阅读说明：本技术 黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用 (Cucumber CsLsi2 gene and its coded protein and application ) 是由 任华中 刘兴旺 张亚琦 董明明 翟许玲 尹帅 陈淑英 徐硕 冯钟萱 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用。所述黄瓜CsLsi2基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,该基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过全基因组关联分析及筛选后克隆得到了与黄瓜果霜性状密切相关的黄瓜CsLsi2基因,该基因表达水平与黄瓜果霜含量呈正相关,而在黄瓜基因如SEQ ID NO:1所示序列的第754位的碱基由C变为T后会导致氨基酸翻译的提前终止。黄瓜CsLsi2基因的克隆及表达分析对解决黄瓜果霜基因资源难以筛选的问题起到了很大程度的促进作用。(The invention relates to a cucumber CsLsi2 gene and a protein coded by the same and application thereof. The nucleotide sequence of the cucumber CsLsi2 gene is shown as SEQ ID NO.1, and the protein sequence coded by the gene is shown as SEQ ID NO. 2. The cucumber CsLsi2 gene closely related to the cucumber frost character is obtained by cloning after whole genome correlation analysis and screening, the expression level of the gene is positively related to the cucumber frost content, and the early termination of amino acid translation can be caused after the 754 th base of the sequence shown in the cucumber gene SEQ ID NO.1 is changed from C to T. The cloning and expression analysis of the cucumber CsLsi2 gene play a great promoting role in solving the problem that cucumber frost gene resources are difficult to screen.)

黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

黄瓜是重要的膳食维生素C来源。由于具有产量高、效益好等特点，是现有的一种主栽蔬菜作物，而黄瓜品质的好坏直接决定着生产者的效益。外观品质隶属品质范畴，果霜则属于黄瓜重要的外观品质之一，在较大程度上影响黄瓜的销售。一般而言，少果霜、瓜条亮且顺直的品种较受市场欢迎。长久以来，有关黄瓜果霜的组份及形成存在争议，一种观点认为：黄瓜果霜的形成是果皮单细胞垂直皮面***的结果，表皮单细胞***形成的毛状细胞进一步***为柄、粒两部分；随着果实的生长发育，粒部细胞逐渐***由6-8个充满内含物的细胞组成的球体，同时伴随这细胞核的消失，等到商品成熟阶段，球体分泌出的内含物与球体共同分布于黄瓜果实表皮，即所谓的果霜(松本美枝子，1980)。另外一种观点认为：果霜就是硅化物(Samules et al.,1993；沈琼，2013)。尽管存在争议，研究者通过系类生产及生理试验(如嫁接及外源硅的喷施)证实硅影响黄瓜果霜形成的结论逐步被广泛认可，但目前有关果霜形成的基因挖掘及可能的调控机制进展缓慢。

迄今以环境因素以及嫁接对果霜形成的影响研究较为集中，而开展果霜性状的遗传研究尚少，且多局限于目标基因的定位及分子标记开发，不同研究小组结果之间存在较大差异。沈琼等(2012)研究认为黄瓜果霜的有无或多少由1对主效基因控制，有或多果霜表现为部分显性；田桂丽等(2015)则认为黄瓜果霜性状的遗传符合1对加性主基因+加性-显性多基因(D-2)模型。出现这种研究结论不统一的主要原因可能在于：(1)各个研究小组所采用的试验材料遗传背景不同，特别是绝对无果霜黄瓜种质材料几乎没有；(2)对果霜性状的田间调查标准难以把握，导致相互间研究结果的差异较大；(3)环境条件的影响加大了对果霜性状田间调查的难度，导致数据统计的准确性较差。前人研究中的这些问题充分说明了黄瓜果霜性状研究的复杂性，因而单纯采用遗传分离、图位克隆、精细定位等传统手段挖掘果霜形成相关基因存在着诸多困难。

发明内容

为了解决现有技术中存在黄瓜基因克隆困难、品质难以提高的技术问题，本发明提供一种黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用。

