具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

液体发酵，可以使底物与发酵液充分接触，该技术解决了桦褐孔菌生长慢、量产低的问题。优化发酵培养条件的方法包括单次单因子法、正交试验设计法和响应面法等多种方法。优化因素较少的情况，采用单次单因子法和正交实验，优化因素多则考虑响应面法。

以选择系数为指标，通过优化培养基中的氮源种类和作为底物的中药药渣的添加量，研宄氮源种类和中药药渣对选择系数的影响。之后选取Tween 80、pH、KH₂PO₄等10个影响因素进行系列实验，确定最佳的发酵预处理工艺。

一、方法：

1.中药药渣预处理

中药药渣来源于长春某药厂，主要是补气益气类中药药渣，如大枣，人参，黄芪及蒲公英根等。将其用蒸馏水清洗3遍，自然条件下晾干，磨碎过筛，收集60-120目的药渣颗粒，装袋后存放干燥处备用。

2.培养基

麦芽蛋白胨琼脂培养基(w/v)：蛋白胨0.3g，琼脂1.5g，麦芽浸粉3g，pH保持自然。液体种子培养基(w/v)：CaCl₂ 0.01g，葡萄糖2g，酵母浸出物0.1g，KH2PO4 0.1g,蛋白胨0.3g，MgSO4 0.15g，用蒸馏水定容到100mL，pH保持自然。

基础发酵培养基(w/v)：玉米粉3.5g(水解)，蛋白胨0.3g，FeSO₄·7H₂O0.005g，CuSO₄·5H2O 0.002g,K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，KH₂PO₄ 0.1g，MgSO₄0.02g,ZnSO₄·7H₂O 0.001g，MnCl₂·4H₂O 0.009g,CoCl₂·6H2O 0.002g,CaCl₂0.05g，蒸馏水定容100mL，pH值调至6.0，加入中药药渣3g，接种3mL种子培养基。

优化氮源种类的培养基：

氮源种类包括：蛋白胨、牛肉膏、酵母浸出物三种有机氮源，尿素和(NH4)2SO4两种无机氮源。其余组分与基础发酵培养基相同。

优化中药药渣添加量培养基：换用新氮源，药渣设计5％，10％，15％，20％共4组添加量，其余组分与基础发酵培养基相同。

3.菌种制备

配好种子培养基：121℃高压灭菌30min后接种3mL种子母液，摇床培养，转速150rpm/min、温度28℃。当培养基中的菌种状态呈现密集菌球，转入4℃冰箱冷藏。

4.发酵培养

将装有液体培养基的锥形瓶放入高压灭菌锅中121℃灭菌30min，超净台中接种3mL种子菌液后，摇床培养10天，转速150rpm/min、温度28℃。

5.木质纤维素的成分含量测定

本实验的测定采用改良Van Soest法。

A.中性洗涤纤维NDF测定

称取中药药渣1g(Z)，装入索式提取装置中。250mL圆底烧瓶中加入90mL95％乙醇，组合索氏提取器后水浴锅加热，95℃提取2h。取出后60℃烘干至恒重(Z1)。

计算公式如下：NDF％＝Z1/Z×100％

Z：样品重量(g)

Z1：烘干后重量

B.纤维素含量测定

于100mL锥形瓶中，加入索氏提取后干燥的中药药渣样品0.5g(X)，50mL洗漆剂、消泡剂，100℃加热处理1h。漏斗抽滤并用热蒸馏水洗涤，丙酮浸泡10min后抽干。样品在105℃条件下干燥过夜称重(X1)。之后加入适量72％硫酸溶液，搅拌使之与样品混合充分，在30℃水浴1h。结束后漏斗抽滤并充分水洗，在105℃条件下干燥过夜并称重(X2)。

计算公式如下：

纤维素％＝(X1-X2)/X×NDF×100％

X：洗涤前样品重量(g)

X1:洗涤后样品重量(g)

X2:72％l硫酸处理后重量(g)

C:酸不溶木质素的测定

于100mL锥形瓶中，加入索氏提取后干燥的中药药渣样品0.3g(B)，适量72％硫酸溶液，搅拌使硫酸与样品混合充分，在30℃的水浴条件下放置1h。结束后漏斗抽滤并充分水洗，在105℃条件下干燥过夜并称重(B1)。之后将剩余物放入马弗炉中550℃处理2h。

计算公式如下：

酸不溶木质素％＝(B1-B2)/B×NDF×100％

B：样品重量(g)

B1:72％处理后重量(g)

B2：灰分重量(g)

