阅读说明：本技术 解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用 (Application of bacillus amyloliquefaciens in preventing and treating cucumber anthracnose ) 是由 康捷 章淑艳 韩韬 秦艳梅 马清河 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物菌剂的制作及应用,特别是指解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用。是将解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciensCG MCC No.12821接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；将发酵液去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为40％-60％,冷藏静置过夜后高速离心20-30分钟,收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶,得到抗菌蛋白粗提液。本发明填补了目前尚无解淀粉芽孢杆菌用于黄瓜炭疽病防治的技术空白,具有所制备的抗菌蛋白对黄瓜炭疽病防治效果明显提高,黄瓜的增产效果显著提高等优点。(The invention belongs to preparation and application of a microbial agent, and particularly relates to application of bacillus amyloliquefaciens in prevention and treatment of cucumber anthracnose. Inoculating Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens CG MCC No.12821 into a sterile fermentation medium containing a carbon source, a nitrogen source and necessary nutrient elements for aeration fermentation; removing thalli from the fermentation liquor, collecting supernatant, adding ammonium sulfate into the supernatant while stirring until the saturation degree is 40% -60%, refrigerating and standing overnight, then centrifuging at high speed for 20-30 minutes, collecting precipitate, and redissolving with tris-HCl buffer solution with the pH value of 6.8 to obtain the crude antibacterial protein extract. The invention fills up the technical blank that no bacillus amyloliquefaciens is used for preventing and treating cucumber anthracnose at present, and has the advantages that the prepared antibacterial protein has obviously improved effect of preventing and treating the cucumber anthracnose, the yield increasing effect of the cucumber is obviously improved, and the like.)

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用

技术领域

本发明属于微生物菌剂的制作及应用，特别是指解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用。

背景技术

黄瓜炭疽病病原属半知菌亚门，炭疽菌属真菌。病菌主要以菌丝体或未成熟的分生孢子盘(拟菌核)在病残组织及土壤中越冬，菌丝体也可附着在种子表面，或在温室、大棚内的设施和架材上存活。翌春，病菌发育成分生孢子，借风雨、灌溉水、昆虫传播，带菌种子也可直接引起幼苗发病。黄瓜炭疽病是黄瓜重要病害之一，在黄瓜苗期和成株期危害，近年来有危害加重的趋势。发病初期，病叶产生淡黄色近圆形小斑点，病斑扩大后变为黑褐色，且具轮纹。干燥时病斑中央易穿孔破裂，严重时叶片提早枯死，减产严重。瓜蔓及叶柄发病后，病斑呈椭圆形深褐色凹陷，湿度大时病斑部位溢出粉红色黏液。

目前对于黄瓜炭疽病的防治方法主要有以下方式：

1、选用优质、高产、抗病品种。播种前进行种子处理，以杀灭种子附带的病菌，减少初侵染源。例如播种前将种子置于55℃温水中浸泡20分钟，或用50％多菌灵可湿性粉剂500倍液浸种1小时，也可用0.1％高锰酸钾1000倍液浸种1小时，将种子洗净后催芽。过程繁琐，且后期如果条件适宜，借风雨和昆虫等传播，土壤带菌也会引起植株发病。

2、实行轮作。大部分病原菌都能随病株残体在土壤中存活3-5年甚至10年，成为初侵染源。因此必须实行3年以上轮作，周期长。

3、喷药防治。发病初期先摘除病叶，然后喷药,常用药剂有15％粉锈宁1500倍液，50％多菌灵500倍液，65％代森锌500倍液，70％代森锰锌400倍液，70％甲基托布津800-1000倍液，75％百菌清600倍液，80％炭疽福美500-600倍液等，5-7天喷1次，连喷4-5次，农药交替使用。农药等的过量使用造成了环境污染、土壤多样性破坏、植株对病原菌产生抗药性等问题。

4、化学诱导抗病防治。王晨芳等采用BTH〔苯基(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸硫甲酯〕诱导黄瓜对黄瓜炭疽病的抗病性，但BTH对炭疽菌孢子萌发及菌丝生长均无直接抑制作用，且诱导处理黄瓜植株抗病性的表达需一定的时间间隔。

