阅读说明：本技术 一种速崩型a群c群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针及其制备方法 (Rapidly disintegrating type A group C meningococcal polysaccharide conjugate vaccine soluble microneedle and preparation method thereof ) 是由 张庶民 马凤森 周荔葆 廖辉 陈中秋 刘苗苗 吴铮 辛小韵 于 2018-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针,所述的微针由聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂、超细碳酸钙、A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗组成；其中,崩解剂在针体中的固含量占比为6％～16％,超细碳酸钙在针体中的固含量占比为5％～20％,A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在针体中的固含量占比为不高于10％。本发明提供的可溶性微针,既提高了微针的释药速率,又避免了因快速释药导致的针体刺入皮肤效果差的技术缺陷；同时,免疫学实验结果证明该微针产生的免疫效果优于皮下注射,能有效的对机体产生免疫保护作用。(The invention provides a rapidly disintegrating type A group C meningococcal polysaccharide conjugate vaccine soluble microneedle, which consists of polyvinylpyrrolidone, a disintegrating agent, superfine calcium carbonate and A group C meningococcal polysaccharide conjugate vaccine; wherein, the solid content of the disintegrating agent in the needle body is 6-16%, the solid content of the superfine calcium carbonate in the needle body is 5-20%, and the solid content of the A group C meningococcal polysaccharide conjugate vaccine in the needle body is not higher than 10%. The soluble microneedle provided by the invention not only improves the drug release rate of the microneedle, but also avoids the technical defect of poor effect of penetrating a needle body into skin caused by rapid drug release; meanwhile, immunological experiment results prove that the microneedle has better immune effect than subcutaneous injection and can effectively generate immune protection effect on organisms.)

一种速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针及其 制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗的微针给药技术领域，提供了一种速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针及其制备方法。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎双球菌引起的化脓性脑膜炎，又称流脑。主要临床表现有发热、头痛、呕吐、皮肤瘀点及颈项强直等脑膜刺激征，脑脊液呈化脓性改变。目前上市的的流脑疫苗都为注射剂剂型，此疫苗又多用于幼儿，注射剂具有顺应性差的缺陷。因此亟待一种新型的疫苗给药途径。人体皮肤含有丰富的抗原呈递细胞，比如存在表皮中的朗格罕氏细胞占所有表皮细胞的3～5％，故经皮免疫具有较好的研究前景。然而，皮肤的角质层障碍使得大分子药物的递送成为了难题。

可溶性微针属于微针的一类，它可以克服人体皮肤的角质层障碍，能很好的促进大分子抗原药物透皮吸收，实现无痛给药。与其他微针不同的是，可溶性微针刺入人体皮肤后可自行溶解，避免了固体实心微针皮内针头断裂以及涂层微针载药量小等问题，是目前微针研究的热门领域。

公开号为CN107158368A的中国发明专利公开了一种流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴及其制备方法，从该文献的第【0042】段写道：该微针贴的针体可以在15-60min内将目标药物释放到皮肤内；并且，在30min时才能保证刺入皮肤部分的可溶性微针针体完全溶解在皮肤中并将A+C群流脑多糖结合疫苗释放进入皮肤。亦因此，当患者实际在自主给药时，须将微针持续按压在皮肤上30min才能揭下，这将导致患者的顺应性很差。

故，考虑开发一种能够在更短的时间内将A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗完全释放入皮肤的可溶性微针，以解决现有技术的患者顺应性差缺陷，是当务之急。

目前，尚未有可将崩解剂加入可溶性微针进行药物速释的专利文献报道，本发明的申请人在前期预实验中发现，崩解剂在提高微针快速释药的同时，也存在因针体的力学强度较弱，导致难以有效刺入皮肤的技术缺陷。

综上所述，如何开发出一种速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针，既能提高微针刺入皮肤后的释药速率，解决患者的顺应性问题；又能保证有足够的机械强度刺入皮肤，甚至能提高该疫苗微针的免疫应答效果，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明目的在于提供了一种速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针及其制备方法，通过加入适合比例的崩解剂和超细碳酸钙作为力学强度增强相，解决了上述现有技术存在的瓶颈。

