。免疫前采血进行PCR检测，阳性分别为114只/72只。产前40-45天用羊口疮灭活疫苗免疫，每次免疫间隔14天，共免疫2次，免疫方式为颈部皮下注射2ml。提取血样DNA，PCR检测(检测方法同实施例1)免疫前的孕羊、免疫后的孕羊、新生羔羊、新生羔羊脐带血中的带毒情况以及观察新生羔羊1月内的发病情况，结果见表2。
表2
其中，发病率＝发病羔羊/新生羔羊总数。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 杨凌博德越生物科技有限公司
<120> 一种羊口疮灭活疫苗的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cacggccacg aacatccacc tcaa 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tcgcgcacga agaccgcagt cag 23