一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法
阅读说明：本技术 一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法 (Fermentation method of recombinant humanized collagen ) 是由 王俊 郝东 周浩 魏文培 侯增淼 于 2021-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法,涉及基因重组工程菌高密度发酵技术领域。一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法,包括以下步骤：S1：将毕赤酵母基因工程菌接种于种子罐中培养,待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；S2：将生产发酵罐内的毕赤酵母基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后,使用葡萄糖溶液和甲醇进行混合碳源补料；S3：结束混合碳源补料后,使用甲醇溶液先通过梯度脉冲方式进行补料,再使用葡萄糖溶液和甲醇溶液进行恒速补料至发酵结束。本发明可以减少重组人源化胶原蛋白在发酵过程发生降解,可以进行稳定的工业化生产。(The invention provides a fermentation method of recombinant humanized collagen, and relates to the technical field of high-density fermentation of gene recombinant engineering bacteria. A fermentation method of recombinant humanized collagen comprises the following steps: s1: inoculating pichia pastoris genetic engineering bacteria into a seeding tank for culture, and transferring the pichia pastoris genetic engineering bacteria to a production fermentation tank after dissolved oxygen is greatly increased; s2: culturing pichia pastoris genetic engineering bacteria in a production fermentation tank until dissolved oxygen is greatly increased, and then using a glucose solution and methanol to supplement a mixed carbon source; s3: after the mixed carbon source feeding is finished, feeding is carried out by using a methanol solution in a gradient pulse mode, and then feeding is carried out at a constant speed by using a glucose solution and the methanol solution until the fermentation is finished. The invention can reduce the degradation of the recombinant humanized collagen in the fermentation process and can carry out stable industrial production.)
技术领域
本发明涉及基因重组工程菌高密度发酵技术领域，具体而言，涉及一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法。
背景技术
胶原蛋白是胶原水解完全后的产物，广泛分布于动物结缔组织中，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用，胶原蛋白因具有低免疫原性、可降解性、良好的生物相容性等生物学特性，在医药、组织工程、食品、化妆品等领域有着广泛的应用。目前各领域所用胶原蛋白主要采用酸、碱水解法或酶解法从动物皮、骨等组织中提取获得，但这些方法制取的胶原蛋白水溶性较差、难分离到纯品，且在临床上易造成致病污染和出现排异反应，使其在作为医药、生物医学材料或药物载体等方面的应用受到很大限制；也有通过重组表达方式生产重组胶原蛋白的文献和专利报道，申请号为CN200610098297.5，CN201110327865.5，CN201310033299.6，CN01106757.8和CN201610388271.8的中国专利均是通过重组表达的方式生产重组胶原蛋白，但这些重组胶原蛋白序列经过修饰或是带有标签蛋白，属于重组类胶原蛋白，并不是真正意义上的重组人源化胶原蛋白，重组人源化胶原蛋白指的是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。