因此，对于黄瓜炭疽病防治重点逐步转向环境友好的生物防治，该防治方法具有广谱、无毒、无污染等优点。自Johnson等(1945)报道枯草芽胞杆菌(Baci l lus subti lis)可产生抗菌物质后，开发微生物源抗菌物质拮抗真菌病害已成为研究热点。从芽胞杆菌中可分离得到多种抗菌物质，包括多肽类、脂肽类及抗菌蛋白等，不仅能抑制多种植物病原真菌，还可抑制某些食品腐败真菌与致病菌。解淀粉芽孢杆菌(Baci l lus amyloliquefaciens)与枯草芽孢杆菌均为安全菌株且特性非常相似，直到1967年Welker等才把二者分开。解淀粉芽孢杆菌是广泛存在于自然界的一种非致病性细菌，其通过非核糖体途径合成分子量小的脂肽类抗生素，从而对植物病原细菌、真菌、病毒、线虫的抑制起到主要作用，其作为一类生防资源在植物病害防治中发挥着重要作用。

目前越来越多芽孢杆菌也被应用到植物病虫害的防治中，已有研究表明枯草芽孢杆菌对黄瓜的枯萎病、白粉病、根腐病等有一定的防治作用，但对黄瓜炭疽病的抑制作用还未有报道。解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.12821是申请人自保定市定兴县麻山药根际土壤中分离取得，经生理生化和16s rRNA基因序列同源性分析对该菌进行分类鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylol iquefaciens)。该菌株已于2016年8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。其对炭疽杆菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌等多种病菌有较强的抑制作用。其在田间防治麻山药根腐病防治效果为45.68％-85％，同时有很好的肥效，与对照相比有明显的差异。

申请人认为，不同作物易染病菌不一样，且不同菌株对同一种病菌的防治效果也存在较大区别。目前将解淀粉芽孢杆菌用于黄瓜炭疽病防治未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供解淀粉芽孢杆菌在黄瓜炭疽病防治中的应用。

本发明的整体技术构思是：

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用，包括将拉丁文名称为Bacillusamyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；还包括如下工艺步骤：

A、抗菌蛋白粗提液的制备

将发酵液去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为40％-60％，冷藏静置过夜，8000-12000转/分钟离心20-30分钟，收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶，得到抗菌蛋白粗提液。

本发明中的具体技术内容还有：

为提高抗菌蛋白的含量及品质，进一步增强防治效果，优选的技术方案是，还包括一步骤B，该步骤的工艺条件如下：

B、超滤脱盐浓缩

将步骤A得到的抗菌蛋白粗提液置于超滤膜中过滤，在截留部分中添加pH＝6.8的tris-HCl缓冲液，重复超滤2-4次，收集截留部分制成脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液。

更为优选的技术方案是，步骤B的超滤膜规格为5000Da。

更进一步，还包括一步骤C，该步骤的工艺条件如下：

C、采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝胶层析对步骤B中制备的脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液进行分离纯化得到抗菌蛋白。

更进一步，步骤C的具体工艺条件如下：

C、将预处理的DEAE Sepharose Fast Flow手动装填，用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱平衡柱床，将步骤B的样品上样，先用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱，然后用浓度为0.1-1.0M的NaC1溶液进行梯度洗脱，在紫外波长280nm处检测抗菌蛋白吸光度值，收集洗脱液，供Sephadex G-200凝胶层析进一步分离纯化；Sephadex G-200凝胶溶胀后装柱，同样条件下平衡、梯度洗脱、收集得到抗菌蛋白。

更进一步，还包括一步骤D，该步骤的工艺条件如下：

D、将步骤C中的抗菌蛋白进行真空冷冻干燥24-36小时，得到冻干粉。

优选的技术方案是，步骤A中的去除菌体是将发酵液离心、过滤。

本发明所具备的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、本发明填补了目前尚无解淀粉芽孢杆菌用于黄瓜炭疽病防治的技术空白，经申请人对利用本发明方法制备的微生物菌剂进行检测，各项技术指标符合GB20287-2006的要求。