为实现上述研发思路，本发明采用的技术方案具体如下：

一种速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针，所述的微针由聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂、超细碳酸钙、A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗组成；其中，崩解剂在针体中的固含量占比为6％～16％，超细碳酸钙在针体中的固含量占比为5％～20％，A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗在针体中的固含量占比为不高于10％。

优选的，所述的崩解剂选自干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代纤维素、交联羧甲基纤维素钠中的一种或几种，

更优选的，所述的崩解剂为羧甲基淀粉纳。

优选的，所述的针体中各组分的固含量占比为：PVP占70％，羧甲基淀粉纳占10％，超细碳酸钙占10％，A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗占10％。

本发明还提供了一种如前所述的速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针的制备方法，即采用干粉压模法，包括如下步骤：将处方量的物料填入阴模，冲压，脱模，即得片状微针阵列。

本发明中，超细碳酸钙作为力学强度增强相，可大大提高微针的力学强度，增强其皮肤穿刺能力。

本发明速崩型A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针贴，与现有技术相比，创新性在于：

该微针采用崩解剂与超细碳酸钙结合使用的技术，提高了微针的释药速率(3min内药物完全释放)，又避免了因快速释药导致的针体刺入皮肤效果差的技术缺陷；同时，免疫学实验结果证明该微针产生的免疫效果优于皮下注射，能有效的对机体产生免疫保护作用。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入到了本发明的保护范围。

实施例1：干粉压模法制备可溶性微针

本发明的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针，按如下步骤制得：将A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、崩解剂、超细碳酸钙按处方比例混合均匀(前述的几种物料，平均粒径都要小于0.5μm)，填充到带有固定规格尺寸圆锥型的微孔阵列的阴模(阵列参数为：孔的深度为900μm、每个孔口的直径为300μm，孔阵列间距为900μm，10×10共100个孔)，冲压，脱模，即得片状微针阵列。

实施例2：不同基质材料对微针针体的溶解速度影响

为了对比不同基质材料制得的微针针体的溶解速度差异，选择聚乙烯吡咯烷酮PVP、PVA、HA、CMC、甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物(Gantrez)、右旋糖酐这几种基质材料进行考察。

加入0.5％(w.t.)亚甲基蓝，参照实施例1的方法制成不含药的片状微针阵列，并将各微针浸入生理盐水中，开始计时，用放大镜观察针体完全溶解所需时间，结果见表1。

表1.各针体基质材料的溶解速度对比(mean±SD,n＝5)

针体基质材料	针体完全溶解所需时间(s)
		PVP	20±3
PVA	205±16
		HA	51±6
CMC	236±19
		Gantrez	78±8
右旋糖酐	46±5

从表1的结果可知，上述基质材料中，PVP的溶解速度最快，故作为本发明的优选，并在此基础上进一步考察其他组分的效果差异。

实施例3：不同崩解剂对微针针体的溶解速度影响

为了对比不同崩解剂的加入对微针针体的溶解速度影响，考察干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代纤维素、交联羧甲基纤维素钠这几种崩解剂的效果。

以PVP作为针尖液，在针体材料，加入0.5％(w.t.)亚甲基蓝，再加入表2中各崩解剂，使最终崩解剂在针体中的固含量为10％(w.t.)。

参照实施例1的方法制成不含药的片状微针阵列，并将各微针浸入生理盐水中，开始计时，用放大镜观察针体完全溶解所需时间，结果见表2。

表2.不同崩解剂的溶解速度对比(mean±SD,n＝5)