第一方面，本发明提供一种黄瓜CsLsi2基因，所述黄瓜CsLsi2基因的核苷酸序列为：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明进一步提供上述黄瓜CsLsi2基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为：

i)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等功能活性的氨基酸序列。

本发明进一步提供扩增出上述黄瓜CsLsi2基因序列的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：

CsLsi2-F：5'-ATGGCCATGGATCATACTGTAA-3'

CsLsi2-R：5'-TCATTTTATAAGAACTAAACCA-3'。

本发明进一步提供含有上述黄瓜CsLsi2基因的表达盒。

本发明进一步提供含有上述黄瓜CsLsi2基因的重组表达载体。

本发明进一步提供含有上述黄瓜CsLsi2基因或重组表达载体的工程菌或转基因细胞。

第二方面，本发明提供一种黄瓜CsLsi2基因的表达抑制剂在制备果霜含量低的植物中的应用，所述黄瓜CsLsi2基因的表达抑制剂为能够通过基因敲除或RNA干扰的方式抑制黄瓜CsLsi2基因表达的试剂。

进一步地，所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物优选为葫芦科作物。

第三方面，本发明提供上述黄瓜CsLsi2基因或该基因编码的蛋白调控黄瓜果霜性状方面的应用。

本发明进一步提供上述黄瓜CsLsi2基因或该基因编码的蛋白在降低黄瓜的果皮果霜含量方面的应用。

进一步地，所述应用具体为使黄瓜基因中如SEQ ID NO:1核苷酸序列第754位由C突变为T。

更进一步，所述黄瓜为黄瓜3548-1、黄瓜3549-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜3555-1或黄瓜5553-1中的一种或多种。

本发明提供了黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用。本发明基于近等基因系材料背景下性状产生的生理基础以及全基因组范围内扫描硅相关基因，通过检测候选基因与群体的方法克隆得到果霜相关基因CsLsi2，该基因在果皮及刺中优势表达，并且表达水平与硅的含量相关，具有较多的果霜的黄瓜品系中黄瓜CsLsi2基因表达量高，果实果皮几乎无果霜的黄瓜品系中黄瓜CsLsi2基因表达量低极低；本发明进一步对果实果霜不同的品系中黄瓜CsLsi2基因克隆后发现在SEQ ID NO:1第754位的碱基由C变为T后会导致氨基酸翻译的提前终止；黄瓜CsLsi2基因的克隆及表达分析对解决黄瓜果霜基因资源难以筛选的问题起到了很大程度的促进作用。

附图说明

图1是本发明实施例1提供黄瓜3402自身嫁接(3402/3402)、经黑籽南瓜嫁接的黄瓜3402(3402/Cf)和经北农亮砧嫁接的黄瓜3402(3402/Cm)果实表皮果霜的差异对比图，其中B、B1、B2、C、C1、C2为在电镜扫描下的结果示意图；

图2是本发明实施例1提供的黄瓜3402自身嫁接(3402/3402)、经黑籽南瓜嫁接的黄瓜3402(3402/Cf)和经北农亮砧嫁接的黄瓜3402(3402/Cm)果实表皮果霜变化示意图；

图3是本发明实施例2提供的对黄瓜高代自交系3548-1、3549-1进行硅增施以及硅吸收抑制后，果实硅含量变化的示意图；

图4为本发明实施例3提供的黄瓜3548-1和黄瓜3549-1果实果霜对比图；

图5为本发明实施例3提供的黄瓜3548-1和黄瓜3549-1果皮及果肉硅含量对比图；

图6为本发明实施例3提供的黄瓜3548-1和黄瓜3549-1果皮能谱检测分析结果图；

图7是本发明实施例4提供的黄瓜CsLsi1/CsiT-1基因和CsiT-2基因在黄瓜3549-1、黄瓜3548-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜5553-1和黄瓜5552-1中表达水平变化示意图；

图8是本发明实施例4提供的黄瓜CsLsi2基因在黄瓜3549-1、黄瓜3548-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜5553-1和黄瓜5552-1中的克隆对比图；