2、经申请人在盆栽试验和田间试验对比试验结果表明，使用本发明制备的抗菌蛋白比施用多菌灵对黄瓜炭疽病防治效果明显提高，黄瓜的增产效果显著提高。

3、经申请人试验证实，采用本发明的方法制备的抗菌蛋白处理的黄瓜种子发芽率显著高于对照组，说明抗菌蛋白可以有效降低黄瓜炭疽病原菌对黄瓜种子发芽生长的抑制作用，降低发病率。

4、经申请人在显微镜下观察受抑制菌丝的形态变化，并用显微镜观察黄瓜炭疽病原菌被抑制前后菌丝生长的变化后发现，黄瓜炭疽病原菌正常生长时，菌丝细长，粗细一致，表面光滑；当被抑制后菌丝结节，表面不光滑，菌丝变细、弯曲、扭曲,顶端膨大，菌丝结节，说明本发明所制备的抗菌蛋白能够抑制黄瓜炭疽病菌丝体的生长。

附图说明

图1是显微镜观察受本发明中抗菌蛋白抑制的菌落形态变化对比示意图。

图2是显微镜观察受本发明中抗菌蛋白抑制的菌丝形态变化对比示意图。

图1、2中a:对照，黄瓜炭疽病原菌；b:抑菌效果图；c:正常菌丝；d:被抑制菌丝。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用，包括将拉丁文名称为Bacillusamyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；还包括如下工艺步骤：

A、抗菌蛋白粗提液的制备

将发酵液离心、过滤去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为40％，冷藏静置过夜，8000转/分钟离心20分钟，收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶，得到抗菌蛋白粗提液。

B、超滤脱盐浓缩

将步骤A得到的抗菌蛋白粗提液置于超滤膜中过滤，在截留部分中添加pH＝6.8的tris-HCl缓冲液，重复超滤2-4次，收集截留部分制成脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液，超滤膜规格为5000Da。

C、采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝胶层析对步骤B中制备的脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液进行分离纯化得到抗菌蛋白

是将预处理的DEAE Sepharose Fast Flow手动装填，用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱平衡柱床，将步骤B的样品上样，先用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱，然后用浓度为0.1M的NaC1溶液进行梯度洗脱，在紫外波长280nm处检测抗菌蛋白吸光度值，收集洗脱液，供Sephadex G-200凝胶层析进一步分离纯化；Sephadex G-200凝胶溶胀后装柱，同样条件下平衡、梯度洗脱、收集得到抗菌蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子量，其表观分子量约为25kDa。

D、将步骤C中的抗菌蛋白进行真空冷冻干燥24小时，得到冻干粉。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用，包括将拉丁文名称为Bacillusamyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；还包括如下工艺步骤：

A、抗菌蛋白粗提液的制备

将发酵液离心、过滤去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为60％，冷藏静置过夜，12000转/分钟离心30分钟，收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶，得到抗菌蛋白粗提液。

B、超滤脱盐浓缩

将步骤A得到的抗菌蛋白粗提液置于超滤膜中过滤，在截留部分中添加pH＝6.8的tris-HCl缓冲液，重复超滤4次，收集截留部分制成脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液，超滤膜规格为5000Da。

C、采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝胶层析对步骤B中制备的脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液进行分离纯化得到抗菌蛋白

是将预处理的DEAE Sepharose Fast Flow手动装填，用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱平衡柱床，将步骤B的样品上样，先用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱，然后用浓度为1.0M的NaC1溶液进行梯度洗脱，在紫外波长280nm处检测抗菌蛋白吸光度值，收集洗脱液，供Sephadex G-200凝胶层析进一步分离纯化；Sephadex G-200凝胶溶胀后装柱，同样条件下平衡、梯度洗脱、收集得到抗菌蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子量，其表观分子量约为25kDa。

