阅读说明：本技术 肌球蛋白来源活性肽及其应用 (Myosin source active peptide and application thereof ) 是由 于志鹏 亢利鑫 赵文竹 武思佳 阚若彤 夏晨思 励建荣 于 2019-10-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及蛋白活性肽领域,具体涉及多个来源于肌球蛋白的活性肽,其氨基酸序列分别为Asp-Lys(DK)、Glu-Glu-Lys(EEK)、Glu-Asp-Gln-Lys(EDQK)、Ser-Glu-Gly-Gly-Arg(SEGGR)、Gln-Asp-Ser-Ile-Gly-Ser(QDSIGS)。本发明所述的活性肽通过借助分子对接和虚拟筛选技术获得,均可以通过基因工程或化学方法合成,也可通过生物酶解技术结合纯化手段获得。本发明提供的五条活性肽,可作为基料或辅料来制作调味品,广泛应用于食品领域。(The invention relates to the field of protein active peptides, in particular to a plurality of active peptides derived from myosin, wherein the amino acid sequences of the active peptides are Asp-Lys (DK), Glu-Glu-Lys (EEK), Glu-Asp-Gln-Lys (EDQK), Ser-Glu-Gly-Gly-Arg (SEGGR), Gln-Asp-Ser-Ile-Gly-Ser (QDSIGS) respectively. The active peptide is obtained by means of molecular docking and virtual screening technologies, can be synthesized by a genetic engineering or chemical method, and can also be obtained by combining a biological enzymolysis technology with a purification means. The five active peptides provided by the invention can be used as base materials or auxiliary materials to make seasonings and can be widely applied to the field of foods.)

肌球蛋白来源活性肽及其应用

技术领域

本发明属于蛋白活性肽领域，具体涉及肌球蛋白来源的生物活性肽及其应用。

背景技术

目前，生物活性肽的制备及其应用开发已经成为世界范围内研究的热点。鲜味肽因其可增强食物鲜味和醇厚味，且易于吸收，具有良好的加工特性及营养价值，而受到了越来越多的关注。并且，鲜味肽在食品中的应用也符合“天然、营养、安全”的食品发展趋势。鲜味肽不仅可以增强食物的鲜美口感，还可作为挥发性风味物质的前体物质与美拉德反应，进一步增强食品的特征香味；还能使糖更甜，使盐更咸，降低苦味和酸味，协同五种基本口味，使鲜味更具有质感。鲜味是继酸、甜、苦、咸之后的第五种基本味觉，可以给人带来欢愉感，是人体必不可少的味觉需求。在1908年，日本科学家首次在海带中分离出谷氨酸，并提出鲜味的概念，以umami命名。随后肌苷酸，鸟苷酸等核苷酸也被发现具有鲜味。1978年日本学者从牛肉的蛋白酶解液中分离、提取、纯化出一条美味肽-牛肉八肽(BMP)。随后，逐渐从肉类酶解物、水产品、火腿等食品中也提取出一些具有鲜味的多肽，并将其统一命名为鲜味肽。而鲜味肽是继MSG、IMP、GMP之后的一种理想的天然鲜味物质。

鲜味肽的制备方法主要有提取法和蛋白降解法，结合凝胶色谱、高效液相色谱等技术对其进行分离纯化得到更高纯度的鲜味肽。但是目前为止，已知食品中的鲜味肽种类有限，其对鲜味的贡献程度也有不同，同时鲜味肽作为一种新型天然鲜味剂也备受人们关注和研究，因此新型鲜味肽亟待开发。

发明内容

本发明目的在于提供：

一种生物活性肽DK，其包括由Asp-Lys组成的活性肽；

一种生物活性肽EEK，其包括由Glu-Glu-Lys组成的活性肽；

一种生物活性肽EDQK，其包括由Glu-Asp-Gln-Lys组成的活性肽；

一种生物活性肽SEGGR，其包括由Ser-Glu-Gly-Gly-Arg组成的活性肽；

一种生物活性肽QDSIGS，其包括由Gln-Asp-Ser-Ile-Gly-Ser组成的活性肽。

较优的，所述的活性肽均具有鲜味和浓厚感。可作为基料或辅料来制作调味品，广泛应用于食品加工中。选用味精作为阳性对照，将肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS及味精(MSG)配制成0.1mg/ml的溶液。选用AAE、CT0、CA0、C00、AE1 5个测试传感器和2个参比传感器对样品进行检测。结果表明，肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS的鲜味效果均要优于味精(MSG)。其中，肽EDQK的鲜味强度最高。

较优的，所述的活性肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS均来自虾夷扇贝肌球蛋白，并且分别为肌球蛋白(GenBank：BAB40711.1)第595～597位、第342～345位、第1383～1387位、第1513～1518位、第1488～1494位的氨基酸残基。

本发明通过ToxinPred和peptide property calculator对活性肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS进行毒性、水溶性性质的分析，利用鲜味肽的氨基酸组成、氨基酸的空间排列、分子量等进行多轮筛选，结合分子对接实验，活性肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS与鲜味受体T1R1/T1R3结合紧密。