崩解剂	针体完全溶解所需时间(s)
		对照组	20±3
干淀粉	17±3
		羧甲基淀粉钠	7±1
低取代纤维素	15±2
		交联羧甲基纤维素钠	12±3

从表2的结果可知，4种崩解剂对于微针针体溶解速度都有一定程度的提高，其中羧甲基淀粉钠的效果最好，故作为本发明的优选，并在此基础上进一步考察其他组分的效果差异。

实施例4：不同力学增强相材料的对于微针皮肤刺入效果和皮内溶解时间对比

微针刺入皮肤需要适宜的硬度，纳米材料属于力学增强相的一种，即在可溶性微针的有机高分子聚合中加入纳米颗粒形成聚合物基纳米复合材料以增强微针整体的机械强度。关于纳米材料和可溶性微针的结合，文献中已有报道，比如研究者(Yu W,Jiang G,Liu D,et al.Fabrication of biodegradable composite microneedles based oncalcium sulfate and gelatin for transdermal delivery of insulin[J].MaterialsScience and Engineering:C,2017,71:725-734.)将纳米材料半水硫酸钙粉末加入明胶中形成纳米复合材料微针，增强了微针的力学强度，使其能有效用于经皮递送胰岛素；另外，还有研究者(Yan L,Raphael A P,Zhu X,et al.Nanocomposite‐StrengthenedDissolving Microneedles for Improved Transdermal Delivery to Human Skin[J].Advanced healthcare materials,2014,3(4):555-564.)将层状双金属氢氧化物加入羧甲基纤维素中形成纳米复合材料微针，也增强了微针的力学强度，使其能有效用于经皮递送卵清蛋白。目前还未发现将超细碳酸钙作为可溶性微针纳米增强相的报道。

为了更加全面地反映可溶性微针的皮肤刺入效果，本实施例参照中国发明专利CN107158368A之实施例2选取了明胶作为模拟离体皮肤模型，并考察双金属氢氧化物、半水硫酸钙、超细碳酸钙这三种材料作为纳米增强相的效果差异。按照表3中各组分的比例，参照实施例1的方法制成片状微针阵列。

微针的皮肤刺入深度和溶解时间也参照中国发明专利CN107158368A实施例2中所述的方法将微针刺入皮肤模型，并用激光共聚焦观察微针***深度和针体刺入皮内部分完全溶解所需时间，结果见表3。

表3.不同纳米增强相材料的皮肤刺入效果和皮内溶解时间对比(mean±SD,n＝5)

根据预实验和经验，可溶性微针刺入深度达到600μm以上，溶解时间小于5min时，才能达到本专利的预期效果，符合使用要求。由表3的结果可知：

1)分析组A和组B可知，PVP空白微针能有效刺入离体皮肤，加入10％多糖结合疫苗后，机械性能下降，刺入深度大幅减少至405μm，皮内溶解增加至18.4min，这与专利CN107158368A实施例2中的描述一致，因此专利CN107158368A中限定疫苗含量不能超过8％。

2)分析组C可知，当加入10％的崩解剂后，刺入深度进一步减少至316μm，溶解时间减少至3.1min，说明崩解剂的崩解效果在皮内也能较好地发挥，但崩解剂加入后降低了微针的机械性能。

3)分析组D、组E、组F可知，不同的纳米增强相加入微针后，微针刺入深度均有提高，但只有组F(加入超细碳酸钙)符合使用要求；而且，组F刺入皮内的微针针体能在3min内完全崩解释药，释药速度远远优于这个发明专利CN107158368A第【0042】段所述的15-60min内将目标药物释放到皮肤内，故选择超细碳酸钙作为本发明的力学增强相材料。

实施例5：多糖结合疫苗的固含量变化对皮肤安全性的影响

为了确定A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(以下简称：多糖结合疫苗)的固含量，假定羧甲基淀粉纳、超细碳酸钙的固含量为定值，改变多糖结合疫苗的固含量，考察载药量的变化所带来的效果差异。

选取剃毛的家兔背部皮肤进行微针给药，并在施用微针后20min，观察施用微针处皮肤的红肿情况，结果发现：当多糖结合疫苗的固含量在10％以内时无明显皮肤红肿，大于10％后就发生明显的皮肤红肿，刺激性大，故多糖结合疫苗的固含量应不高于10％。

实施例6：羧甲基淀粉钠和超细碳酸钙的含量变化对微针针体的溶解速度影响

在实施例2～5的基础上，假定多糖结合疫苗的固含量为一定值，考察羧甲基淀粉钠或超细碳酸钙的含量变化对微针针体的刺入深度与溶解速度影响，结果见表4。

表4.羧甲基淀粉钠和超细碳酸钙的固含量范围筛选(mean±SD,n＝5)