上述所得结果下列公式，求出同组对应的其他数据。

半纤维素％＝NDF％-纤维素％-酸不溶木质素％-灰分含量

其他非木质纤维素的成分％＝100-NDF+灰分含量

选择系数＝木质素的降解率/同组纤维素的降解率

6.木质素降解酶活性的测定

本实验测定粗酶液的酶活性。发酵周期中，间隔2天随机取出发酵组，抽滤后获得发酵液和残渣，并立即测定发酵液的酶活，发酵液即为粗酶液。实验做三组平行，未加底物的反应体系做为空白对照。

(1)LiP(木质素过氧化物酶)活性测定：

反应体系有：10mM/L藜芦醇0.1mL、(pH 4.5，50mM)酒石酸钠缓冲溶液2.7mL、20mM过氧化氢溶液0.1mL、粗酶液0.1mL。通过加入过氧化氢溶液启动反应，反应2min后，紫外测定310nm波长下的吸光度的变化。此实验条件下，一个酶活力单位(IU/mL)等于单位时间内产生1.0moL藜芦醛。计算公式为：

V₁-反应体系总体积

V₂-样品加入体积

V-体系中粗酶液体积(mL)

N-粗酶液稀释倍数

t-反应时间

ε-为摩尔消光系数，ε310＝9.3×10³M^-1cm^-1

(2)MnP(锰过氧化物酶)活性测定：

反应体系包括1.6mM/L MnSO4溶液0.2mL(pH 4.5,50mM)乳酸-乳酸钠缓冲溶液3.5mL、粗酶液0.4mL、3.2mM/L H2O2溶液。在30℃下加入过氧化氢溶液启动整个反应。反应3min后，在240nm波长下测定生成的Mn3+－酒石酸酯复合物吸光度。此实验条件下，一个酶活力单位(IU/mL)等于单位时间内产生1.0umoLMn³⁺。计算公式同上，其中本摩尔消光系数为§240＝6.5×10³M-¹cm-¹。

(3)Laccase(漆酶)活性测定：

反应体系由0.5mM/LABTS溶液、(pH 5.0,50mM)醋酸-醋酸钠缓冲溶液2.7mL和粗酶液0.1mL。在30℃下恒温反应2min后，在420nm波长下测定吸光度。此实验条件下，一个酶活力单位(IU/mL)等于单位时间内产生1.0pmol ABTS的所需酶量,其算法同上，其中本摩尔消光系数为§420＝3.6×10⁴M-¹cm-¹。

(4)纤维素降解酶活性测定

分别采用苯酚硫酸铵法测定还原糖含量，FPase酶活测定葡萄糖含量，CMCase活性测定及β-Glucasidase活性测定

7.糖化实验

发酵周期内，2天为间隔，随机取出发酵组，抽滤后获得发酵液和中药药渣残渣。残渣经40目分选筛与菌丝体分离后，用400目分选筛全部收集并抽滤，60℃烘干至恒重。各组精确称量1g中药药渣样品放入100mL锥形瓶中，按20FPU/g的量添加CMC纯酶，加入1.0mL(pH5.0.50mM)醋酸-醋酸钠缓冲液，0.003％四环素作为抑菌剂。糖化酶解的参数：摇床150r/min，60℃。设计糖化实验周期内的动态测定时间点：3h,6h,9h,12h,24h,36h,48h，随机得収出3组，迅速冷却并测定还原糖量，测定方法同上。

糖化率％＝还原糖总量×0.9/(底物屮半纤维素和纤维素总量)×100％

二、结果：

1.氮源优化组降解结果

运用改良版VanSeast分析方法，对桦褐孔菌液体发酵中药药渣进行检测。降解率和选择系数的变化分别为：发酵处理8天后，(NH4)2SO4组的木质素降解率为42.58％，纤维素降解率45.17％；尿素组纤维素降解率46.23％，木质素降解率低于(NH4)2SO44组，为28.30％。牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物为氮源的发酵组，木质素降解率(28.85％,25.76％,23.07％)明显低于尿素和(NH4)2SO4组，纤维素降解率(51.89％，52,34％,55,84％)则高于前两组。

选择系数是木质素降解率与纤维素降解率的比值。木质素降解率高、纤维素降解率低的(NH4)2SO4组，选择系数最高0.87。三组有机氮源的选择系数低于两组无机氮源。最适宜做选择性降解木质素的氮源定为(NH4)₂SO4。

