一种日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物及筛选方法和应用
阅读说明：本技术 一种日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物及筛选方法和应用 (Schistosomiasis japonica early diagnosis urine biomarker and screening method and application thereof ) 是由 吕志跃 胡玥 黄萍 周洪利 马玉斌 于 2019-04-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于日本血吸虫病早期诊断的尿液生物标志物,所述尿液生物标志物为黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种。所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9,曲线下面积(AUC)均大于0.9,表明这三个指标预测性较好,可用于日本血吸虫病早期诊断。本发明还公开了基于代谢组学的日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法,通过构建小鼠日本血吸虫病模型,利用超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠尿液进行代谢组学分析,发现并分析正常小鼠和日本血吸虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物,即为日本血吸虫病早期诊断生物标志物。所述筛选方法具有无创、方便快捷的特点,并且能够准确反映日本血吸虫病感染小鼠与正常小鼠的代谢谱差异,特异性高。(The invention discloses a urine biomarker for early diagnosis of schistosomiasis japonica, which is one or more of xanthurenic acid, naphthalenesulfonic acid or heptanoyl carnitine. The sensitivity and specificity of the marker are both greater than 0.9, and the area under the curve (AUC) is both greater than 0.9, which shows that the three indexes are good in predictability and can be used for early diagnosis of schistosomiasis japonica. The invention also discloses a screening method of the schistosomiasis japonica early diagnosis urine biomarker based on metabonomics, which comprises the steps of constructing a mouse schistosomiasis japonica model, carrying out metabonomic analysis on mouse urine by using an ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry technology, and finding and analyzing characteristic difference metabolites between a normal mouse and a schistosomiasis japonica infected mouse, namely the schistosomiasis japonica early diagnosis biomarker. The screening method has the characteristics of no wound, convenience and quickness, can accurately reflect the metabolic spectrum difference between the schistosomiasis japonica infected mouse and the normal mouse, and has high specificity.)
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，更具体地，涉及一种日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物及筛选方法和应用。
背景技术
日本血吸虫病是由日本血吸虫(Schistosoma japonicum)引起的一种严重危害人体健康和阻碍社会经济发展的人畜共患寄生虫病，在亚洲地区广泛流行，特别是在中国、菲律宾和印度尼西亚，有超过100万人感染此病，受威胁人口约4600万人。在我国，日本血吸虫主要在长江中下游及其南部的12个省、市、自治区流行。经过60余年的努力，我国血吸虫病防治工作已取得了显著成效，现在流行地区主要分布在安徽、湖北、湖南和江西4省，但要实现全国消除血吸虫病目标，其任务依然艰巨。
日本血吸虫的生活史包括在人及多种哺乳动物等终宿主体内的有性生殖和在钉螺这一唯一中间宿主体内的无性生殖，发育阶段分为七个：卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫。在日本血吸虫感染阶段，尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主造成损害，损害的主要原因是其寄生时释放的抗原诱发宿主的免疫应答，从而导致一系列复杂的免疫病理反应出现，该病致死的主要原因是虫卵诱导的肝脏肉芽肿及随后产生的肝纤维化。
目前日本血吸虫病的诊断主要包括直接检测法和间接检测法。前者主要是病原学检查，即在显微镜下检查粪便中的虫卵；后者则包括免疫学检测和分子生物学检测，如检测血清中的抗原或抗体，检测粪便中日本血吸虫的DNA等。此外，超声波检查(US)，计算机断层扫描(CT)和核磁共振成像(MRI)等影像学方法也可用于日本血吸虫病的诊断。然而，上述诊断方法或特异度较低，或灵敏度较低，且不适于早期诊断；因此，需要找寻可用于早期诊断日本血吸虫病的方法。
