阅读说明：本技术 大豆多肽及其制备方法和在化妆品中的应用 (Soybean polypeptide, preparation method thereof and application thereof in cosmetics ) 是由 刘露 张娇 韩志东 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及大豆多肽及其制备方法和在化妆品中的应用。本发明大豆多肽的制备方法包括以下步骤：S1对豆粕进行挤压膨化处理,得到膨化豆粕,然后取膨化豆粕进行粉碎,得到膨化豆粕粉末；S2取膨化豆粕粉末,加入水混合均匀,得到发酵底物,然后接种枯草芽孢杆菌进行发酵,发酵结束后得到豆粕发酵液；S3取豆粕发酵液进行灭菌,然后进行离心分离,取上清液,加入吸附剂进行脱色,得到脱色后的大豆多肽溶液；S4取大豆多肽溶液进行超滤,收集大豆多肽,接着减压浓缩、冷冻干燥,得到大豆多肽。本发明的制备方法可有效缩短生产周期,提高产品质量,获得适合应用于化妆品且能够带来抗衰功效的大豆多肽产品。(The invention belongs to the technical field of microbial fermentation, and particularly relates to soybean polypeptide, a preparation method thereof and application thereof in cosmetics. The preparation method of the soybean polypeptide comprises the following steps: s1, performing extrusion puffing treatment on the soybean meal to obtain puffed soybean meal, and then crushing the puffed soybean meal to obtain puffed soybean meal powder; s2, taking the puffed soybean meal powder, adding water, uniformly mixing to obtain a fermentation substrate, then inoculating bacillus subtilis for fermentation, and obtaining soybean meal fermentation liquor after fermentation is finished; s3, sterilizing the soybean meal fermentation liquor, then performing centrifugal separation, taking supernatant, adding an adsorbent to perform decolorization, and obtaining a decolorized soybean polypeptide solution; s4 the soybean polypeptide is obtained by taking the soybean polypeptide solution for ultrafiltration, collecting the soybean polypeptide, then carrying out reduced pressure concentration and freeze drying. The preparation method of the invention can effectively shorten the production period, improve the product quality and obtain the soybean polypeptide product which is suitable for being applied to cosmetics and can bring anti-aging effect.)

大豆多肽及其制备方法和在化妆品中的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及大豆多肽及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

我国是世界十大主要大豆产地之一，大豆资源丰富，而豆粕是大豆经过浸提榨油的副产物，为植物蛋白饲料的主要来源，在畜禽蛋白质饲原料用量上占有很大的比例(60％以上)。豆粕中的蛋白质含量达到35％～39％，粗脂肪含量高达16％～19％，氨基酸含量丰富且平衡，是具有利用价值的蛋白源之一，然而目前豆粕主要应用于畜禽饲料，其应用价值较底，阻碍了豆粕作为高价值农副产物的发展。

以豆粕为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，且分子量分布在10000Da以下的肽称为大豆多肽。由于大豆多肽的分子量比大豆蛋白和其他大豆深加工产品要小，所以具有大豆蛋白等大豆深加工产品所不具备的理化特性和生物活性。因此研究开发大豆肽产品对促进我国豆粕资源的利用与发展、提高豆粕产品附加值和科技含量具有重要意义和经济价值。

目前大豆多肽主要通过酶解法或微生物发酵法实现工业化生产。酶解法具有安全性高、反应条件温和、水解过程可控性强等优点，是目前国内大豆多肽生产制备的主要方法。微生物发酵法是利用某些微生物菌体在生长代谢过程分泌的胞外蛋白酶代替外加复合酶系，对大豆蛋白质进行酶解而获得小肽物质。微生物在酶解大豆蛋白质时不是像酶解法进行简单的定点肽键切割，还会对某些苦味肽基团进行修饰和重组，使小肽之间、小肽和氨基酸之间发生移接、重排。因此与酶解法相比，微生物发酵法生产大豆多肽不仅降低了生产成本，还改善了酶解法肽产品苦味大、异味重的缺点。虽然发展到现在，微生物发酵法生产大豆多肽的研究较多，生产技术也较为成熟，但仍存在亟需解决的问题。

