阅读说明：本技术 一种制备生防芽胞杆菌次级代谢产物表面活性素的方法 (Method for preparing secondary metabolite surfactant of biocontrol bacillus ) 是由 田涛 孙冰冰 石皓文 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种制备生防芽胞杆菌次级代谢产物表面活性素(Surfactins)的方法,它包括：平板诱导、LBS平板诱导、溶剂抽提、HPLC检测等步骤。本发明所采用的生防芽孢杆菌株为TB1501,CGMCC No.16069。本发明的方法通过蔗糖诱导的次级代谢产物表面活性素产量增加,生防菌的防效显著提高,特别是番茄灰霉病菌生测结果表明,添加蔗糖后,生放菌防治灰霉病菌的防效显著提高,结合蔗糖诱导后生放菌产表面活性素增加的现象,推测蔗糖诱导的生放菌防治灰霉病菌的增效作用依赖于表面活性素产量的增加。(The invention discloses a method for preparing secondary metabolite surfactant (surfactin) of biocontrol bacillus, which comprises the following steps: plate induction, LBS plate induction, solvent extraction, HPLC detection and the like. The biocontrol bacillus strain adopted by the invention is TB1501, CGMCC No. 16069. According to the method, the yield of the surface active element of the secondary metabolite induced by the sucrose is increased, the control effect of the biocontrol bacteria is obviously improved, particularly, the tomato botrytis cinerea bioassay result shows that the control effect of the biocontrol bacteria on the botrytis cinerea is obviously improved after the sucrose is added, and the synergism of the biocontrol bacteria on the botrytis cinerea induced by the sucrose is presumed to depend on the increase of the yield of the surface active element by combining the phenomenon that the production of the surface active element of the biocontrol bacteria is increased after the sucrose is induced.)

一种制备生防芽胞杆菌次级代谢产物表面活性素的方法

技术领域

本发明属于生防芽胞杆菌次级代谢产物代谢调控技术领域，涉及一种制备贝莱斯芽孢杆菌TB1501次级代谢产物表面活性素（Surfactins）的方法。

背景技术

芽胞杆菌具有抗逆性强，繁殖快，在植物根际定殖能力强的特定，是微生物杀菌剂的重要来源，目前，枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌以及蜡样芽胞杆菌等是我国微生物杀菌剂的主要来源。其生防机制主要表现在拮抗、营养和生态位点竞争、诱导植物抗病性等方面。现有研究表明：芽胞杆菌产生的脂肽类抗生素以及抗菌蛋白等活性物质是其抑制植物病原真菌，起到生防效果的关键因素。脂肽类抗生素主要包括表面活性素（Surfactins），伊枯草菌素家族（Iturinfamily： Iturins, Bacillomycins andmycosubtilins），芬枯草菌素（Fengycins）。其中，表面活性素（Surfactins）是已发现的最强的一类生物表面活性剂，是生防菌定殖和生防效果的重要影响因素。目前表面活性素的制备方法主要采用液体发酵的方式，其缺点在于时间长，成本高，次级代谢产物产量低，在生放菌的实际应用中效果不显著，因此，高效制备Surfactins对增强生防菌定殖和生防效果具有重要的意义。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种制备生防芽胞杆菌次级代谢产物表面活性素（Surfactins）的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）平板诱导：

发酵液制备：取一环不同的芽孢杆菌株（TB1501 ，CGMCC No. 16069）接种到盛有5毫升液体LB培养基的试管中，37℃，150rpm，过夜摇培即得TB1501发酵液；所述的LB培养基为：NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L；所述的发酵液包括：芽孢杆菌TB1501；

（2）LBS平板诱导：

将TB1501发酵液稀释1000倍，吸取1.5 μl，垂直点在LBS平板中央，37℃，过夜倒置培养；所述的LBS平板指的是：NaCl 5g/L胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L，蔗糖5g/L，琼脂粉15g/L；