目前，现有重组类胶原蛋白的发酵方法基本都是参考Invitrogen公司的毕赤酵母发酵手册，或是在此基础上稍作修改，适用于结构稳定的重组类胶原蛋白；由于重组人源化胶原蛋白序列完全和天然胶原氨基酸序列保持一致，相比较经过序列修饰的重组类胶原蛋白结构更加不稳定，若使用该发酵方法，在发酵过程中容易发生降解，不利于稳定的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法，其可以减少重组人源化胶原蛋白在发酵过程的降解，可以进行稳定的工业化生产。
本发明的实施例通过以下技术方案实现：
一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将毕赤酵母基因工程菌接种于种子罐中培养，待溶氧大幅度回升后转移至生产发酵罐；
S2：将生产发酵罐内的毕赤酵母基因工程菌培养至溶氧大幅度回升后，使用葡萄糖溶液和甲醇进行混合碳源补料；
S3：结束混合碳源补料后，使用甲醇溶液先通过梯度脉冲方式进行补料，再使用葡萄糖溶液和甲醇溶液进行恒速补料至发酵结束。
进一步地，所述步骤S2中葡萄糖溶液的流加速率为10～30mL/h/L，甲醇的流加速率为0.1～1.5mL/h/L。
进一步地，所述步骤S3中设置脉冲量梯度分别为发酵液体积的1％、1.5％和2％，每个梯度分别脉冲补料2～5次，每次脉冲补料结束后需等待溶氧量回升后再开启下一次脉冲补料。
进一步地，所述步骤S3中进行恒速补料时，葡萄糖溶液的流加速率为0.1～1mL/h/L，甲醇溶液的流加速率为4～10mL/h/L。
进一步地，所述葡糖糖溶液的质量分数为40％～80％。
进一步地，所述步骤S3中脉冲和恒速补料使用的甲醇溶液中均添加有PTM1，添加量为12～24mL/L。
进一步地，所述毕赤酵母基因工程菌为表达重组人源化胶原蛋白的毕赤酵母工程菌；所述重组人源化胶原蛋白为重组人源化I型胶原蛋白、重组人源化II型胶原蛋白、重组人源化III型胶原蛋白或重组人源化I型、II型、III型胶原蛋白功能区片段的组合。
进一步地，所述步骤S1中培养毕赤酵母基因工程菌至四级种子的具体方法为：(1)将重组人源化I型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌按照0.1％～0.3％的接种量接种于摇瓶中的YPD培养基中，于29±1℃，220rpm培养48～60h，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿重达到35～40g/L，培养得到毕赤酵母基因工程菌一级种子；(2)将毕赤酵母基因工程菌一级种子液采用火圈法按照6％～12％的接种量接种于15L种子罐中的底料培养基中，于29±1℃，pH5.0，溶氧数值范围为20％～50％，培养16～24h得到毕赤酵母基因工程菌二级种子；(3)待毕赤酵母菌二级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照6％～12％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，于29±1℃，pH 5.0，溶氧数值范围为20％～50％，培养16～24h得到毕赤酵母基因工程菌三级种子；(4)待毕赤酵母菌三级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照6％～12％的接种量接种于1500L生产发酵罐中的底料培养基中，于29±1℃，pH 5.0，溶氧数值范围为20％～50％，培养16～24h得到毕赤酵母基因工程菌四级种子；发酵过程中采用1～5mol/L KOH调节发酵液的pH，使发酵过程pH 3.0～7.0。
进一步地，所述YPD培养基包括以下浓度的组分：酵母粉0.8～1.2g/L，蛋白胨1.8～2.2g/L和葡萄糖1.8～2.2g/L。
进一步地，所述底料培养基包括以下浓度的组分：KH2PO4 21.5～43.0g/L，(NH4)2SO4 2.5～7.5g/L，CaSO4·2H2O 0.2～1.0g/L，K2SO4 7～14.3g/L，M gSO4·7H2O 6～11.7g/L，葡萄糖80～120g/L，PTM1 4.2～8.4mL/L和维生素C 0.01～0.1g/L。