例如专利文献CN106755219A公开了一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，该方法包括取灭菌后的豆粕粉溶液接种入接种量为1～5wt％的枯草芽孢杆菌，然后在25～45℃下发酵培养16～48h，最后通过调pH值、离心、浓缩、冷冻干燥，制得大豆肽粉。该方法通过枯草芽孢杆菌对豆粕进行发酵，提高了大豆多肽的提取率，增强大豆肽的抗氧化能力，但是该大豆多肽的色泽为浅黄色，应用于化妆品中，容易导致白色乳液或膏体发黄，影响产品感官。又如专利文献CN101491288公开了利用地衣芽孢杆菌制备大豆肽工艺，该工艺在25～40℃下利用地衣芽孢杆菌发酵12～24h，有效缩短了发酵周期，但是该工艺制得的发酵液颜色深、气味较大，需要采用活性炭吸附柱进行脱色、脱苦和脱臭。再如专利文献CN103621768A公开了一种采用膨化发酵工艺生产大豆肽蛋白饲料的方法，该方法通过将豆粕投入湿法膨化机中进行粉碎，控制膨化温度，使豆粕的结构变得疏松，然后通过高温高压灭菌，冷却到发酵所需的温度后接种菌种进行发酵，其膨化操作提高了酶解效率，缩短了发酵时间，但是膨化的高温高压处理也导致发酵液色泽加深且新生色素较难脱除。因此现有方法制得的大豆多肽产品的颜色较深，不适宜应用于化妆品中。

脱色是大豆多肽产品精制的重要环节，主要包括化学脱色法和吸附脱色法，其中吸附脱色法更为常用。吸附脱色法主要是利用交换树脂、活性炭、白土和硅藻土等具有独特孔隙结构的材料依靠吸附作用而起到脱色效果。可是现有吸附材料普遍需要在40℃以上的温度环境中加速吸附，且吸附效率较低，制约了吸附脱色法在大豆多肽产品精制过程中的推广应用。

综上，有必须寻求一种大豆多肽的制备方法，其不仅能有效缩短生产周期，还能显著提高产品品质，使大豆多肽产品能够很好地应用于化妆品中。

发明内容

为了克服现有技术中存在的问题(如豆粕发酵时间长、脱色效率低，且大豆多肽产品颜色深，不适合应用于化妆品中)，本发明提供了一种大豆多肽的制备方法，该方法可有效缩短生产周期，提高产品质量，获得适合应用于化妆品且能够带来抗衰功效的大豆多肽产品。

本发明提供的大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1、采用双螺杆挤压膨化机对豆粕进行挤压膨化处理，控制物料含水量为5～15％、模孔孔径为16～22mm、螺杆转速为100～200r/min、挤压温度为80～120℃，得到膨化豆粕，然后取膨化豆粕进行粉碎，过60～80目筛，得到膨化豆粕粉末；

S2、取膨化豆粕粉末，加入水混合均匀，得到发酵底物，然后接种枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵结束后得到豆粕发酵液；

S3、取豆粕发酵液进行灭菌，然后进行离心分离，取上清液，加入吸附剂进行脱色，得到脱色后的大豆多肽溶液；

S4、取脱色后的大豆多肽溶液进行超滤，收集分子量在1000～10000Da的大豆多肽，接着进行减压浓缩、冷冻干燥，得到大豆多肽。

进一步地，所述膨化豆粕粉末与水的重量比为1:(4～10)。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌的接种量为2～6％(v/v)。

进一步地，所述发酵的温度为20～25℃、时间为12～18h。

进一步地，所述离心的转速为3000～4000r/min，离心的时间为10～20min。

进一步地，所述吸附剂为N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物，所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法如下：取N-羧甲基壳聚糖溶于水中，制成质量百分浓度为4～8％的N-羧甲基壳聚糖溶液，然后加入硅藻土，调节pH值为3.0～5.0，搅拌30～40min后过滤，取固体于70～80℃下干燥，制得N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物。

更进一步地，所述N-羧甲基壳聚糖溶液与硅藻土的混合重量比为(2～5):1。

更进一步地，所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的添加量为10～40g/L。

相应地，本发明还提供了由上述大豆多肽的制备方法所制得的大豆多肽，该大豆多肽的色泽为白色，无明显异味，对羟自由基、DPPH自由基的清除率高，具有较强的抗氧化活性。因而本发明也提供了上述大豆多肽在化妆品中的应用，其在化妆品中的添加量为1～3％(w/w)，即可为人们带来良好的抗皮肤衰老功效。