（3）溶剂抽提：

刮取平板上的菌落，用无菌水重悬，将重悬液12000rpm，离心20min，弃去沉淀，保留上清液，用6mol/L HCl调节上清液的PH值为2.0，4℃过夜沉淀，12000rpm，离心20min，弃上清保留沉淀；再用甲醇搅拌萃取3次并用NaOH调节PH值为7.0，每100 mL重悬液用6-10mL甲醇，12000rpm，离心20min，上清液于40℃旋转蒸发获得脂肽类抗生素粗提物；

（4）HPLC检测：

检测波长为210nm，柱温为30℃；采用等梯度洗脱进行样品分析，所用流动相A为乙腈（0.1%三氟乙酸），流动相B为0.1%三氟乙酸(v/v)，表面活性素（Surfactins）分析流动相比例为A:B=70:30(v/v)，流速为1.0mL/min；进样量为10μl，Surfactin标样：1.8mg/mL。

本发明进一步公开了制备贝莱斯芽孢杆菌次级代谢产物表面活性素在增加表面活性素（Surfactins）产量方面的应用，特别是在防治番茄灰霉病菌方面效果显著。实验结果显示蔗糖诱导条件下，贝莱斯芽孢杆菌次级代谢产物表面活性素产量增加且防治灰霉病菌的防效显著提高。结合蔗糖诱导后生放菌产表面活性素增加的现象，推测蔗糖诱导的生放菌防治灰霉病菌的增效作用依赖于表面活性素产量的增加。

本发明主要解决了怎样提高贝莱斯芽孢杆菌次级代谢产物表面活性素产量的问题，重点考察了蔗糖诱导条件下贝莱斯芽孢杆菌次级代谢产物表面活性素产量增加，主要的难点在于诱导条件的筛选。

本发明公开的制备生防芽胞杆菌次级代谢产物表面活性素（Surfactins）的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）实验室条件下，平板诱导实验相比液体发酵的时间短。

(2) 蔗糖作为一种价廉且容易获得的原料，一定程度上降低了实验成本。

(3）通过蔗糖诱导的次级代谢产物表面活性素产量增加，生防菌的防效显著提高。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中芽孢杆菌TB1501 CGMCCNo. 16069、枯草芽孢杆菌NCIB 3610（美国典型生物资源保藏中心ATCC）、TB1340（由天津市植物保护研究所植物病害生物防治研究室分离得到并保存，可免费提供仅作基础研究）。

实施例1

高效制备贝莱斯芽孢杆菌TB1501次级代谢产物surfactins

（1）平板诱导：设置两个处理，LB平板诱导和LBS平板诱导

TB1501发酵液制备：取一环芽孢杆菌TB1501接种到盛有5毫升液体LB培养基（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L）的试管中，37℃，150rpm，过夜摇培即得TB1501发酵液。

LB平板诱导：将TB1501发酵液稀释1000倍，吸取1.5 μl，垂直点在LB平板（NaCl5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L，琼脂粉15g/L）中央，37℃，过夜倒置培养。

LBS平板诱导：将TB1501发酵液稀释1000倍，吸取1.5 μl，垂直点在LBS平板（NaCl5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L，蔗糖5g/L，琼脂粉15g/L）中央，37℃，过夜倒置培养。

（2）溶剂抽提：

刮取平板上的菌落，用无菌水重悬，将重悬液12000rpm，离心20min，弃去沉淀，保留上清液，用6mol/L HCl调节上清液的PH值为2.0，4℃过夜沉淀，12000rpm，离心20min，弃上清保留沉淀。再用甲醇搅拌萃取3次并用NaOH调节PH值为7.0，每100 mL重悬液用6mL甲醇，12000rpm，离心20min，上清液于40℃旋转蒸发获得脂肽类抗生素粗提物。

（3）HPLC检测：

检测波长为210nm，柱温为30℃；采用等梯度洗脱进行样品分析，所用流动相A为乙腈（0.1%三氟乙酸），流动相B为0.1%三氟乙酸(v/v)，surfactin分析流动相比例为A:B=70:30(v/v)，流速为1.0mL/min；进样量为10μl。Surfactin标样：1.8mg/mL。