进一步地，所述PTM1包括以下浓度的组分：CuSO4·5H2O 4～8g/L，N aI 0.3～0.5g/L，MnSO4·H2O 4～6g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1～0.3g/L，H3BO4 0.1～0.2g/L，CoCl2 0.5～1.5g/L，ZnCl2 25～35g/L，FeSO4·7H2O 75～95g/L和H2SO4 3～6mL/L和生物素0.1～0.3g/L。
毕赤酵母菌体会根据碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫来改变自身的酶系，进而导致降解外源蛋白；本发明在碳源补料时，流加高浓度葡萄糖的同时流加少量的甲醇进行混合碳源补料，诱导了醇氧化酶的启动，对毕赤酵母菌体无胁迫作用，且从碳源补料阶段就开始了葡萄糖到甲醇的碳源转化，之后在诱导表达补料阶段再通过梯度脉冲方式进行补料，毕赤酵母菌体的甲醇代谢途径完全被打开，通过温和的方式进行了碳源改变，减少了毕赤酵母细胞对外界环境改变的应激反应，使毕赤酵母细胞的蛋白酶分泌量减少，从而有效减少重组人源化胶原蛋白的降解。
本发明实施例的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
1.本发明在碳源补料时，流加高浓度葡萄糖的同时流加少量的甲醇进行混合碳源补料，诱导了醇氧化酶的启动，与传统的饥饿工艺相比较，对毕赤酵母菌体无胁迫作用。
2.本发明的毕赤酵母菌体从碳源补料阶段就开始了葡萄糖到甲醇的碳源转化，之后在诱导表达补料阶段再通过梯度脉冲方式进行补料，毕赤酵母菌体的甲醇代谢途径完全被打开，与经典的DO-Start法相比较，不需要考虑溶氧的波动情况，也避免了DO-Start法在生产过程中甲醇浓度过高抑制菌体生长时所形成的溶氧上升的假象，在工业化放大生产中，本发明操作方法更加简单，生产操作人员更容易掌握。
3.本发明在诱导表达补料阶段后期恒速流加一定比例的葡萄糖，大幅度减小了甲醇的用量，且促进了毕赤酵母菌体的生长，缩短了发酵周期，同时增加了重组人源化胶原蛋白的表达量。
4.本发明通过特殊的补料方式调节毕赤酵母的代谢途径，避免了饥饿对毕赤酵母细胞生长的胁迫作用、通过温和碳源改变方法减少了毕赤酵母细胞对外界环境改变的应激反应，使毕赤酵母细胞的蛋白酶分泌量减少，从而有效减少重组人源化胶原蛋白的降解。
5.本发明在发酵过程采用1～5mol/L KOH调节发酵液的pH，避免了挥发性氨水的使用，无氨水挥发带来的毒性，本发明采用KOH生产操作更加简便安全。
附图说明
图1为实施例1提供的重组人源化I型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌的重组人源化I型胶原蛋白表达图；其中，M-Marker，1-诱导表达补料前，2-补料后30h，3-补料后36h，4-补料后42h，5-补料后48h，6-补料后54h，7-补料后60h；
图2为对比例提供的重组人源化I型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌的重组人源化I型胶原蛋白表达图；其中，M-Marker，1-补料后20h，2-补料后30h，3-补料后40h，4-补料后50h，5-补料后60h，6-补料后70h，7-补料后80h，8-补料后90h。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法进行具体说明。
实施例1
本实施例提供了一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法，包括以下步骤：
S1：(1)将重组人源化I型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌按照0.1％的接种量接种于摇瓶中的YPD培养基中，于29℃，220rpm培养60h，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿重达到35g/L，培养得到毕赤酵母基因工程菌一级种子；YPD培养基包括以下浓度的组分：酵母粉1.0g/L，蛋白胨2.0g/L和葡萄糖2.0g/L；(2)将毕赤酵母基因工程菌一级种子液采用火圈法按照8％的接种量接种于15L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养20h得到毕赤酵母基因工程菌二级种子；(3)待毕赤酵母菌二级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照8％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH5.0，溶氧数值为30％以上，培养19h得到毕赤酵母基因工程菌三级种子；(4)待毕赤酵母菌三级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照10％的接种量接种于1500L生产发酵罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养21h得到毕赤酵母基因工程菌四级种子；发酵过程中采用5mol/L KOH调节发酵液的pH，使发酵过程pH 7.0；