2.中药药渣添加量对选择系数的影响比较

以优化后的(NH4)₂SO₄做氮源，对中药药渣在培养基中的添加量进行实验优化。结果表明10％的添加量组的选择系数为1.1。但各组之间降解情况差距不显著，5％组的选择系数为0.8，另3组均在0.95以上。与氮源优化组比较，也可明显发现，中药药渣添加量的改变对选择系数和降解率的影响小于氮源种类的变化。

(NH4)₂SO₄与4％添加量同时优化的实验组，选择系数为1.1，高于(NH4)₂SO₄与3％添加量的对照组，后者选择系数为0.89。体现了优化这两个单因子的可行性，两因子之间有一定的协同作用。

3.Plackett-Burman实验

此实验设计中，通过比较整体差异与各因子高低水平的差异来挑出对选择系数影响显著的因子。本试验选择玉米粉、MgSO4.7H2O、MnCl2、(NH4)₂SO₄、KH2PO₄、pH、Tween80、温度、接种量等十个因子，每个因子取高(1)低(-1)两水平。

4.最终工艺

以单因子法和响应面法的联合运用为核心，以桦褐孔菌降解中药药渣的选择系数为优化指标，进行了液体深层发酵桦褐孔菌降解中药渣的优化实验。单因子优化确定氮源和底物添加量后，从玉米粉、Tween80、温度、接种量、MnCl2、(NH4)₂SO₄、KH2PO4、MgSO4.7H2O、pH等十个因素中，筛选出(NH4)₂SO₄、Tween80、pH三个重要的影响因子，得出如下结论：

1.最佳氮源：(NH4)₂SO₄，最佳添加量0.22％。无机氮源对选择系数的促进作用优于有机氮源；培养条件对选择系数的促进具有协同作用。

2.影响因子：在液体发酵周期内，温度、接种量、玉米粉、MnCl2、中药药渣、MgSO4.7H2O、等基础条件不变，减少(NH4)₂SO₄、Tween80、KH2PO4的添加量，降低培养基pH，可提高降解中药药渣的选择系数。

3.最优培养条件：液体深层发酵桦褐孔菌降解中药药渣的最佳培养条件是：玉米粉(水解)3.0g，(NH4)₂SO₄ 0.222g，CoCL₂·6H₂O 0.002g，FeSO₄·7H₂O0.005g,KH₂PO₄0.004g,MgSO₄·7H₂O 0.02g,ZnSO₄·7H₂O 0.001g,MnCl₂·4H₂O0.009g,CaCl₂ 0.05g,Tween80 0.43mL，用蒸馏水定容至100mL，pH值调至4.3。加入中药药渣4g，接种3mL种子培养基。

4.桦褐孔菌降解中药药渣的选择系数为1.23，优化前的选择系数为0.63，优化后较优化前选择系数增长了95.23％。

5.中药药渣渣的动态降解情况

5.1各成分含量的动态变化情况

对60-120目未处理的中药药渣进行成分含量的测定，得到表1中数据：

表1未处理中药药渣中木质纤维素组成

随着发酵处理天数的延长，木质素、纤维素和半纤维素的含量都出现减少，中药药渣的重量损失升高。发酵第2天，相较于空白对照组，重量损失增加17.21％，木质素减小21.7％，纤维素减少15.3％，半纤维素减少9.1％，其他成分减少44.7％，表明桦褐孔菌对中药药渣的高效降解作用。至发酵第6天，中药药渣整体损失率达到26.13％，木质素、纤维素和半纤维素的含量明显减少，较对照组分别减少了29.4％、24.2％和19.7％。其中，木质素的减少速率明显高于纤维素和半纤维素，体现出了桦褐孔菌在此培养条件下对木质素的选择性降解。发酵第8天为转折点，之后木质素和纤维素的含量保持稳定，半纤维素的含量则继续减少。发酵第14天，半纤维素较对照组减少35.3％。推测，在此培养条件下，木质素和纤维素降解酶的高酶活在0-8天，8-14天半纤维素降解酶成为优势酶，半纤维素降解量增加。以保留纤维素和半纤维素为目的提高糖化产糖量，此培养条件下建议发酵周期为6-7天。

5.2木质素降解酶的作用：木质纤维素降解酶的活性均呈现先高后低、略有浮动的酶活。其中，降解木质素的Lac、LiP、MnP三个酶的酶活明显高于纤维素降解酶FPA，CMC酶和β-葡萄糖苷酶，体现了降解的选择性。在发酵第6天，MnP最大达到317.9IU/mL。

5.3预处理有效促进酶解糖化效率：发酵处理2天的中药药渣在酶解12h后总还原糖量达到最大265.82mg/g，产糖率也在此时达到29.61％，均高于同期其他三组。显示出预处理较短时间即可达到较好效果的优势。