在本发明大豆多肽的制备方法中，首先对豆粕原料进行挤压膨化处理，使豆粕的结构变得膨松，有利于后续枯草芽孢杆菌充分接触底物并紧密附着，从而大大提高微生物对豆粕的利用率，使发酵过程可在20～25℃的常温下进行，且发酵时间缩短至12～18h。同时豆粕挤压膨化过程中，高温、高压、高剪切作用使蛋白质等分子结构发生伸展、重组、分子表面的电荷重新分布等变化，导致产品的功能特性发生改变，而在本发明的操作条件之下，膨化后的豆粕经过发酵可获得抗氧化功效显著的大豆多肽产品。

可是，豆粕中含有的蛋白质和少量的糖在高温下发生美拉德反应生成类黑素，导致发酵产物的颜色加深，而新生色素难以通过普通活性炭、硅藻土等材料吸附脱除，所以为了解决这一问题，针对本发明豆粕发酵液的特性，本发明人经过大量的试验摸索，获得了所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物，其具体机理是：硅藻土的微孔结构丰富、比表面积大，能够很好地吸附小分子色素，但是新生色素的分子量较大且结构复杂，硅藻土对此基本不起吸附作用，因而单纯使用硅藻土的脱色效果差；N-羧甲基壳聚糖是一种两性聚电解质，其分子结构中含有氨基和羧基，在酸性条件下N-羧甲基壳聚糖与硅藻土通过氢键等作用相互结合，从而在硅藻土中引入活性吸附基团，进一步扩大吸附容量，进而显著提高对各类色素的吸附效果，同时N-羧甲基壳聚糖与硅藻土复合后电负性增强，能更好地排斥带负电荷的氨基酸、多肽，从而降低损失率。因此，本发明N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物可在常温下高效吸附豆粕发酵液中的色素，使大豆多肽的颜色由棕黄色变为白色，同时多肽的损失率低、对多肽功效无明显影响，此外还无需在脱色时调节豆粕发酵液的pH值，从而有效缩短了大豆多肽的生产周期，提高了大豆多肽的产品品质。

因此，与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)本发明大豆多肽制备方法的工艺简单、条件可控，生产周期短、生产成本低，可工业化生产，可推广应用。

(2)本发明大豆多肽的色泽为白色，无明显异味，产品质量高，且本发明对羟自由基、DPPH自由基的清除率高，具有较强的抗氧化活性，可直接添加于化妆品中，给人们带来优良的抗衰老等护肤功效，具有良好的市场前景。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明枯草芽孢杆菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号为CICC20030。

实施例1、本发明大豆多肽及其制备方法

S1、采用双螺杆挤压膨化机对豆粕进行挤压膨化处理，控制物料含水量为5％、模孔孔径为16mm、螺杆转速为100r/min、挤压温度为80℃，得到膨化豆粕，然后取膨化豆粕进行粉碎，过60目筛，得到膨化豆粕粉末；

S2、取膨化豆粕粉末，将膨化豆粕粉末与水按照重量比1:4混合均匀，得到发酵底物，然后以2％(v/v)的接种量接种枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵温度为20℃、时间为18h，发酵结束后得到棕黄色的豆粕发酵液；

S3、取豆粕发酵液进行灭菌，然后进行离心分离，离心转速为3000r/min、时间为20min，离心结束后取上清液(棕黄色)，加入N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物10g/L，在25℃下搅拌5min，然后静置脱色35min，得到脱色后的大豆多肽溶液(乳白色)；

S4、取脱色后的大豆多肽溶液进行超滤，收集分子量在1000～10000Da的大豆多肽，接着进行减压浓缩、冷冻干燥，得到大豆多肽产品，该大豆多肽产品的色泽为白色，无明显异味。

所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法如下：取N-羧甲基壳聚糖溶于水中，制成质量百分浓度为4％的N-羧甲基壳聚糖溶液，然后按照N-羧甲基壳聚糖溶液与硅藻土的混合重量比为5:1加入硅藻土，使用醋酸调节pH值为3.0，搅拌30min后过滤，取固体于70℃下干燥，制得N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物。