本发明的生物活性肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS均可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从肌球蛋白中通过分离纯化、酶降解的方法获得。利用电子舌检测，结果表明肽段DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS具有鲜味和浓厚感。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的鲜味肽是小分子量肽，易于被人体吸收。

(2)本发明开发的鲜味肽鲜味强度高，可以代替味精的使用，在食品中的应用意义较大。

(3)本发明获得的鲜味肽纯度高。

附图说明

本发明附图8幅，其中：

图1. 62种多肽氨基酸组成图；

图2.鲜味受体T1R1/T1R3模型的Ramachandran Plot(拉曼图谱)；

图3.鲜味受体T1R1/T1R3的胞外结构模型图；

图4.DK质谱图；

图5.EEK质谱图；

图6.EDQK质谱图；

图7.SEGGR质谱图；

图8.QDSIGS质谱图。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步阐述。

实施例1虾夷扇贝肌球蛋白的酶解筛选

选用胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)，胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(EC3.4.21.1)通过ExPASy PeptideCutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)用对肌球蛋白序列(GenBank：BAB40711.1)进行酶切，获得747条肽序列。

利用ToxinPred(http：//crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/)对肽的毒性进行分析。通过peptide property calculator(http：//www.innovagen.com/)对肽的水溶性进行分析，筛选获得322条无毒、水溶性良好的活性肽。鲜味肽的呈味与与氨基酸组成、氨基酸的空间排列及肽的分子量有关，含有谷氨酸和天冬氨酸，以及含有一定的亲水性氨基酸，且肽链骨架长度为2-6时，具有较好的呈味效果，且二肽C端为带负电荷的酸性氨基酸，N端为带正电荷的碱性氨基酸，具有呈味特性。基于此，对322条肽进行筛选获得70条符合条件的肽序列。利用活性肽数据库BIOPEP(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)进行检索和比对，剔除已被报道过的鲜味肽。最终筛选得到62条未被报道的肽序列，结果见图1。

采用modeller 9.18构建鲜味受体T1R1/T1R3异源二聚体蛋白模型。选取metabotropic glutamate receptor(PDB ID：1ewk)作为建模模板。在gromacs2018.1软件包中对构建模型进行分子动力学优化。对优化后的鲜味受体模型进行拉氏图计算，结果如图2所示，数据分析表明该模型中有99.3％的氨基酸残基处于允许区内，根据90％的临界评价原则，表明鲜味受体T1R1/T1R3模型构型合理。鲜味受体T1R1/T1R3胞外结构模型如图3所示。

通过Discovery Studio(DS)2017客户端软件的CDOCKER程序进行分子对接。对接能量结果如表1所示，结果表示二肽DK、三肽EEK、四肽EDQK、五肽SEGGR和六肽QDSIGS具有最低的Docking Energy和Docking Interaction Energy得分，得分越低表示结合越紧密。因此对DK、EEK、EDQK、SEGGR和QDSIGS进行制备。

表1 多肽与鲜味受体T1R1/T1R3的对接能量

实施例2电子舌检测

本实施例选用味精(MSG)作为阳性对照。将肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS及MSG配制成0.1mg/ml的溶液。选用AAE、CT0、CA0、C00、AE1 5个测试传感器和2个参比传感器对样品进行检测。采用插值法来分析样品的味道，数据处理结果见表2。

表2 基于电子舌的不同肽的Umami和Richness值

结果表明，活性肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS的呈鲜效果均要优于味精(MSG)。其中，肽EDQK的鲜味强度最高。最终本发明提供了五条鲜味肽。

实施例3活性肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS的化学合成

本实施例采用FMOC法固相合成肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS。在温度为22℃～28℃和常压下，将Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin加入到多肽固相合成反应器中，加入10mL 25％哌啶/DMF溶液脱除氨基保护基Fmoc，依次同2倍过量的下一个氨基酸的活化羟基反应延长肽链，缩合过程中采用茚三酮定性显色监测反应进程，直至得到合成所需的目标肽段。选择适当的切割条件将目标多肽从树脂裂解下来并除去侧链保护基，溶液经旋蒸后，加入无水***使多肽沉淀析出，经离心、洗涤和真空干燥，即得到目标肽粗品。

采用高效液相色谱对目标肽的纯度进行分析，色谱条件：色谱柱为Gemini-NX C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，进样量20μL；流动相A液为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相B液为0.1％的三氟乙酸水溶液；梯度洗脱方式为2％A+98％B在30min内降为100％A+0％B；流速为1.0mL/min；检测波长为220nm。自动收集洗脱峰。目标肽纯度分别为88％、95％、96％、91％、94％。

采用质谱法对样品进行鉴定。质谱条件为电喷雾电离源(ESI)，曲型脱溶剂装置(CDL)温度为250℃，加热块(Block)温度为200℃，雾化气流速为1.5L/min，探针(Probe)电压为+4.5kv。肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS理论分子量分别为216.27Da、404.42Da、518.51Da、504.49Da、605.59Da。五个样品的质谱分析报告见图4、图5、图6、图7、图8，得到的分子离子峰分别为261.7、405.2、519.3、505.3、606.3，与肽DK、EEK、EDQK、SEGGR、QDSIGS理论分子量一致，确定样品为目标肽。

最后，还需注意的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化、修改、替换和变型，其也应视为本发明的保护范围。