D、将步骤C中的抗菌蛋白进行真空冷冻干燥36小时，得到冻干粉。

其余内容同实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用，包括将拉丁文名称为Bacillusamyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；还包括如下工艺步骤：

A、抗菌蛋白粗提液的制备

将发酵液离心、过滤去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为50％，冷藏静置过夜，10000转/分钟离心25分钟，收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶，得到抗菌蛋白粗提液。

B、超滤脱盐浓缩

将步骤A得到的抗菌蛋白粗提液置于超滤膜中过滤，在截留部分中添加pH＝6.8的tris-HCl缓冲液，重复超滤3次，收集截留部分制成脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液，超滤膜规格为5000Da。

C、采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝胶层析对步骤B中制备的脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液进行分离纯化得到抗菌蛋白

是将预处理的DEAE Sepharose Fast Flow手动装填，用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱平衡柱床，将步骤B的样品上样，先用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱，然后用浓度为0.5M的NaC1溶液进行梯度洗脱，在紫外波长280nm处检测抗菌蛋白吸光度值，收集洗脱液，供Sephadex G-200凝胶层析进一步分离纯化；Sephadex G-200凝胶溶胀后装柱，同样条件下平衡、梯度洗脱、收集得到抗菌蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子量，其表观分子量约为25kDa。

D、将步骤C中的抗菌蛋白进行真空冷冻干燥30小时，得到冻干粉。

其余内容同实施例1。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用，包括将拉丁文名称为Bacillusamyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；还包括如下工艺步骤：

A、抗菌蛋白粗提液的制备

将发酵液离心、过滤去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为45％，冷藏静置过夜，9000转/分钟离心22分钟，收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶，得到抗菌蛋白粗提液。

B、超滤脱盐浓缩

将步骤A得到的抗菌蛋白粗提液置于超滤膜中过滤，在截留部分中添加pH＝6.8的tris-HCl缓冲液，重复超滤2次，收集截留部分制成脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液，超滤膜规格为5000Da。

C、采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝胶层析对步骤B中制备的脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液进行分离纯化得到抗菌蛋白

是将预处理的DEAE Sepharose Fast Flow手动装填，用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱平衡柱床，将步骤B的样品上样，先用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱，然后用浓度为0.3M的NaC1溶液进行梯度洗脱，在紫外波长280nm处检测抗菌蛋白吸光度值，收集洗脱液，供Sephadex G-200凝胶层析进一步分离纯化；Sephadex G-200凝胶溶胀后装柱，同样条件下平衡、梯度洗脱、收集得到抗菌蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子量，其表观分子量约为25kDa。

D、将步骤C中的抗菌蛋白进行真空冷冻干燥28h，得到冻干粉。

其余内容同实施例1。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：

解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜炭疽病中的应用，包括将拉丁文名称为Bacillusamyloliquefaciens、保藏编号为CGMCC No.12821的解淀粉芽孢杆菌接种于含有碳源、氮源及必要营养元素的无菌发酵培养基进行通气发酵；还包括如下工艺步骤：

A、抗菌蛋白粗提液的制备

将发酵液离心、过滤去除菌体后收集上清液,在上清液中边搅拌边加入硫酸铵至其饱和度为55％，冷藏静置过夜，11000转/分钟离心28分钟，收集沉淀并用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液复溶，得到抗菌蛋白粗提液。

B、超滤脱盐浓缩

将步骤A得到的抗菌蛋白粗提液置于超滤膜中过滤，在截留部分中添加pH＝6.8的tris-HCl缓冲液，重复超滤4次，收集截留部分制成脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液，超滤膜规格为5000Da。

C、采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-200凝胶层析对步骤B中制备的脱盐浓缩后的抗菌蛋白粗提液进行分离纯化得到抗菌蛋白

是将预处理的DEAE Sepharose Fast Flow手动装填，用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱平衡柱床，将步骤B的样品上样，先用pH＝6.8的tris-HCl缓冲液洗脱，然后用浓度为0.8M的NaC1溶液进行梯度洗脱，在紫外波长280nm处检测抗菌蛋白吸光度值，收集洗脱液，供Sephadex G-200凝胶层析进一步分离纯化；Sephadex G-200凝胶溶胀后装柱，同样条件下平衡、梯度洗脱、收集得到抗菌蛋白。