5.4产糖量与木质素选择降解系数呈正相关：选择系数3.35、1.75、1.27的三组中药药渣，酶解12h后产糖率依次为264.82、252.75、251.75、108.27mg/g。降低总还原糖产量是由纤维素和半纤维素的含量之和来决定，突出了选择性降解木质素、保留纤维素和半纤维素的意义。

实施例2

菌种的活化、培养及保存

1、材料

1.1标准菌种

1.1.1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC01185。

1.1.2酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC20042。

1.2培养基

1.2.1枯草芽孢杆菌用培养基

1.2.1.1斜面或平板固体培养基

普通营养肉汤培养基配制：蛋白胨1g、牛肉提取物0.3g、NaCl 0.5g、琼脂2.0g、蒸馏水100mL，调pH至7.0，在121℃条件下灭菌20min。

1.2.1.2液体种子培养基配制：

葡萄糖0.2g、NaCl 0.5g、酵母膏0.5g、蛋白胨1g，蒸馏水100mL，调pH至7.0。液体种子培养基每250mL三角锥瓶装量50mL，在121℃条件下灭菌20min。

1.2.2酿酒酵母菌用培养基

1.2.2.1斜面或平板固体培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD培养基)配制：酵母膏1.0g，蛋白胨2.0g，葡萄糖2.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100mL，调pH至7.0，在121℃条件下灭菌20min(注意：葡萄糖溶液过滤灭菌或115℃灭菌15min后加入)。

1.2.2.2液体种子培养基

麦芽汁培养基配制：10°波美度麦芽汁1L，pH约为6.4，琼脂20.0g，115℃灭菌15min。

2、仪器与耗材

2.1仪器

分析天平、恒温振荡器、生化培养箱、漩涡混合器、电热恒温干燥箱、高压灭菌器、超净工作台。

2.2耗材

无菌三角烧瓶、无菌刻度管、无菌培养皿、玻璃珠和磁力搅拌棒、玻璃或塑料涂布棒(无菌玻璃刮刀)、微量加样器(200μL和1000μL)和枪头。

3、方法

3.1标准菌种的活化培养

3.1.1枯草芽孢杆菌活化培养

菌种冻干管用75％酒精擦拭管壁，后用砂轮在冻干管壁划两圈，掰断，用200μL无菌水或培养基充分溶解，涂布固体培养基平板，37℃活化培养。

固体培养基管口用75％酒精擦拭后，火焰灼烧，后用无菌接种铲切块，挑取接入斜面固体培养基，37℃培养。斜面试管菌种保藏于2-8℃冷藏。

3.1.2酿酒酵母菌活化培养

菌种冻干管用75％酒精擦拭管壁，后用砂轮在冻干管壁划两圈，掰断，用200μL无菌水或培养基充分溶解，涂布酿酒酵母菌用固体培养基平板，28℃活化培养。

固体培养基管口用75％酒精擦拭后，火焰灼烧，后用无菌接种铲切块，挑取接入酿酒酵母菌用斜面固体培养基，28℃培养，斜面试管菌种保藏于2-8℃冷藏。

3.2液体种子培养

3.2.1枯草芽孢杆菌液体种子培养

从斜面接一环菌苔至液体种子培养基，置37℃恒温振荡器培养，转速220r/min，培养24h，活菌量密度≥2.5×10¹⁰cfu/mL，即为枯草芽孢杆菌种子液。

3.2.2酿酒酵母菌液体种子培养

从斜面接一环菌苔至液体种子培养基，置28℃恒温振荡器培养，转速160r/min，培养24-28h，活菌量密度≥5×10⁸cfu/mL即为酿酒酵母菌种子液。

4、结果

4.1标准菌种平板培养结果

4.1.1枯草芽孢杆菌普通肉汤固体培养基培养结果

枯草芽孢杆菌在普通肉汤固体培养基，37℃恒温培养箱培养24h后，可见明显菌落，菌落为扁平、边缘不整齐、表面粗糙皱缩，污白或微黄色，菌体细胞呈杆状，单个、很少成连，见图1。

4.1.2酿酒酵母菌YPD固体培养基培养结果

酿酒酵母菌在YPD固体培养基培养，28℃恒温培养箱培养24-48h后，可见明显菌落，菌落为乳白色，平滑，有或无光泽，边缘整齐或菌丝状，见图2。

4.2标准菌种培养物染色结果

4.2.1枯草芽孢杆菌革兰氏染色和孔雀石绿-番红芽孢染色

枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，革兰氏染色为紫色，杆状形态，见图3；孔雀石绿-番红芽孢染色结果可见芽孢呈绿色椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，见图4。