图9是本发明实施例5提供的黄瓜CsLsi2基因的蛋白跨膜区分析图；

图10是本发明实施例6提供的黄瓜CsLsi2基因在黄瓜3548-1和黄瓜3549-1根部、茎、叶、雌蕊、雄蕊、果实、果皮和果肉中的表达分析图；

图11是本发明实施例6提供的黄瓜CsLsi2基因在黄瓜3549-1、黄瓜3548-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜5553-1和黄瓜5552-1中的果皮中的表达分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所用实验方法若无特别说明均为常规实验手段，所用黄瓜高代自交系3548-1、3549-1、3555-1、3554-1、5553-1和5552-1(以下简称黄瓜3548-1、黄瓜3549-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜5553-1和黄瓜5552-1)来源于中国农业大学黄瓜遗传改良课题组，公开于Plant Biotechnology Journal(Yang et al.,2019,17:289-301)，可公开获取(仅用于科研和教学目的)。

其中黄瓜3548-1为黄瓜3549-1的突变体(黄瓜3548-1果霜更少)，黄瓜3554-1为黄瓜3555-1的突变体(黄瓜3554-1果霜更少)，黄瓜5552-1为黄瓜5553-1的突变体(黄瓜5552-1果霜更少)。

实施例1

本实施例提供一种通过电镜扫面观察黄瓜果实表面果霜形态的方法

1.1、材料：黄瓜3402、黑籽南瓜和北农亮砧

(1)将黄瓜3402自身嫁接、嫁接在黑籽南瓜以及嫁接在北农亮砧上生长的新鲜果实样品于3％(v/v)戊二醛中固定24h；

(2)取出果实样品，然后在pH＝6.8，0.1M PBS(phosphate buffer sodium)中冲洗三次，每次10min；

(3)用体积比为1％的四氧化锇进行固定；

(4)将样品依次置于浓度为50％、70％、80％、90％、100％的酒精脱水干燥，每次10min；

(5)样品置于100％的丙酮中洗2次，每次15min；

(6)样品于100％的乙酸异戊酯洗3次，每次15min；

(7)在液态CO₂(Bal-Tec)临界点干燥仪中进行干燥处理；

(8)对样品进行喷金粉(10-nm-thick)操作，然后通过扫描电子显微镜(HitachiS-4700)在2kv的加速电压下观察拍照。

结果如图1和图2所示，相比于黄瓜3402自身嫁接(3402/3402)，经黑籽南瓜嫁接的黄瓜3402(3402/Cf)果实表皮果霜明显增多；相反，经北农亮砧嫁接的黄瓜3402(3402/Cm)果实表皮果霜明显减少。

实施例2

本实施例提供一种田间硅的增施、抑制及硅含量测定方法，具体步骤如：

1、材料

以黄瓜3549-1为试材。将试验所用黄瓜种子进行消毒，置于28℃培养箱种进行催芽，然后进行72穴盘育苗。在金六环农业园进行幼苗培养，按照标准化模式进行培养。待长至第1片真叶完全展开时移植到保护地中进行田间管理。

2、试验处理

进入初瓜期时对黄瓜3549-1分别进行硅增施(三种浓度)及硅吸收抑制(一种浓度)处理，每个处理3株，3次重复。硅增施使用的物质为K₂SiO₄，分别以低浓度(0.02mM)、中等浓度(0.2mM)、高浓度(1.7mM)进行灌根处理，每隔1天一次，共6次；硅吸收抑制利用NaN₃作为硅吸收的抑制剂，浓度为2.0mM，每隔1天一次，共6次。处理后的黄瓜3549-1按照标准化模式进行管理，在商品瓜时期观测果实的外部形态。