实施例2、本发明大豆多肽及其制备方法

S1、采用双螺杆挤压膨化机对豆粕进行挤压膨化处理，控制物料含水量为15％、模孔孔径为22mm、螺杆转速为200r/min、挤压温度为120℃，得到膨化豆粕，然后取膨化豆粕进行粉碎，过60目筛，得到膨化豆粕粉末；

S2、取膨化豆粕粉末，将膨化豆粕粉末与水按照重量比1:10混合均匀，得到发酵底物，然后以6％(v/v)的接种量接种枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵温度为25℃、时间为16h，发酵结束后得到棕黄色的豆粕发酵液；

S3、取豆粕发酵液进行灭菌，然后进行离心分离，离心转速为4000r/min、时间为10min，离心结束后取上清液(棕黄色)，加入N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物40g/L，在20℃下搅拌5min，然后静置脱色25min，得到脱色后的大豆多肽溶液(乳白色)；

S4、取脱色后的大豆多肽溶液进行超滤，收集分子量在1000～10000Da的大豆多肽，接着进行减压浓缩、冷冻干燥，得到大豆多肽产品，该大豆多肽产品的色泽为白色，无明显异味。

所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法如下：取N-羧甲基壳聚糖溶于水中，制成质量百分浓度为8％的N-羧甲基壳聚糖溶液，然后按照N-羧甲基壳聚糖溶液与硅藻土的混合重量比为2:1加入硅藻土，使用醋酸调节pH值为5.0，搅拌40min后过滤，取固体于80℃下干燥，制得N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物。

实施例3、本发明大豆多肽及其制备方法

S1、采用双螺杆挤压膨化机对豆粕进行挤压膨化处理，控制物料含水量为10％、模孔孔径为20mm、螺杆转速为100r/min、挤压温度为100℃，得到膨化豆粕，然后取膨化豆粕进行粉碎，过60目筛，得到膨化豆粕粉末；

S2、取膨化豆粕粉末，将膨化豆粕粉末与水按照重量比1:8混合均匀，得到发酵底物，然后以4％(v/v)的接种量接种枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵温度为25℃、时间为12h，发酵结束后得到棕黄色的豆粕发酵液；

S3、取豆粕发酵液进行灭菌，然后进行离心分离，离心转速为3000r/min、时间为20min，离心结束后取上清液(棕黄色)，加入N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物30g/L，在20℃下搅拌5min，然后静置脱色30min，得到脱色后的大豆多肽溶液(乳白色)；

S4、取脱色后的大豆多肽溶液进行超滤，收集分子量在1000～10000Da的大豆多肽，接着进行减压浓缩、冷冻干燥，得到大豆多肽产品，该大豆多肽产品的色泽为白色，无明显异味。

所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法如下：取N-羧甲基壳聚糖溶于水中，制成质量百分浓度为6％的N-羧甲基壳聚糖溶液，然后按照N-羧甲基壳聚糖溶液与硅藻土的混合重量比为4:1加入硅藻土，使用醋酸调节pH值为4.0，搅拌40min后过滤，取固体于80℃下干燥，制得N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物。

实施例4、本发明大豆多肽及其制备方法

S1、采用双螺杆挤压膨化机对豆粕进行挤压膨化处理，控制物料含水量为5％、模孔孔径为16mm、螺杆转速为200r/min、挤压温度为90℃，得到膨化豆粕，然后取膨化豆粕进行粉碎，过60目筛，得到膨化豆粕粉末；

S2、取膨化豆粕粉末，将膨化豆粕粉末与水按照重量比1:6混合均匀，得到发酵底物，然后以4％(v/v)的接种量接种枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵温度为25℃、时间为14h，发酵结束后得到棕黄色的豆粕发酵液；

S3、取豆粕发酵液进行灭菌，然后进行离心分离，离心转速为4000r/min、时间为10min，离心结束后取上清液(棕黄色)，加入N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物20g/L，在20℃下搅拌5min，然后静置脱色35min，得到脱色后的大豆多肽溶液(乳白色)；

S4、取脱色后的大豆多肽溶液进行超滤，收集分子量在1000～10000Da的大豆多肽，接着进行减压浓缩、冷冻干燥，得到大豆多肽产品，该大豆多肽产品的色泽为白色，无明显异味。

所述N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法如下：取N-羧甲基壳聚糖溶于水中，制成质量百分浓度为8％的N-羧甲基壳聚糖溶液，然后按照N-羧甲基壳聚糖溶液与硅藻土的混合重量比为5:1加入硅藻土，使用醋酸调节pH值为5.0，搅拌30min后过滤，取固体于70℃下干燥，制得N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物。