4.2.2酿酒酵母菌美兰染色结果

酿酒酵母菌经美兰染色液染色后，活细胞不着色，死细胞呈蓝色，见图5。

5小结

通过对枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌进行菌落形态学观察和染色镜检，表明标准菌株进行的活化培养是成功的。

实施例3

1、材料

1.1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC01185。

1.2酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC20042。

2、发酵工艺优化

在实施例1发酵预处理的液体发酵培养基中按3g/L比例补加(NH₄)₂SO₄，将液体发酵培养基的pH调节至7.0，然后将实施例2活化后的枯草芽孢杆菌ACCC01185和酿酒酵母菌ACCC20042一次性接入，继续发酵培养，得到所述生物活性肽。利用正交试验原理优化影响发酵过程的各因素条件。对发酵产品中的总蛋白、小肽、有机酸等进行检测，最后得出多菌分步发酵中药药渣产生物多肽的最佳工艺。

3、方法

3.1总蛋白含量的测定

总蛋白含量的测定采用国家标准GB/T6432-1994的凯氏定氮法，如下：

(1)试剂

①质量浓度40％氢氧化钠：称取分析纯氢氧化钠800.0g用蒸馏水定容至2000mL。

②0.01mol/L盐酸标准溶液标定：量取0.9mL盐酸，缓慢注入1 000mL水。精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的无水碳酸钠0.247g加入新煮沸冷却后的蒸馏水5 000mL定容。用溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，进行滴定标定盐酸浓度。

③溴甲酚绿-甲基红混合液为指示剂。

(2)仪器

①100mL消化管和2000W消化炉。

②k05A自动定氮仪。

③100mL酸式滴定管。

(3)测量操作

①样品处理：精密称取2.0g发酵产品样品移入干燥的100mL消化管中，加入0.2g硫酸铜，6.0g硫酸钾及20.0mL浓硫酸，于300℃消化炉中将内容物全部炭化至液体呈绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

②将消化好的样品移到k05A自动定氮仪上进行蒸馏操作至消化管中溶液变为黑色止。

③以标定摩尔浓度的标准盐酸溶液对蒸馏好的消化管中的蒸馏液进行滴定，以溴甲酚绿-甲基红混合液为指示剂进行滴定标示。

(4)计算

式中X：样品中蛋白质的百分含量，％；

V₂：样品消耗盐酸标准溶液的体积，mL；

V₁：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；

C：盐酸标准溶液的浓度，mol/L；

V＇：样品分解液蒸馏用体积，mL；

V：样品分解液总体积，mL；

0.014：与1mL盐酸标准溶液相当的，以克数表示的氮的质量；

m：样品的质量，g；

6.25：氮换算成总蛋白的系数。

3.2小肽含量的测定方法

小肽含量的测定方法为国家饲料大豆肽粉标准QB/T2653-2004，如下：

(1)试剂及仪器

①100mL烧杯

②10mL、50mL移液管

③干过滤装置

④k05A自动定氮仪

⑤15％三氯乙酸溶液

⑥4000r/min离心机

(2)测定操作

准确称取发酵产品6.0g于100mL烧杯中，准确加入15％三氯乙酸溶液50mL，混合均匀，静置5min，过滤，弃去少许初始溶液，将滤液转移至离心管，在4 000r/min下离心10min，准确称取其上清液10mL于消化管中进行消化，其余操作跟标准GB/T6432-1994中总蛋白测定一样。

(3)结果与计算：

式中V₁：馏出液消耗盐酸标准溶液的体积，mL；

V₀：空白试验消耗盐酸标准溶液的体积，mL；

C：盐酸的摩尔浓度，mol/L；

6.25×0.014：蛋白质转换系数；

m：样品的质量，g。

3.3有机酸含量的测定

3.3.1有机酸含量的测定方法

取发酵样品鲜15.0g置于150mL烧杯中加入100mL去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min，3000r/min离心10min，吸取上清液15.0mL，然后加30.0mL去离子水和2-3滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH标准溶液测定，滴定到溶液呈现粉红，记录消耗NaOH体积。

计算公式：

式中N：NaOH标准溶液的浓度；

V：消耗NaOH标准溶液体积；

0.9008：盐酸的毫克当量。

3.4发酵菌种生长曲线的测定

微生物培养过程中的生长曲线一般分为迟滞期、对数期、恒定期、衰亡期。在进行接种试验时一般是将菌种的液体培养的生长对数期中期的菌液接入到发酵基中，所以十分必要对发酵菌种的生长曲线进行研究。