3、样品中硅含量测定

称取黄瓜3549-1果实表皮的烘干粉碎样品0.3g，放入瓷坩埚内，在马弗炉中300℃预灰化3小时，升至550℃灰化4小时。将灰化样品用48ml0.08mol/L H₂SO₄洗入干净的聚乙烯瓶中，加入2ml 40％HF，摇床振荡过夜，过滤。取2ml滤液转移到新的一次性塑料杯中，加入50ml 0.32％H₃BO₃，振荡2小时。取10ml混合液，加入5ml H₂SO₄-钼酸铵混合液(H₂SO₄:钼酸铵1:1(v/v)，H₂SO₄浓度为0.08mol/L，钼酸铵的浓度为20g/L)，振荡反应5min，然后加入5ml3.3％酒石酸和5ml 0.4％还原型抗坏血酸，振荡反应25min，在811nm处测定吸光度。3次重复，计算平均值。

结果如图3所示，其中，A图显示，硅增施后黄瓜3549-1果实表皮果霜显著增多，且果皮中硅含量随着增硅处理浓度的而相应增加；B图显示，硅吸收抑制处理后黄瓜3549-1果实表皮果霜与硅含量均无显著差异。这显示出硅含量与果霜发生程度密切相关。

实施例3

本实施例以黄瓜3548-1和黄瓜3549-1为试材，通过电镜扫描对果实表面果霜进行能谱分析，具体方法实施例1的步骤相同，区别在于在步骤(8)中，将样品进行表面镀铂金后，放入扫描电子显微镜样品室中，使用15kV的加速电压对测试部位进行放大观察，并用X射线能谱分析仪对样品进行元素定性半定量分析。

结果如图4-图6所示，图4为黄瓜3548-1和黄瓜3549-1果实果霜对比图，如图4所示，两者果实中总硅含量无显著差异；

图5为黄瓜3548-1和黄瓜3549-1果皮及果肉硅含量对比图，如图5所示，果霜较多的黄瓜3548-1果肉中硅含量显著低于黄瓜3549-1，而黄瓜3548-1果皮中硅含量显著高于黄瓜3549-1；

图6为黄瓜3548-1和黄瓜3549-1果皮能谱检测分析结果图，如图6所示，黄瓜3549-1(野生型)的果皮中分布的粉状物是由硅所引起的。

实施例4

本实施例提供一种黄瓜果霜性状相关基因的筛选方法

本发明在黄瓜全基因组范围内进行检索，发现黄瓜中仅存在3个与硅通道相关的基因，分别为：Csa3G826640(CsLsi1/CSiT-1)、Csa3G826650(CSiT-2)和Csa3G182780(CsLsi2)。其中Csa3G826640和Csa3G826650属于硅吸收基因，而Csa3G182780则属于硅外排基因。其中CsLsi1/CSiT-1和CSiT-2为调控硅吸收的基因。

本发明对黄瓜3548-1和黄瓜3549-1进行转录组测序(RNA-seq)，结果表明黄瓜CsLsi1/CSiT-1和CSiT-2在两份材料中表达无明显变化规律，表明这两个基因可能与果霜的形成没有直接关系。

本发明进一步检测CsLsi1/CSiT-1和CSiT-2在黄瓜3549-1、黄瓜3548-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜5553-1和黄瓜5552-1中CsLsi1/CSiT-1和CSiT-2基因的表达水平，结果如图7所示，CsLsi1/CSiT-1+CSiT-2的表达水平在各组供试材料间则几乎一致，这表明CsLsi1/CSiT-1和CSiT-2可能具有协同表达的模式，两者共同参与了黄瓜植株根部对硅的吸收及运转。

本发明进一步利用同源克隆的方法对黄瓜CsLsi2基因在黄瓜3548-1和黄瓜3549-1中分别进行克隆，结果如图8所示，本发明发现在果霜更多的三种突变体(黄瓜3548-1、黄瓜3554-1和黄瓜5552-1)中，基因如SEQ ID NO.1所示序列第754位存在1个位点的突变，由C突变为T，形成终止密码子，导致其翻译提前终止，说明黄瓜CsLsi2基因和黄瓜的果霜性状密切相关。