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子量，其表观分子量约为25kDa。

D、将步骤C中的抗菌蛋白进行真空冷冻干燥32小时，得到冻干粉。

其余内容同实施例1。

为验证本发明的技术效果，申请人进行了如下试验：

一、对黄瓜炭疽病原菌的抑制作用

将黄瓜炭疽病原真菌在PDA培养基上培养1-2天，用打孔器(直径约6mm)在其菌丝边缘打孔获得6mm的菌饼，将菌饼接种到PDA平板上培养1-2天。在菌丝边缘两侧约25mm处放置直径约6mm圆形无菌滤纸片，在其上加入10-20μL步骤C中的提取液，与对照组比较,连续在显微镜下观察受抑制菌丝的形态变化，并拍照。用显微镜观察黄瓜炭疽病原菌被抑制前后菌丝生长的变化。从图1、2中可以看出，黄瓜炭疽病原菌正常生长时，菌丝细长，粗细一致，表面光滑；当被抑制后,菌丝结节，表面不光滑，菌丝变细、弯曲、扭曲,顶端膨大，菌丝结节，说明该抗菌蛋白能够抑制黄瓜炭疽病菌丝体的生长。

二、降低病害种子发病率

将黄瓜炭疽病原菌接至PDA液体培养基中，28-35℃，160-200转/分钟培养3-5天后，过滤后获得含黄瓜炭疽病原菌的培养液。挑选大小一致，外观无损的黄瓜种子，清水浸泡一天，冲洗3次，将花生种子放在装有滤纸的培养皿上，每皿20粒，加入5mL黄瓜炭疽病原菌培养液，再加入5-10mL步骤C中的抗菌蛋白提取液，对照组加入相同体积的无菌水，置于恒温25-30℃下培养，48小时后计算发芽率。结果发现黄瓜炭疽病原菌对黄瓜种子的萌发起到抑制作用，用解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CGMCC No.12821发酵上清液制备的抗菌蛋白处理的黄瓜种子发芽率显著高于对照组，说明抗菌蛋白可以有效降低黄瓜炭疽病原菌对黄瓜种子发芽生长的抑制作用，降低发病率。

三、解淀粉芽孢杆菌HM9902的抗菌蛋白在防治黄瓜炭疽病上的应用：

1、盆栽试验提高防治效果

将黄瓜炭疽病原菌接至PDA液体培养基中28-35℃，160-200rpm/min培养3-5天后，过滤取菌液喷洒100株盆栽黄瓜的叶片上，用发酵获得的解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens CGMCC No.12821抗菌蛋白和相同体积的无菌水作为对照分别喷洒50株黄瓜的叶片。结果发现用解淀粉芽孢杆菌制备的抗菌蛋白喷洒的只有13株发病，对照组有42株发病，所以解淀粉芽孢杆菌HM9902制备的抗菌蛋白对可以很好地防治黄瓜炭疽病，防治效果可达69.05％。

2、田间试验提高产量

设多菌灵500倍稀释液(T₁)、解淀粉芽孢杆菌发酵上清液(T₂、T₃、T₄、T₅、T₆)和清水对照(T₀)七个处理，每处理3次重复，将处理液加水稀释，浸泡处理黄瓜种子，在徐水试验地播种后再次用喷雾器均匀喷洒到黄瓜叶片上。各处理浇水、施肥等其他管理条件一致。采收时每个处理随机选取50根黄瓜，称重计算产量。

由下表中可以看出T₁-T₆处理的黄瓜产量均显著高于对照组(T₀)，分别高11.49％、30.37％、18.14％、24.86％、31.29％、19.90％，而采用解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白处理(T₂-T₆)的平均产量也显著高于化学防治处理(T₁)，高12.04％，说明本发明制备的解淀粉芽孢杆菌抗菌蛋白对黄瓜增产效果明显。