实施例5、本发明大豆多肽在化妆品中的应用

应用一、抗衰面霜：

丙二醇5.00％、甘油5.00％、EDTA二钠0.05％、聚甘油-10硬脂酸酯6.00％、辛酸/癸酸甘油三酯5.00％、牛油果树脂4.00％、鲸蜡醇3.00％、蓖麻油/橄榄油酯类1.5％、碳酸二乙基己酯8.00％、棕榈酸异丙酯5.00％、聚二甲基硅氧烷3.00％、防腐剂0.05％、实施例3大豆多肽2.00％，余量为去离子水。

应用二、抗衰乳液：

尿囊素0.2％、丙二醇5.00％、甘油5.00％、实施例3大豆多肽2.00％、卡波姆0.25％、乳化剂1.3％、肉豆蔻酸异丙酯5.00％、牛油果树脂1.5％、辛基十二醇3.00％、聚二甲基硅氧烷1.5％、棕榈酸异丙酯8.00％、防腐剂0.05％，余量为去离子水。

试验例一、大豆多肽得率的测定

对比例1、取豆粕粉碎，过60目筛，将豆粕粉末与水按照重量比1:8混合均匀，得到发酵底物，然后以4％(v/v)的接种量接种枯草芽孢杆菌进行发酵，发酵温度为25℃、时间为18h，发酵结束后得到黄色的豆粕发酵液。豆粕发酵液经灭菌、离心后保留上清液。

对比例2、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：延长发酵时间至24h，得到棕黄色的豆粕发酵液。豆粕发酵液经灭菌、离心后保留上清液。

对比例3、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：提高发酵温度至35℃，得到棕黄色的豆粕发酵液。豆粕发酵液经灭菌、离心后保留上清液。

对实施例1～4和对比例1～3上清液中的大豆多肽得率进行测定，具体方法如下：

豆粕总蛋白含量测定：采用凯氏定氮法。

肽含量测定：采用双缩脲法。取样品液2.5mL，加入2.5mL的10％三氯乙酸溶液，摇匀后静置10min，5000r/min条件下离心20min后，将上清液转移至50mL容量瓶，用5％的三氯乙酸溶液定容至刻度。取6.0mL上述溶液至另一试管，加入双缩脲试剂4.0mL，混匀后静置10min后，2000r/min离心10min，取上清液于540nm处测定吸光值，对照Gly—Gly—Tyr—Arg四肽标准曲线，得到样品液中的多肽质量浓度，进而得到样品中的多肽得率，测定结果如下表1所示。

多肽得率％＝[(C×V)/M]×100％式中：C为样品液多肽质量浓度，mg/mL；V为样品液体积，mL；M为豆粕中蛋白质质量，mg。

表1各上清液中的大豆多肽得率的测定结果

由上表1可知：对比例1的豆粕原料没有经过膨化处理，其大豆多肽得率仅为14.62±0.04％，而本发明实施例1～4的豆粕原料均经过特定的膨化处理，相比之下，其大豆多肽得率提高至少10％；同时与实施例3相比，对比例2延长了发酵时间，对比例3则提高了发酵温度，可是对比例2和对比例3的多肽得率并没有明显增长，可见本发明制备方法可大大提高微生物对豆粕的利用率，使发酵过程可在20～25℃的常温下进行，且发酵时间缩短至12～18h，有利于缩短生产周期、降低生产成本。

试验例二、脱色率和肽损失率的测定

对比例4、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：加入硅藻土40g/L，在20℃下进行脱色35min，得到脱色后的大豆多肽溶液(黄色)。

对比例5、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：加入N-羧甲基壳聚糖40g/L，在20℃下进行脱色35min，得到脱色后的大豆多肽溶液(棕黄色)。

对比例6、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：在N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法中省略调节pH值的操作，具体如下：取N-羧甲基壳聚糖溶于水中，制成质量百分浓度为6％的N-羧甲基壳聚糖溶液，然后按照N-羧甲基壳聚糖溶液与硅藻土的混合重量比为4:1加入硅藻土，搅拌40min后过滤，取固体于80℃下干燥，制得N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物。