实施例5

本实施例对黄瓜CsLsi2基因进行克隆，具体步骤如下：

1、总RNA的提取

采用植物总RNA提取试剂盒(购自北京华越洋生物技术有限公司)提取黄瓜雄花芽的总RNA，并用DNase去除RNA样品中残留的DNA，并用Nanodrop测其RNA浓度。步骤如下：

(1)在RNAase处理过的研钵中加入田间取的雄花芽，加入液氮研磨至粉末状。将研磨物转移至干净无RNA酶的2mL塑料离心管，加入1ml细胞裂解液(试剂盒自带)，上下摇晃混匀。

(2)取300μl的去蛋白液(试剂盒自带)和200μl自备氯仿加入上述样品中，在振荡器上振荡30-60s混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。室温12000rpm离心3-5min，离心管中液体上下分层，中间为细胞破碎物。

(3)将上清液(约600-800μl)转移到另一干净的2mL塑料离心管中，避免触及或吸取中间层细胞破碎物和下层有机溶剂。加入等体积的漂洗液，充分颠倒混匀。吸取700μl的溶液转移到试剂盒自带的离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。

(4)加700μl洗柱液，12000rpm室温离心30s，弃穿透液。重复上述洗柱液一次。将空的吸附柱12000rpm室温离心1min，完全去除废液，否则残留的乙醇会影响后面RNA的使用。往吸附柱的中央加入50μl DNase反应液，室温静置15min，加入500μl通用洗柱液，12000rpm室温离心1min，弃穿透液。12000rpm室温离心1min，完全去除废液。

(5)将离心吸附柱转移到新的1.5ml RNase-free收集管中，加入50-100μl RNA洗脱液，室温放置1-2min。12000rpm室温离心1min，离心管中溶液即为RNA样品，存放于-80℃待用。

2、cDNA第一链的合成

以1μg黄瓜果实RNA为模板，利用Takara逆转录试剂盒合成cDNA第一链，反转录步骤参照该试剂盒的说明书，cDNA第一链合成后-20℃保存备用。

3、基因的克隆

以黄瓜3549-1的黄瓜果实的cDNA作模板，以如下引物对为引物：

正向引物：5'-ATGGCCATGGATCATACTGTAA-3'

反向引物5'-TCATTTTATAAGAACTAAACCA-3'，进行PCR扩增，

PCR扩增程序：

将PCR产物进行凝胶回收酶切产物，然后用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定后的阳性菌液送华大基因公司测序。

图9为本实施例提供的黄瓜CsLsi2基因的蛋白跨膜区分析图，如图9所示，黄瓜CsLsi2基因具有12个跨膜结构域，9-30、36-52、64-90、103-133、143-169、160-203、350-368、372-388、402-427、440-467、484-509及527-544位置的氨基酸为跨膜结构域。

实施例6

本实施例对黄瓜CsLsi2基因在黄瓜各组织部位的表达水平进行荧光定量PCR检测，具体步骤如下：

(1)对黄瓜3549-1、黄瓜3548-1、黄瓜3555-1、黄瓜3554-1、黄瓜5553-1和黄瓜5552-1植株取雌花芽、雄花芽、叶、茎、卷须基部、卷须、受精的子房、未受***房以及根部进行RNA提取及cDNA第一条链的合成，方法与实施例5中相同。

(2)荧光定量分析所用试剂盒为SYBR Premix Ex Taq(TaKara，DRR041S)，仪器为ABI 7500，引物设计为：

正向引物5'-GTGCTGTCGTGGAAGAGTAAA-3'

反向引物5'-ATGACCAAGTTTGGGGGTT-3'，荧光定量的反应体系为：

扩增程序为：95℃,30sec；(95℃,5sec；60℃,40sec),40cycles。以TUα基因为内参，利用2^-△△Ct算法计算各基因表达量变化。

得到如图10和图11所示结果。

如图10所示，黄瓜CsLsi2基因在果皮部表达水平较高，这表明该基因与黄瓜果霜的形成有关。

如图11所示，黄瓜CsLsi2基因在突变体(黄瓜3548-1、黄瓜3554-1和黄瓜5552-1)中相较于野生型(黄瓜3549-1、黄瓜3555-1和黄瓜5553-1)中表达水平均显著降低。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 黄瓜CsLsi2基因及其编码的蛋白和应用