底料培养基包括以下浓度的组分：KH2PO4 42.9g/L，(NH4)2SO4 7.5g/L，CaSO4·2H2O 1.0g/L，K2SO4 14.3g/L，MgSO4·7H2O 11.7g/L，葡萄糖120g/L，PTM1 8.4mL/L和维生素C 0.1g/L；其中PTM1包括以下浓度的组分：CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.4g/L，MnSO4·H2O 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO4 0.1g/L，CoCl2 1g/L，ZnCl2 30g/L，FeSO4·7H2O 90g/L和H2SO4 5mL/L和生物素0.2g/L；
S2：将生产发酵罐内的毕赤酵母基因工程菌四级种子培养至溶氧大幅度回升后，使用60％葡萄糖溶液和甲醇进行混合碳源补料，60％葡萄糖溶液的流加速率为10mL/h/L，甲醇的流加速率为0.1mL/h/L，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿菌重达到200g/L时，结束混合碳源补料；
S3：结束混合碳源补料后，使用添加有12mL/L的PTM1的甲醇溶液先通过脉冲方式进行补料，设置脉冲量梯度分别为发酵液体积的1％、1.5％和2％，每个梯度分别脉冲补料3次，每次脉冲补料结束后需等待溶氧量回升后再开启下一次脉冲补料；再将60％葡萄糖溶液和添加有12mL/L的PTM1的甲醇溶液进行恒速补料，60％葡萄糖溶液的流加速率为0.1mL/h/L，添加有12mL/L的PTM1的甲醇溶液的流加速率为5.3mL/h/L，至发酵结束，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
实施例2
本实施例提供了一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法，包括以下步骤：
S1：(1)将重组人源化II型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌按照0.3％的接种量接种于摇瓶中的YPD培养基中，于29℃，220rpm培养56h，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿重达到40g/L，培养得到毕赤酵母基因工程菌一级种子；YPD培养基包括以下浓度的组分：酵母粉0.8g/L，蛋白胨2.2g/L和葡萄糖2.2g/L；(2)将毕赤酵母基因工程菌一级种子液采用火圈法按照10％的接种量接种于15L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养16h得到毕赤酵母基因工程菌二级种子；(3)待毕赤酵母菌二级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照10％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH5.0，溶氧数值为30％以上，培养16h得到毕赤酵母基因工程菌三级种子；(4)待毕赤酵母菌三级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照10％的接种量接种于1500L生产发酵罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养17h得到毕赤酵母基因工程菌四级种子；发酵过程中采用3mol/L KOH调节发酵液的pH，使发酵过程pH 5.0；
底料培养基包括以下浓度的组分：KH2PO4 21.5g/L，(NH4)2SO4 2.5g/L，CaSO4·2H2O 0.2g/L，K2SO4 7g/L，MgSO4·7H2O 6g/L，葡萄糖80g/L，PT M1 4.2mL/L和维生素C0.01g/L；其中PTM1包括以下浓度的组分：CuS O4·5H2O 6g/L，NaI 0.4g/L，MnSO4·H2O 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO4 0.1g/L，CoCl2 1.0g/L，ZnCl2 30g/L，FeSO4·7H2O 90g/L和H2SO4 5mL/L和生物素0.2g/L；
S2：将生产发酵罐内的毕赤酵母基因工程菌四级种子培养至溶氧大幅度回升后，使用40％葡萄糖溶液和甲醇进行混合碳源补料，40％葡萄糖溶液的流加速率为20mL/h/L，甲醇的流加速率为0.5mL/h/L，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿菌重达到200g/L时，结束混合碳源补料；