代谢组学(metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学后发展起来的一门关于生物体系受刺激或扰动后其小分子代谢产物(分子量<1200Da)种类、数量及其变化规律的系统生物学学科，通过对机体的整个代谢谱进行分析，探寻代谢物与生理病理变化之间的对应关系，从而为疾病诊断提供依据，找寻与疾病相关的生物标志物(Biomarker)。代谢组学的分析手段主要包括核磁共振(NMR)、气相色谱-质谱(GS/MS)联用技术、液相色谱-质谱(LC/MS)联用技术等，其中超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术作为一种先进的分离分析技术，已被广泛应用于代谢组学领域的研究当中，其强大的分析能力被公认为是复杂样品最好的分析技术之一。目前，可用于日本血吸虫病早期诊断的标志物还不够丰富，尽可能找寻新的诊断标记物，将有助于日本血吸虫病早期诊断的发展。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种可用于日本血吸虫病早期诊断的尿液生物标志物。
本发明的另一目的在于提供一种基于代谢组学的日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法。
本发明的另一目的在于提供上述日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于日本血吸虫病早期诊断的尿液生物标志物，所述尿液生物标志物为黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种。
本发明基于代谢组学，研究分析正常小鼠和日本血吸虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物，最终获得所述的基于代谢组学的日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物-黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种，所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(AUC)均大于0.9，提示这三个指标预测性较好，可用于日本血吸虫病早期诊断。
黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种作为日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物的应用。
本发明还请求保护所述尿液生物标志物在制备日本血吸虫病早期诊断产品中的应用；所述尿液生物标志物在制备和筛选日本血吸虫病药物中的应用。
一种日本血吸虫病早期诊断产品，所述产品通过检测受试者尿液中黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种标志物的浓度变化来判断受试者是否患有日本血吸虫病。
一种日本血吸虫病早期诊断产品，包含检测受试者尿液中黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种标志物的含量浓度的试剂。
本发明还请求保护一种基于代谢组学的日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法，构建小鼠日本血吸虫病模型，利用超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠尿液进行代谢组学分析，发现并分析正常小鼠和日本血吸虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物，即为日本血吸虫病早期诊断生物标志物。
作为一种优选地实施方式，所述基于代谢组学的日本血吸虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法具体包括如下步骤：
(1)将健康小鼠分成七个实验组：正常对照组、日本血吸虫感染3天组、日本血吸虫感染7天组、日本血吸虫感染14天组、日本血吸虫感染21天组、日本血吸虫感染28天组及日本血吸虫感染42天组；正常对照组不做处理，感染组小鼠通过腹部皮肤贴附沾有尾蚴的盖玻片感染日本血吸虫；
(2)使用代谢笼分别收集七个实验组小鼠的尿液样本，加入超纯水1：10稀释，4℃下10000g离心10min，取上清液即得供试品溶液；
(3)使用超高效液相色谱-串联质谱法检测供试品溶液，获得七个实验组小鼠尿液样本的指纹图谱；
(4)通过数据前处理、多元统计分析并筛选差异代谢物，将这些差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比对，最终获得所述的基于代谢组学的日本血吸虫病早期诊断尿液标志物。
优选地，所述超高效液相色谱-串联质谱中液相色谱条件为：色谱柱：WatersACQUITY UPLC C18BEH色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；液相色谱条件：流动相：A-H2O(0.1％甲酸)，B-乙腈(0.1％甲酸)；流速：0.4mL/min，柱温：38℃，进样量：0.300μL；梯度洗脱程序：0～1.2min为3％B，1.2～10min为3％～45％B逐渐递增，10～14min为45％～98％B逐渐递增，14～16min为98％B，16.1～19min为3％B。
质谱条件：氮气作为脱溶剂和锥孔气；毛细管电压2.5kV，ESI电喷雾离子源，检测模式为MS和MSE，锥孔电压35kV，反向锥孔气流为30L/h，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为700L/h；在碰撞能量为20～50eV情况下离子扫描时间为0.3s，数据采集范围为50～1200m/z；准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液，ESI-554.2615m/z。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种用于日本血吸虫病早期诊断的尿液生物标志物，所述尿液生物标志物为黄尿酸、萘磺酸或庚酰肉碱中的一种或多种，所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(AUC)均大于0.9，表明这三个指标预测性较好，可用于日本血吸虫病早期诊断。