<130> KHP191115145.8

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccatgg atcatactgt aaaagtcatt ctaggctcaa ttgccttcgc agtcttctgg 60

ttattagctg ttttccctgc tatcccattt ctaccaattg ggagaacagc aggttctatc 120

ctaggggcaa tgctcatggt cgtatttcga gtcctaactc cagaacaagc atatgcggcc 180

attgatctcc caatacttgg tcttctgttt ggaacaatgg tagttagtgt ttatcttgaa 240

agagctgata tgttcaagta tttgggtaag gtgctgtcgt ggaagagtaa aggagcaaag 300

gatttaattt gtcgagtgtg tctgatatct gcaatttcaa gtgcgttttt caccaatgac 360

acctcatgtg tggttttgac tgaatttgtt ttaaaaattg ccaggcaaca taatcttcct 420

ccccgcccct tccttcttgc ccttgcatcg agtgcaaata ttggttcttc agcaacaccg 480

attggcaacc cccaaaactt ggtcatagct gtccagagta aaattcattt tgggcaattt 540

gtgattggaa tactcccagc tatgcttgtt ggtgttgttg taaatgcttt aattattctt 600

atcatgtact ggaaattgtt atctgtccag aaggatgaag aagatccatc accagaagtt 660

attgccgatg aagatgttct ttctcacaga ttttcaccag ccagattatc acactcacaa 720

attccatccc ttaattctgc agaatgggat tctcgattgg atttgatgaa cgcacaaagt 780

cctccatgct cgaacacaaa tgtggaaact ataagaaatt cagtaagttc aaaagataat 840

gaagaaatcc gcaggtctca tagtactatg acggagccgg caagaatatc tgatgcttca 900

aaagagtggc tgcccaatgc gtctactcag aaaagggaag aagatttctc ttctaagagc 960

ctcaactcaa tggaaaaaca gaaagaacct gtaattttgc agtcctcaga agggaaggaa 1020

cattggagca ccaaatggag aaggattgca tggaaatcct gtgtttatct tgtgactgta 1080

ggaatgcttg ttgctttatt gatgggcttg gatatgtcat ggactgccgt gactgctgca 1140

ctcgctcttg tggttcttga tttcaaggat gctcagccat gcctagaaaa ggtttcatat 1200

tcacttttag ttttcttttg tgggatgttt atgacggttg atggatttaa caaaactgga 1260

ttgccaagtg ctttttggaa tttcatggag ccgcatgcac agattgatcg tgtttctggc 1320

actgtagttc ttgctcttgt catactgtac ctctcaaact tggcttcaaa cgtgcctact 1380

gttcttctgc ttggagcacg agtcgctgca tcggctgctg caatttctcc aaccgaagaa 1440

aaacgggcat ggcttctttt agcttggatc agtactgtag ctggaaatct ctcattgtta 1500

gggtcagctg ccaacttgat tgtgtgtgaa caggctcgtc gcactccaca gctaagctac 1560

aatttatcct tctggaatca tcttaaattt ggacttccct caactcttat tgtcacagcc 1620

attggtttag ttcttataaa atga 1644

<210> 2

<211> 546

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Met Asp His Thr Val Lys Val Ile Leu Gly Ser Ile Ala Phe

1 5 10 15

Ala Val Phe Trp Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile Pro Phe Leu Pro

20 25 30

Ile Gly Arg Thr Ala Gly Ser Ile Leu Gly Ala Met Leu Met Val Val

35 40 45

Phe Arg Val Leu Thr Pro Glu Gln Ala Tyr Ala Ala Ile Asp Leu Pro

50 55 60

Ile Leu Gly Leu Leu Phe Gly Thr Met Val Val Ser Val Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Arg Ala Asp Met Phe Lys Tyr Leu Gly Lys Val Leu Ser Trp Lys Ser