3.4.1枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

用稀释平板分离菌落计数法对枯草芽孢杆菌的液体培养液进行活菌计数，反应出枯草芽孢杆菌培养液中枯草芽孢杆菌的生长趋势，确定其生长曲线。操作步骤如下：

(1)菌液稀释：将枯草芽孢杆菌从斜面上接种到营养肉汤液体培养基中进行37℃条件下菌液培养。0h开始每隔2h直到30h止，从培养液中吸取1mL菌液移入装有9mL的试管中，震荡均匀，此为原菌液的10^-1稀释菌液，以此类推制备成10^-2～10^-9不等的几种稀释枯草芽孢杆菌液。

(2)平板培养：将每个时间段取样的稀释液中的10^-5、10^-6和10^-7稀释梯度液进行涂板，每个稀释梯度涂布3个平行平板，标记，置于37℃培养箱中进行培养。

(3)计数：取出平板，算出同一取样时间的稀释菌液涂布平板上菌落平均数。技术精确，避免重复。在这3个平行稀释梯度中，要求按30～300个菌落/皿的稀释度来正式计数，如这3个稀释度均不能满足，则应将相应稀释梯度前后移动。

式中n：代表统计平板中菌落个数

M：代表菌液在原液的基础上的稀释倍数；

K：代表滴加在平板上稀释液的体积(mL)。

3.5.2酿酒酵母菌生长曲线的测定

由于酿酒酵母菌细胞大，沉降速度快，如果用光电比色计测定菌悬液的光密度(OD值)来推知菌液的浓度就不易准确。因此，本实验对酿酒酵母进行生长曲线的确定时，采用血球计数法在显微镜下直接计数来测定液体培养酿酒酵母菌时菌数增长数。

操作方法如下：

配制100mL麦芽汁液体种子培养基，装到1个150mL三角烧瓶中，灭菌后从斜面试管中接入酿酒酵母菌，于28℃恒温培养箱中静置培养12h。配制300mL麦芽汁液体种子培养基，分装到3个250mL三角烧瓶中，每瓶100mL；灭菌后加入麦芽汁液体种子培养基，接种量2％(V/V)，于28℃恒温培养箱中静置培养。从接入酿酒酵母菌到液体培养基中开始每到0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、32h、34h和36h时分别取样1mL。通过血球计数法计数，每个样做3个平行实验。

器具：

血球计数板、无菌水、无菌试管、玻璃棒、无菌吸管、显微镜。

操作步骤：

(1)将原菌液稀释50倍，取0.5mL稀释菌液入无菌试管内，吸取0.5mL美兰染色液内混合均匀。

(2)取清洁干净的血球计数板，加盖玻片于中央，用无菌玻璃棒沾取染色菌液于盖片周围，依靠毛细管作用吸入菌液，注意不能产生气泡。

(3)静止5min，让菌细胞沉于计算器内，开始计数。

(4)随机计数5个中格，求得每中格平均数后代入公式，稀释度为100可求出细胞总数。

(5)清洗：计数后用水冲洗去计数区菌液，让其自行晾干。

式中A：5个计数板上的中方格子中的总菌数。

B：菌液稀释倍数。

25：25个中方格子的计数板。

10⁴：计数室的容积为0.1mm³(10^-4mL)。

4、结果

4.1菌悬液的生长对数中期的确定

4.1.1枯草芽孢杆菌生长曲线的绘制

以培养时间为横坐标，枯草芽孢杆菌菌数为纵坐标绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线，见图6。

从该生长曲线可以得出，在培养周期时间为30h的条件下，枯草芽孢杆菌在37℃液体培养条件下的生长对数中期为该菌菌悬液培养时间20h处。

4.1.2酿酒酵母菌生长曲线的绘制

以培养时间为横坐标，酿酒酵母菌菌数为纵坐标绘制酿酒酵母菌的生长曲线，见图7。

从该生长曲线可以得出，在培养周期时间为36h的条件下，枯草芽孢杆菌在28℃液体培养条件下的生长对数中期为该菌菌悬液培养时间12h处。

4.2混合菌发酵产品的研究

4.2.1最佳发酵条件的确定

发酵起始pH为自然，枯草芽孢杆菌ACCC01185和酿酒酵母菌ACCC20042接入质量配比(A)、接种量(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)和料水比(E)为影响发酵产品品质的主要因素。

表4发酵条件正交试验的因素与水平

注：枯草、酵母配比为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌质量配比

表5发酵条件正交试验结果分析

根据单因素试验确定各因素的4个水平，以发酵产品中小肽的含量作为标准量(发酵前为1.7％左右)，通过L₁₆(4⁵)正交试验筛选出最佳的发酵条件。因素与水平见表4，试验结果及方差分析见表5。