TB1501 surfactin产量检测结果

经过蔗糖诱导，TB1501 surfactin产量比不经过蔗糖诱导增加了1.25倍。

实施例2：

高效制备生防枯草芽胞杆菌NCIB 3610、TB1340次级代谢产物surfactins

（1）平板诱导：设置两个处理，LB平板诱导和LBS平板诱导

菌株3610发酵液制备：取一环芽孢杆菌3610、TB1340分别接种到盛有5毫升液体LB培养基（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L）的试管中，37℃，150rpm，过夜摇培即得3610、TB1340发酵液。

LB平板诱导：将3610、TB1340发酵液稀释1000倍，吸取1.5 μl，垂直点在LB平板（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L，琼脂粉15g/L）中央，37℃，过夜倒置培养。

LBS平板诱导：将3610、TB1340发酵液稀释1000倍，吸取1.5 μl，垂直点在LBS平板（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L，蔗糖5g/L，琼脂粉15g/L）中央，37℃，过夜倒置培养。

（2）溶剂抽提：

刮取平板上的菌落，用无菌水重悬，将重悬液12000rpm，离心20min，弃去沉淀，保留上清液，用6mol/L HCl调节上清液的PH值为2.0，4℃过夜沉淀，12000rpm，离心20min，弃上清保留沉淀。再用甲醇搅拌萃取3次并用NaOH调节PH值为7.0，每100 mL重悬液用6-10mL甲醇，12000rpm，离心20min，上清液于40℃旋转蒸发获得脂肽类抗生素粗提物。

（3）HPLC检测：

检测波长为210nm，柱温为30℃；采用等梯度洗脱进行样品分析，所用流动相A为乙腈（0.1%三氟乙酸），流动相B为0.1%三氟乙酸(v/v)，surfactin分析流动相比例为A:B=70:30(v/v)，流速为1.0mL/min；进样量为10μl。Surfactin标样：1.8mg/mL。

3610 surfactin产量检测结果

经过蔗糖诱导，3610 surfactin产量比不经过蔗糖诱导增加了1.58倍，TB1340surfactin产量增加了1.56倍。

通过蔗糖诱导，生防芽胞杆菌次级代谢产物surfactin产量能增加1.5倍左右。而且蔗糖诱导增加surfactin产量的方法普遍适用于生防芽胞杆菌。

实施例3

对比试验

常规surfactin的制备：

（1）液体发酵： LB液体发酵

TB1501种子液制备：取一环芽孢杆菌TB1501接种到盛有5毫升液体LB培养基（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L）的试管中，37℃，150rpm，过夜摇培即得TB1501种子液。

扩大培养：：将TB1501种子液1/1000接种到100毫升液体LB（（NaCl 5g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏粉5g/L）培养基中，37℃，150rpm，摇培48h即得含有次级代谢产物表面活性素的TB1501发酵液。

（2）溶剂抽提：

将TB1501发酵液12000rpm，离心20min，弃去沉淀，保留上清液，用6mol/L HCl调节上清液的PH值为2.0，4℃过夜沉淀，12000rpm，离心20min，弃上清保留沉淀。再用甲醇搅拌萃取3次并用NaOH调节PH值为7.0，每100 mL重悬液用6mL甲醇，12000rpm，离心20min，上清液于40℃旋转蒸发获得脂肽类抗生素粗提物。

（3）HPLC检测：

检测波长为210nm，柱温为30℃；采用等梯度洗脱进行样品分析，所用流动相A为乙腈（0.1%三氟乙酸），流动相B为0.1%三氟乙酸(v/v)，surfactin分析流动相比例为A:B=70:30(v/v)，流速为1.0mL/min；进样量为10μl。Surfactin标样：1.8mg/mL。