S3：结束混合碳源补料后，使用添加有24mL/L的PTM1的甲醇溶液先通过脉冲方式进行补料，设置脉冲量梯度分别为发酵液体积的1％、1.5％和2％，每个梯度分别脉冲补料3次，每次脉冲补料结束后需等待溶氧量回升后再开启下一次脉冲补料；再将40％葡萄糖溶液和添加有24mL/L的PTM1的甲醇溶液进行恒速补料，40％葡萄糖溶液的流加速率为0.5mL/h/L，添加有24mL/L的PTM1的甲醇溶液的流加速率为5.2mL/h/L，至发酵结束，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
实施例3
本实施例提供了一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法，包括以下步骤：
S1：(1)将重组人源化I型、II型、III型胶原蛋白功能区片段的组合的毕赤酵母基因工程菌按照0.2％的接种量接种于摇瓶中的YPD培养基中，于29℃，220rpm培养60h，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿重达到40g/L，培养得到毕赤酵母基因工程菌一级种子；YPD培养基包括以下浓度的组分：酵母粉1.0g/L，蛋白胨2.2g/L和葡萄糖2.2g/L；(2)将毕赤酵母基因工程菌一级种子液采用火圈法按照8％的接种量接种于15L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养17h得到毕赤酵母基因工程菌二级种子；(3)待毕赤酵母菌二级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照8％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养18h得到毕赤酵母基因工程菌三级种子；(4)待毕赤酵母菌三级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照8％的接种量接种于1500L生产发酵罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养19h得到毕赤酵母基因工程菌四级种子；发酵过程中采用1mol/L KOH调节发酵液的pH，使发酵过程pH 3.0；
底料培养基包括以下浓度的组分：KH2PO4 32.3g/L，(NH4)2SO4 4.8g/L，CaSO4·2H2O 0.6g/L，K2SO4 10.7g/L，MgSO4·7H2O 8.9g/L，葡萄糖100g/L，PTM1 6.3mL/L和维生素C0.05g/L；其中PTM1包括以下浓度的组分：CuSO4·5H2O 6g/L，NaI 0.4g/L，MnSO4·H2O 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO4 0.1g/L，CoCl2 1g/L，ZnCl2 30g/L，FeSO4·7H2O 90g/L和H2SO4 5mL/L和生物素0.2g/L；
S2：将生产发酵罐内的毕赤酵母基因工程菌四级种子培养至溶氧大幅度回升后，使用80％葡萄糖溶液和甲醇进行混合碳源补料，80％葡萄糖溶液的流加速率为30mL/h/L，甲醇的流加速率为1.5mL/h/L，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿菌重达到200g/L时，结束混合碳源补料；
S3：结束混合碳源补料后，使用添加有18mL/L的PTM1的甲醇溶液先通过脉冲方式进行补料，设置脉冲量梯度分别为发酵液体积的1％、1.5％和2％，每个梯度分别脉冲补料3次，每次脉冲补料结束后需等待溶氧量回升后再开启下一次脉冲补料；再将80％葡萄糖溶液和添加有18mL/L的PTM1的甲醇溶液进行恒速补料，80％葡萄糖溶液的流加速率为1mL/h/L，添加有18mL/L的PTM1的甲醇溶液的流加速率为5.1mL/h/L，至发酵结束，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束。
对比例
本对比例提供了重组人源化胶原蛋白的发酵方法，包括以下步骤：