正交试验中极差的大小，反映了该因素对实验指标的影响大小和重要性。由表5可知，因素对衡量指标(小肽占总质量比)的影响按大小次序为D＞C＞B＞A，即有发酵温度对混合菌发酵的影响最大，适合的发酵温度极大的促进了菌种的代谢活动，在该温度下，菌种之间相互协调发酵的能力加强，发酵产品的各项检测指标最为理想；其次对发酵产品的品质影响最大的是发酵时间。产品的发酵过程中，由于菌种在发酵前期还处于发酵调整阶段，因此小肽和总蛋白的质量含量值在发酵过程中是一个增长的过程，但随着发酵持续到96h后，继续发酵的产品中小肽和总蛋白的质量含量却并没有明显增加，因此根据试验结果和产品发酵的经济性和实用性，将产品发酵96h定为最佳发酵时间；接种量是影响发酵产品的第三大因素。2种菌种的接种质量比是影响试验的第四大因素。

该正交表中均值的大小反映了该因素某个水平对实验指标的平均“贡献”大小。在本实验中指标越大越好，因此在同一因子下均值越大的水平越优，得出最佳方案为A₂B₂C₃D₃，枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母菌＝1∶2，接种量为4.0g/100g，发酵温度为30℃，发酵时间为96h。

4.2.2最佳条件下发酵的产品品质分析

在最佳发酵条件下，发酵前后营养的变化情况见图8。

从图8可以看出，发酵前后的产品中总蛋白含量在原料的基础上提高了10.5％达到33.8％；发酵后小肽的含量是发酵前的7.02倍达到23.6％；有机酸含量达到3.27％，从而可以提高动物消化道的酸度，一直消化道有害微生物的活动。促进营养物质的消化吸收。

5、小结

5.1多菌分步法发酵中影响发酵结果的主次因素是：

发酵温度＞发酵时间＞菌种接入量＞菌种混合接种质量比。

5.2通过正交试验最终确定发酵的最佳条件为枯草芽孢杆菌∶酿酒酵母菌＝1∶2，接种量为4.0g/100g，发酵温度为30℃，发酵时间为96h。

5.3以发酵产品中小肽质量含量为正交试验的标准量，多次重复试验得出发酵的最佳工艺数据，其发酵时间短、操作性简便和经济性好。

实施例4

一、多菌分步法发酵产品对断奶仔猪采食量、生长性能和腹泻率的影响

通过多菌分步法发酵制备发酵产品，该产品中含有丰富的小肽、氨基酸等易于机体吸收的营养物质，将其应用于临床，替代动物性蛋白(鱼粉或骨粉)，能有效改善饲料适口性、提高采食量、提高饲料转化率和日增重、降低仔猪腹泻率。

1、材料

发酵样品为实施例3中最佳工艺制备的产品，动物试验在吉林长春某猪场进行，选用体重均匀一致的健康杜长大断奶仔猪(7.44±0.29kg)。

2、方法

2.1试验设计与动物饲养管理

选用体重均匀一致的健康杜长大断奶仔猪(7.44±0.29kg)，分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复7头。试对照组饲喂普通乳猪饲料，试验组在对照组的基础上分别添加6.0kg/t、8.0kg/t和10.0kg/t的发酵样品，试验安排见表6。普通乳猪饲料配方参照NRC(1998)仔猪的营养需要设计和配制，日粮组成及营养水平见表7，饲料制成颗粒饲料。

表6仔猪试验设计

2.2发酵产品对断奶仔猪生长性能的影响

各组猪自由采食。验时间为42天。每周测定一次，包括：平均日增重、平均日采食量、料肉比。

2.3发酵产品对断奶仔猪腹泻的影响

腹泻指数是腹泻头次乘以相应的腹泻得分，腹泻得分标准参考表8。腹泻率为试验期间腹泻的仔猪总头次除以每天的仔猪总头数乘以试验天数。数据采用SPSS11.5软件中的方差分析比较不同处理的数据。

表7日粮组成及营养成分含量(％)

注：1.粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、钙和磷为计算值(根据《中国饲料成分及营养价值表(2009年版)》)。