根据预实验和经验，可溶性微针刺入深度达到600μm以上，溶解时间小于5min时，才能达到本专利的预期效果，符合使用要求。由表4的结果可知：

1)分析组A～E可知，当多糖结合疫苗、超细碳酸钙的固含量为定值时，羧甲基淀粉钠的含量从5％上升至17％时，微针的机械性能下降，针体的刺入深度逐渐降低；综合考虑刺入深度和溶解时间，羧甲基淀粉钠的含量为6％～16％时，制得的微针符合使用要求。

2)分析组F～I可知，当多糖结合疫苗、羧甲基淀粉钠的固含量为定值时，超细碳酸钙的含量为5％～20％时，制得的微针的刺入深度和溶解时间均符合使用要求。

3)综合考虑刺入深度和溶解时间，组C为最优处方，即微针针体中各组分的固含量配比为：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)70％，多糖结合疫苗10％，羧甲基淀粉钠10％，超细碳酸钙10％。

实施例7：小鼠免疫效果对比

选取4-6周龄BALB/c雌性小鼠，适应性饲养及检疫期为3天。根据表5中的分组情况将小鼠随机分为6组，每组6只，每组用苦味酸染色，用以区别各组，防止饲养和用药过程中发生混淆。其中，6个实验组具体如下：

对照组1为生理盐水的注射组，于0,14,28天皮下注射0.2ml，生理盐水注射剂量为10μg/剂，作为空白对照；

注射组为多糖结合疫苗的注射组，于0,14,28天皮下注射0.2ml，多糖结合疫苗的注射剂量为10μg/剂；

对照组2为不含多糖结合疫苗的可溶性微针组，制备方法参照实施例1，作为空白对照；

微针组A为含多糖结合疫苗，但不含羧甲基淀粉钠和超细碳酸钙的可溶性微针组，制备方法参照实施例1，多糖结合疫苗的用量为10μg/剂；

微针组B为含多糖结合疫苗和羧甲基淀粉钠，但不含超细碳酸钙的可溶性微针组，制备方法参照实施例1，多糖结合疫苗的用量为10μg/剂；

微针组C为同时含多糖结合疫苗、羧甲基淀粉钠和超细碳酸钙的可溶性微针组，即最优处方组，制备方法参照实施例1，多糖结合疫苗的用量为10μg/剂；

微针组A、B、C在给药前一天对小鼠背部两侧皮肤进行脱毛处理，于0,14,28天在背部脱毛部位进行给药，将片状微针阵列按压至皮肤表面持续3min，取出微针，全程免疫共3次。

小鼠免疫第35天时，将小鼠摘除眼球后于眼眶采血，37℃放置1h后，4℃放置过夜。置于离心机中，设置转数为3000rpm，离心8min，收集血清，2-8℃冷藏，分离血清于-20℃保存，用ELISA测定抗体滴度，各组结果见表5。

表5.各组抗体滴度结果(mean±SD,n＝6)

组别	A群抗体滴度(mIU/ml)	C群抗体滴度(mIU/ml)
			对照组1	0	0
对照组2	0	0
			注射组	12874±957	13609±1077
微针组A	754±61	681±70
			微针组B	1378±125	1566±138
微针组C	37618±2048	42893±3189

从表5的结果可以看出，

1)微针组A由于仅含10％的疫苗，导致刺入效果欠佳，且3min内疫苗只有少量释放，因此产生的A群抗体滴度只为注射组的约1/17，C群抗体滴度只为注射组的约1/20；

2)微针组B中加入了崩解剂，因此疫苗释放量多于A组，抗体滴度高于A组，但与注射组相比仍相差悬殊；

3)微针组C含超细碳酸钙和崩解剂，因此其刺入效果和释药速率都较好，产生的A群抗体滴度是注射组的约2.9倍，C群抗体滴度是注射组的约3.1倍。

综上所述，本发明制备的A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗可溶性微针，能够在施加微针后3min内完全释药，且超细碳酸钙的加入使其能够有足够的强度刺入皮肤，免疫学实验结果证明该微针产生的免疫效果优于皮下注射，效果显著。