本发明的的制备：

（1）LBS平板诱导：

TB1501发酵液制备：取一环芽孢杆菌TB1501接种到盛有5毫升液体LB培养基（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L）的试管中，37℃，150rpm，过夜摇培即得TB1501发酵液。

LBS平板诱导：将TB1501发酵液稀释1000倍，吸取1.5 μl，垂直点在LBS平板（NaCl5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L，蔗糖5g/L，琼脂粉15g/L）中央，37℃，过夜倒置培养。

（2）溶剂抽提：

刮取平板上的菌落，用无菌水重悬，将重悬液12000rpm，离心20min，弃去沉淀，保留上清液，用6mol/L HCl调节上清液的PH值为2.0，4℃过夜沉淀，12000rpm，离心20min，弃上清保留沉淀。再用甲醇搅拌萃取3次并用NaOH调节PH值为7.0，每100 mL重悬液用6mL甲醇，12000rpm，离心20min，上清液于40℃旋转蒸发获得脂肽类抗生素粗提物。

（3）HPLC检测：

检测波长为210nm，柱温为30℃；采用等梯度洗脱进行样品分析，所用流动相A为乙腈（0.1%三氟乙酸），流动相B为0.1%三氟乙酸(v/v)，surfactin分析流动相比例为A:B=70:30(v/v)，流速为1.0mL/min；进样量为10μl。Surfactin标样：1.8mg/mL。

TB1501 surfactin产量检测结果

结论：经过本发明的LBS平板诱导方法，相比传统的液体发酵，surfactin产量增加了2倍，提高了制备生防芽胞杆菌表面活性素的效率，为生放菌的基础研究提供了便利条件。

实施例4

蔗糖诱导的生防芽胞杆菌次级代谢产物表面活性素产量增加在防治番茄灰霉病增效作用中的应用。

生放菌发酵液的制备：取一环芽孢杆菌接种到盛有5毫升液体LB培养基（NaCl 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，酵母浸膏粉5g/L）的试管中，37℃，150rpm，过夜培养得到TB1340（或3610）种子液。1/1000接种到100毫升液体LB培养基中，37℃，150rpm，震荡培养48h即得生放菌发酵液。

番茄灰霉病菌生测：选用7-9片真叶、生长情况一致的番茄植株进行生放芽胞杆菌的防效试验。设置病对照CK，TB1501，TB1501+sucrose（5g/L），TB1340，TB1340+sucrose（5g/L），3610，3610+sucrose（5g/L）5组处理，每组处理15棵番茄，设3个重复。

番茄定殖前用1000倍稀释的生放菌发酵液蘸根30min，定植后喷施1000倍稀释的生放菌发酵液，喷施以有水珠从叶片滴落为标准。喷施生放菌3-5d后接种番茄灰霉病菌（10⁶个/mL的孢子悬浮液），放人工气候箱培养（温度 25℃，相对湿度 98%，光照0）3天，后光照设置改为光照100% /16h，光照0/ 8 h继续培养7天进行番茄灰霉病菌病情调查，每株取上、中、下部叶片进行调查，番茄灰霉病调查分级标准如下：

0级：叶片无病斑；

1级：叶片出现零星小病斑；

3级：病斑面积占叶片面积1/10~ 1/6；

5级：病斑面积占叶片面积1/6~ l/4；

7级：病斑面积占叶片面积1/4~ l/2；

9级：病斑面积占叶片面积1/2以上或引起落叶。

根据以下公式计算病情指数和防治效果：

病情指数= ∑ (各级病叶数×相应病级值)/(调查总叶数×最高代表级值) ×100 ；

相对防效= (对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数 X 100 %。

结果与分析：

番茄灰霉病菌生测结果

番茄灰霉病菌生测结果表明，添加蔗糖后，生放菌防治灰霉病菌的防效显著提高，结合蔗糖诱导后生放菌产表面活性素增加的现象，推测蔗糖诱导的生放菌防治灰霉病菌的增效作用依赖于表面活性素产量的增加。