注：2.每公斤日粮提供：维生素A，11 000IU；维生素D₃，2 305IU；维生素E，34.1IU；维生素K，2.3mg；硫胺素，5.77mg；核黄素，6.22mg；维生素B6，9.45mg；泛酸，20.0mg；烟酸，37.0mg；叶酸，0.70mg；维生素B₁₂，0.21mg；胆碱，350mg；锰，55.0mg；铁，120.0mg；锌，90.0mg；铜，116.5mg；碘，0.40mg；硒，0.30mg；钴，0.70mg。

表8腹泻评分标准

2.2试验时间

2016年8月25日-10月6日。

3、结果与分析

3.1发酵产品对断奶仔猪生长性能的影响

表9发酵产品对断奶仔猪生长性能的影响

注：数字肩标大写字母表示差异极显著(P<0.01)，数字肩标小写字母表示差异显著(P<0.05)。

从表9可见，试验前3周，仔猪日增重、日采食量提高，差异极显著(P<0.01)，而料肉比没有显著差异(P＞0.05)。第4周三个试验组的日增重、日采食量、料肉比均显著高于对照组(P<0.05)。第5周三个试验组的日增重、日采食量显著高于对照组(P<0.05)，试验一组料肉比显著低于对照组和试验二组。试验全期试验组平均日增重、平均日采食量极显著地高于对照组(P<0.01)，料肉比无显著差异(P＞0.05)。

以上说明，添加发酵产品能提高断奶仔猪的采食量，进而提高其日增重。

发酵产品中富含核苷酸、游离氨基酸(20种)、有机酸等风味物质，这些物质具有良好的诱食效果，能改善饲料适口性，提高仔猪的采食量。同时产品中含有一定的酵母菌及其培养物，富含菌体蛋白、B族维生素、有机微量元素，是胃肠道内有益菌优良的培养基，能使胃肠道内的有益菌迅速生长，产生大量有助于消化吸收的酶，提高饲料吸收利用率，降低料肉比。

3.2发酵产品对断奶仔猪腹泻的影响

表10发酵产品对断奶仔猪腹泻的影响

注：数字肩标大写字母表示差异极显著(P<0.01)，数字肩标小写字母表示差异显著(P<0.05)。

从表10可见，试验一组腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，试验二、三组腹泻率极显著地低于对照组(P<0.01)，显著低于试验一组(P<0.05)。

试验一组腹泻指数显著低于对照组(P<0.05)，试验二、三组腹组腹泻指数极显著地低于对照组(P<0.01)，显著低于试验一组(P<0.05)。

4、结论

从试验第3周开始添加发酵产品对仔猪的生长性能产生影响，能有效降低仔猪的腹泻发病率，提高采食量和料肉比。

综合考虑仔猪的生长性能、腹泻和饲料成本，在仔猪日粮中此发酵产品的添加量最佳为8.0kg/t。

二、多菌分步法发酵产品对育肥猪增重效果的影响

通过多菌分步法发酵制备发酵产品，该产品中含有丰富的小肽、氨基酸等易于机体吸收的营养物质，将其应用于临床，替代动物性蛋白(鱼粉或骨粉)，能有效改善饲料适口性、提高饲料转化率、提高育肥猪出栏重。

1、材料

发酵样品为本研究制备的产品，动物试验在吉林长春某猪场进行，体重110斤左右，日龄相近的杜×长×大三元商品健康的育肥猪40头。

2、方法

2.1试验设计与动物饲养管理

选择该场体重110斤左右，日龄相近的杜×长×大三元商品健康的育肥猪40头，随机分成4组，每组10头。组间供试猪初始体重差异不显著。试验时间为60天。试验饲粮分为2个处理，对照组和产品组，见表11，对照组添加基础日粮，产品组在对照组的基础上添加适量的实验室制备的发酵产品。基础日粮组成及营养成分如表12所示，基础日粮营养水平参照中国猪饲养标准(2004)。通过60天的试验期，测定养殖场使用发酵产品后，育肥猪增重效果。

表11育肥猪试验设计

表12日粮组成及营养成分含量(％)

2.试验时间

2016年10月8日～12月6日。

3、结果

在养殖场使用发酵产品后，育肥猪增重效果，见表13。通过60天的试验期，实验组比对照组平均多增重6.5±2.1kg。

表13育肥猪增重效果

4、结论

在育肥猪日常饲粮中添加实施例3制备的发酵产品，通过60天的试验期，实验组与对照组相比，增重较明显，因为在发酵产品中含有丰富的小肽、有机酸、必需氨基酸等小分子物质，机体更易于吸收，且发酵产品中含有易于肠道有益菌增殖的有益物质(如菌多糖、核苷酸等)，促进肠道对营养物质的消化吸收，有效提高动物机体对饲料的利用率，提高料肉比，增加养殖户的经济效益。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。