85 90 95

Lys Gly Ala Lys Asp Leu Ile Cys Arg Val Cys Leu Ile Ser Ala Ile

100 105 110

Ser Ser Ala Phe Phe Thr Asn Asp Thr Ser Cys Val Val Leu Thr Glu

115 120 125

Phe Val Leu Lys Ile Ala Arg Gln His Asn Leu Pro Pro Arg Pro Phe

130 135 140

Leu Leu Ala Leu Ala Ser Ala Asn Ile Gly Ser Ser Ala Thr Pro Ile

145 150 155 160

Gly Asn Pro Gln Asn Leu Val Ile Ala Val Gln Ser Lys Ile His Phe

165 170 175

Gly Gln Phe Val Ile Gly Ile Leu Pro Ala Met Leu Val Gly Val Val

180 185 190

Val Asn Ala Leu Ile Ile Leu Ile Met Tyr Trp Lys Leu Leu Ser Val

195 200 205

Gln Lys Asp Glu Glu Asp Pro Ser Pro Glu Val Ile Ala Asp Glu Asp

210 215 220

Val Leu Ser His Arg Phe Ser Pro Ala Arg Leu Ser His Ser Gln Ile

225 230 235 240

Pro Ser Leu Asn Ser Ala Glu Trp Asp Ser Arg Leu Asp Leu Met Asn

245 250 255

Ala Gln Ser Pro Pro Cys Ser Asn Thr Asn Val Glu Thr Ile Arg Asn

260 265 270

Ser Val Ser Ser Lys Asp Asn Glu Glu Ile Arg Arg Ser His Ser Thr

275 280 285

Met Thr Glu Pro Ala Arg Ile Ser Asp Ala Ser Lys Glu Trp Leu Pro

290 295 300

Asn Ala Ser Thr Gln Lys Arg Glu Glu Asp Phe Ser Ser Lys Ser Leu

305 310 315 320

Asn Ser Met Glu Lys Gln Lys Glu Pro Val Ile Leu Gln Ser Ser Glu

325 330 335

Gly Lys Glu His Trp Ser Thr Lys Trp Arg Arg Ile Ala Trp Lys Ser

340 345 350

Cys Val Tyr Leu Val Thr Val Gly Met Leu Val Ala Leu Leu Met Gly

355 360 365

Leu Asp Met Ser Trp Thr Ala Val Thr Ala Ala Leu Ala Leu Val Val

370 375 380

Leu Asp Phe Lys Asp Ala Gln Pro Cys Leu Glu Lys Val Ser Tyr Ser

385 390 395 400

Leu Leu Val Phe Phe Cys Gly Met Phe Met Thr Val Asp Gly Phe Asn

405 410 415

Lys Thr Gly Leu Pro Ser Ala Phe Trp Asn Phe Met Glu Pro His Ala

420 425 430

Gln Ile Asp Arg Val Ser Gly Thr Val Val Leu Ala Leu Val Ile Leu

435 440 445

Tyr Leu Ser Asn Leu Ala Ser Asn Val Pro Thr Val Leu Leu Leu Gly

450 455 460

Ala Arg Val Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ile Ser Pro Thr Glu Glu Lys

465 470 475 480

Arg Ala Trp Leu Leu Leu Ala Trp Ile Ser Thr Val Ala Gly Asn Leu

485 490 495

Ser Leu Leu Gly Ser Ala Ala Asn Leu Ile Val Cys Glu Gln Ala Arg

500 505 510

Arg Thr Pro Gln Leu Ser Tyr Asn Leu Ser Phe Trp Asn His Leu Lys

515 520 525

Phe Gly Leu Pro Ser Thr Leu Ile Val Thr Ala Ile Gly Leu Val Leu

530 535 540

Ile Lys

545

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