对比例7、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：提高脱色温度至35℃。

对比例8、与实施例3相比，本对比例的区别仅在于：延长脱色时间至60min。

对实施例1～4和对比例4～8脱色操作中的脱色率和肽损失率进行测定，脱色率采用紫外分光吸收法，肽损失率参考试验例一的方法，测定结果如下表2所示。

脱色率％＝[(脱色前OD值-脱色后OD值)/脱色前OD值]×100％

肽损失率％[(脱色前多肽得率-脱色后多肽得率)/脱色前多肽得率]×100％

表2脱色率和肽损失率的测定结果

由上表2可知：

(1)本发明实施例1～4可在常温下高效脱除豆粕发酵液中的色素，使大豆多肽的颜色由棕黄色变为白色，同时多肽的损失率较低，此外还无需在脱色时调节豆粕发酵液的pH值，从而有效缩短了大豆多肽的生产周期，提高了大豆多肽的产品品质。

(2)与实施例3相比，对比例4和对比例5分别单独使用硅藻土和N-羧甲基壳聚糖进行吸附脱色，结果这两种吸附剂对豆粕发酵液的脱色效果均不理想，并且由于上清液呈酸性，N-羧甲基壳聚糖的酸性基团电解受到抑制，电解质带较强的正电性，容易吸附带负电的多肽，导致肽损失率高；而对比例6改变了N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的制备方法，使N-羧甲基壳聚糖和硅藻土在中性环境下结合，结果该N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物的脱色作用减弱，并且肽损失率较高。

(3)与实施例3相比，对比例7和对比例8分别提高了脱色温度、延长了脱色时间，结果两者的脱色率并没有得到明显提高，且对比例7的肽损失率还有所增加。可见本发明N-羧甲基壳聚糖-硅藻土复合物可在常温下高效脱除所述发酵液中的色素。

试验例三、大豆多肽的抗氧化性能检测

(一)还原力测试：

取实施例1～4、对比例1的大豆多肽产品1.0g，加入去离子水20.0mL配制成样品溶液，取样品溶液2.0mL，加入2.5mL 0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液调节其pH值，再加入1.0％的铁***2.5mL(缓冲液为空白)，摇匀，将该混合物置于50.0℃水浴中反应10min，然后加入2.5mL 10％(W/V)三氯乙酸，充分混合后吸取2.5mL于10mL的比色管中，再加入0.5mL1.0mg/mL的三氯化铁，定容，静置10min，测定吸光值。吸光值越大表明还原力越强，抗氧化活性也越强。

(二)羟自由基清除活性测试：

采用水杨酸法，按表3加样方法，在10mL的比色管中依次加入1.0mL 10mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1.0mL 10mmol/L硫酸亚铁溶液、1.0mL样品溶液(取实施例1～4、对比例1的大豆多肽产品1.0g，加入去离子水20.0mL配制成溶液)、1.0mL蒸馏水，最后加入1.0mL10mmol/L H₂O₂启动Fenton反应，摇匀后于室温静置30min，以蒸馏水作为参比于510nm处测定其吸光度。羟自由基清除能力计算公式如式下所示：羟自由基清除率＝[1-(Ax-AxO)/AO]×100％，式中：AO为空白对照的吸光度，Ax为加样品的吸光度；AxO为不加水杨酸时溶液的本底吸光度。

表3羟自由基清除试验加样方法

(三)DPPH自由基清除活性测试：

取实施例1～4和对比例1的大豆多肽产品1.0g，加入去离子水20.0mL配制成样品溶液，取样品溶液2mL，加入2mL 0.2mmoL/L的DPPH溶液，迅速混匀后，室温下避光静置30min，在517nm下测定溶液的吸光值，DPPH自由基清除率按式如下公式计算。

DPPH自由基清除率＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％，式中：Ai为无水乙醇+DPPH吸光度，Aj为样品+DPPH吸光度，Ac为样品+无水乙醇吸光度。

试验结果如下表4所示。

表4大豆多肽的抗氧化性能检测结果

由上表4可知：与没有对豆粕进行膨化处理的对比例1相比，本发明实施例1～4制备方法制得的大豆多肽具有更强的还原力，且对羟自由基、DPPH自由基的清除率高，表明本发明大豆多肽的抗氧化活性强，具有抗皮肤衰老的功效，能够应用于化妆品中。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。