(2)本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠尿液进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型构建及判别分析，从而发现正常小鼠和日本血吸虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物，并进一步分析特征性差异代谢物的含量变化，找到由日本血吸虫病引起的特异性差异代谢产物，即日本血吸虫病的早期诊断分子标志物。本发明所提供的方法具有无创、方便快捷的特点，并且能够准确反映日本血吸虫病感染小鼠与正常小鼠的代谢谱差异，特异性高。
附图说明
图1为正离子模式下七个实验组基峰强度(BPI)色谱图。
图2为负离子模式下七个实验组基峰强度(BPI)色谱图。
图3为七个实验组正负离子模式下PCA及PLS-DA的得分图；(A)正离子模式下PCA得分图；(B)负离子模式下PCA得分图；(C)正离子模式下PLS-DA得分图；(D)负离子模式下PLS-DA得分图。
图4为正离子模式下七个实验组的OPLS-DA得分图及S-plot。
图5为负离子模式下七个实验组的OPLS-DA得分图及S-plot。
图6为三种尿液生物标志物在七个实验组的丰度(A)及对应的ROC曲线(B)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、日本血吸虫感染小鼠模型建立
健康SPF级8周龄BALB/c小鼠分为七组：正常对照组、日本血吸虫感染3天组、日本血吸虫感染7天组、日本血吸虫感染14天组、日本血吸虫感染21天组、日本血吸虫感染28天组及日本血吸虫感染42天组，每组10只小鼠。正常对照组不做处理；感染组小鼠按常规方法进行感染：取阳性钉螺置于去氯水中，25℃～28℃光照条件下逸放尾蚴1～2h，用接种环蘸取水面30条尾蚴收集至盖玻片上。小鼠麻醉后腹部朝上固定于鼠板，腹部剃毛后使用去氯水湿润，将沾有尾蚴的盖玻片贴附于小鼠腹部皮肤20min进行感染。
2、样本收集及前处理
使用代谢笼收集各实验组小鼠剖杀前一天尿液至少0.5mL，-80℃分装冻存。采用超高效液相色谱-串联质谱法分析尿液样本前，将50μL尿液样本于4℃解冻，加入450μL超纯水进行稀释，涡旋混匀后于4℃下10000g离心10min，取上清液200μL加入内衬管，用于代谢组学分析。
3、基于上述70个样本进行代谢组学分析，具体分析条件如下：
(1)仪器设备
液相色谱：Waters ACQUITY UPLC-I Class System
质谱：Waters SYNAPT G2-Si HDMS
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC C18BEH column(2.1×100mm，1.7μm)
(2)液相色谱条件
流动相：A-H2O(0.1％甲酸)，B-乙腈(0.1％甲酸)
流速：0.4mL/min，柱温：38℃，进样量：0.300μL
梯度洗脱程序：0～1.2min为3％B，1.2～10min为3％～45％B逐渐递增，10～14min为45％～98％B逐渐递增，14～16min为98％B，16.1～19min为3％B。
(3)质谱条件
氮气作为脱溶剂和锥孔气。毛细管电压2.5kV，ESI电喷雾离子源，检测模式为MS和MSE，锥孔电压35kV，反向锥孔气流为30L/h，离子源温度为110℃，脱溶剂气温度为350℃，脱溶剂气流量为700L/h。在碰撞能量为20～50eV情况下离子扫描时间为0.3s，数据采集范围为50～1200m/z。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液，ESI-554.2615m/z，以确保质量的准确性和重复性。
4、数据分析
(1)数据预处理
使用Masslynx软件采集原始数据，将获得的原始数据导入Progenesis QI进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐和归一化等处理，得到各组样品正负离子模式下基峰强度(BPI)色谱图，如图1和图2所示。
(2)多元统计分析
使用SIMCA-P和MetaboAnalyst进行多元统计分析，为了考察各感染组与对照组相比代谢的变化，采用无监督的主成分分析(PCA)和有监督的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)方法来表征差异，R2值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率，见图3。
从正常对照组与各感染组的PCA及PLS-DA得分图可以看出，正常对照组与各感染组有一定的分离趋势，PLS-DA的拟合度和预测能力均良好。
(3)发现并分析鉴定特征性差异代谢物
进一步使用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选差异代谢物，并通过单因素方差分析(one-way ANOVA)对各组间的差异变量进行统计学分析，p<0.05表明差异有统计学意义。当投影中的变量重要性(VIP)>2，p<0.05且最小变异系数(CV)≥30时，被认为是差异代谢物，见图4和图5。
将正常对照组和日本血吸虫感染3天组差异代谢物的精确分子量和保留时间与人类代谢组数据库(HMDB，http://www.hmdb.ca)和METLIN数据库(http://metlin.scripps.edu)进行对比，将已鉴定的物质作为潜在生物标志物(见表1)。
表1正常小鼠和日本血吸虫感染小鼠之间的尿液特征性差异代谢物
最后，使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析评估生物标志物的诊断能力。黄尿酸、萘磺酸和庚酰肉碱的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(AUC)均大于0.9，提示这三个指标预测性较好，见图6。表明黄尿酸、萘磺酸和庚酰肉碱均可用于日本血吸虫病早期诊断。