S1：(1)将重组人源化I型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌按照0.1％的接种量接种于摇瓶中的YPD培养基中，于29℃，220rpm培养60h，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿重达到35g/L，培养得到毕赤酵母基因工程菌一级种子；YPD培养基包括以下浓度的组分：酵母粉0.8g/L，蛋白胨2.0g/L和葡萄糖2.0g/L；(2)将毕赤酵母基因工程菌一级种子液采用火焰法按照8％的接种量接种于15L种子罐中的底料培养基中的底料培养基中，于30℃，pH5.0，溶氧数值为30％以上，培养23h得到毕赤酵母基因工程菌二级种子；(3)待毕赤酵母菌二级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照8％的接种量接种于150L种子罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养22h得到毕赤酵母基因工程菌三级种子；(4)待毕赤酵母菌三级种子液溶氧大幅度回升后，采用压差法按照8％的接种量接种于1500L生产发酵罐中的底料培养基中，于29℃，pH 5.0，溶氧数值为30％以上，培养21h得到毕赤酵母基因工程菌四级种子；发酵过程中采用1mol/L氨水调节发酵液的pH，使发酵过程pH 5.0；
底料培养基包括以下浓度的组分：85％磷酸26.7mL/L，硫酸钙0.9g/L，硫酸钾18.2g/L，七水硫酸镁14.9g/L，氢氧化钾4.13g/L，甘油40g/L，PT M1 4.35mL/L；其中PTM1包括以下浓度的组分：CuSO4·5H2O 6g/L，NaI0.4g/L，MnSO4·H2O 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO4 0.1g/L，CoCl21g/L，ZnCl2 30g/L，FeSO4·7H2O 90g/L和H2SO4 5mL/L和生物素0.2g/L；
S2：将生产发酵罐内的毕赤酵母基因工程菌四级种子培养至溶氧大幅度回升后，使用甘油补料培养基进行流加碳源，流加速率为18.2mL/h/L，至毕赤酵母基因工程菌菌体湿菌重达到200g/L时，结束碳源补料；甘油补料培养基包括以下浓度的组分：甘油500mL/L，PTM1 12mL/L，去离子水488mL/L；
S3：结束混合碳源补料后饥饿40min，使用甲醇补料培养基进行补料，以3.6mL/L/h补料速度开始补料，3h后补料速度增加到7.2mL/L/h，6h后补料速度增加到10.9mL/L/h，并以此速度维持补料至发酵结束，溶氧数值维持在20％的波动，补料速率提升后通入液氧，当毕赤酵母菌菌体湿菌重或蛋白表达量不再增加时整个发酵过程结束；甲醇补料培养基包括以下浓度的组分：甲醇988mL/L，PTM1 12mL/L。
实验例1
检测实施例1和对比例发酵的重组人源化I型胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌的重组人源化I型胶原蛋白表达，分别取实施例1发酵过程中诱导表达补料前、诱导表达补料后培养30h、36h、42h、48h、54h和60h的发酵液，离心取上清液，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白表达检测，结果如图1所示；分别取对比例发酵过程中诱导表达补料后培养20h、30h、40h、50h、60h、70h、80h和90h的发酵液，离心取上清液，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白表达检测，结果如图2所示；并采用灰度分析法对SDS-PAGE结果图谱进行分析，分析结果如表1所示。
判定标准：重组人源化I型胶原蛋白理论分子量为66.2kD左右，根据Marker标定的分子量判定目的蛋白是否表达。由图1和图2可看出，采用对比例的传统发酵方法发酵的毕赤酵母基因工程菌，在诱导表达补料后的整个诱导过程中，重组人源化I型胶原蛋白均存在明显的降解；而采用本发明的发酵方法发酵的毕赤酵母基因工程菌，在诱导表达补料后的整个诱导过程中，重组人源化I型胶原蛋白仅出现轻微的降解。
表1 SDS-PAGE结果图谱分析
由表1可以看出，采用本发明的发酵方法发酵的毕赤酵母基因工程菌，在诱导表达补料后的整个诱导过程中，重组人源化I型胶原蛋白的表达量远高于对比例的传统发酵方法的表达量，重组人源化I型胶原蛋白占比超过90％，仅出现轻微的降解，而采用对比例方法获得的重组人源化I型胶原蛋白占比仅37％，发生了严重的降解。
实验例2
记录实施例1～3和对比例发酵重组人源化胶原蛋白毕赤酵母基因工程菌的相关参数；结果如表2所示。
表2发酵相关参数
由表2可以看出，在放罐菌体湿菌重基本相同的条件下，实施例1～3中甲醇消耗量相比较对比例减少了一半多，与此同时实施例1～3发酵过程均没有通入液氧，而对比例中需要通入液氧来维持较高的甲醇补料速率，虽然对比例中维持较高的甲醇补料速率，但却没有获得更高的产量，本发明在仅仅通入洁净空气的情况下，采用较低的甲醇补料速率，达到了缩短发酵周期约18.1％，减少了一半多的甲醇消耗量，与此同时重组人源化I型胶原蛋白产量还有小幅度提高。
综上，本申请提供的一种重组人源化胶原蛋白的发酵方法，其在诱导蛋白表达的过程中，重组人源化胶原蛋白仅出现轻微的降解，且表达量有所提高，在发酵过程中甲醇消耗量降低，发酵周期缩短，有利于进行稳定的工业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。