阅读说明：本技术 一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴及其制备方法 (Quick-release type-b haemophilus influenzae conjugate vaccine soluble microneedle patch and preparation method thereof ) 是由 张庶民 马凤森 周荔葆 廖辉 陈中秋 刘苗苗 吴铮 辛小韵 于 2018-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴,包括针体和基底层,所述的针体由b型流感嗜血杆菌结合疫苗、佐剂、水溶性高分子材料组成,所述的基底层为柔性高分子材料；其中,佐剂与b型流感嗜血杆菌结合疫苗的含量比为(1：1)～(2：1),所述的佐剂为SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A中的一种或几种。本发明提供的b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴,能够实现平衡Th1/Th2型的免疫应答,以及疫苗在皮肤组织内快速释放。(The invention provides a quick-release b-type haemophilus influenzae conjugate vaccine soluble microneedle patch which comprises a needle body and a basal layer, wherein the needle body consists of b-type haemophilus influenzae conjugate vaccine, an adjuvant and a water-soluble high polymer material, and the basal layer is a flexible high polymer material; the content ratio of the adjuvant to the Haemophilus influenzae type b conjugate vaccine is (1: 1) - (2: 1), and the adjuvant is one or more of SPO1, astragalus polysaccharide and 3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A. The soluble microneedle patch of the haemophilus influenzae type b conjugate vaccine can balance Th1/Th2 immune response and quickly release the vaccine in skin tissues.)

一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴及其制备 方法

技术领域

本发明涉及疫苗的微针给药技术领域，提供了一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴及其制备方法。

背景技术

b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗，由纯化的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与破伤风类毒素(或其他载体蛋白)共价结合而成。b型流感嗜血杆菌是儿童鼻咽部常见的共生细菌，在应用疫苗前，大多数儿童都会在某段时期携带Hib，有时携带数月，但细菌定植率依年龄与社会经济状况不同相差很大。在Hib疫苗接种率高的地区，由于Hib结合疫苗的群体免疫作用，细菌在鼻咽部的定植率非常低。尽管只有小部分携带者会发展为临床病例，但由于Hib是通过呼吸道分泌物的飞沫传播的，携带者在传播疾病方面有重要意义。

Hib疾病主要表现为儿童肺炎和脑膜炎，在尚未开展大规模Hib疫苗接种的地区，Hib疾病是一个主要的公共卫生问题。据2006年WHO公告，全球每年至少有300万严重病例发生，约38.6万死亡。Hib发病与死亡多见于发展中国家，疾病负担在4～18月龄儿童最为严重，但小于3月龄和大于5岁儿童也偶尔发病。在未免疫人群，Hib是1岁以内儿童非流行性细菌性脑膜炎的主要病因。即便及时给予足量的抗生素治疗，3～20％的Hib脑膜炎患者仍会死亡。在医药卫生资源不足的地区，Hib脑膜炎病死率会更高，幸存者中神经系统后遗症也很常见，约占比例30～40％。Hib感染的其他重要但不常见的临床表现有：败血症、化脓性关节炎、骨髓炎、心包炎、蜂窝组织炎和会厌炎(特别是工业化国家)。如果在正常情况下无菌的体液或组织如血液、脑脊液、腹腔液、胸腔液或肺吸出物中检测到Hib细菌，则成为侵袭性Hib疾病。b型流感嗜血杆菌结合疫苗一般采用肌肉注射给药，通常有水针剂和粉针剂。但是注射给药通常需要医生的监护，注射给药针头会刺激皮肤深层神经细胞容易给人体造成痛苦，病人顺应性较差，存在感染风险等。

微针经皮免疫途径作为一种新型的经皮免疫(Transcutaneous immunization,TCI)方法，从提出到不断发展经历了几十年的时间，其特点是可以通过刺穿表皮角质层，创造出微孔道利于疫苗进入到真皮和皮下组织，进而通过毛细血管被吸收来提高生物利用度，可实现无痛给药，患者依从性好，操作简单方便。按照微针的结构和释药方式，微针可以分为实心不溶性微针、涂层微针、可溶性微针、空心微针四类。其中可溶性微针具有刺入人体皮肤后可自行溶解，避免了固体实心微针针头断裂以及涂层微针载药量小等问题、适合递送水溶性等生物大分子等优点，具有很好的应用前景。

申请号为CN201310071361.0、CN201620500195.0的中国专利分别提供了一种缓释可溶性微针及制备方法，但是该技术不适合接种次数少的疫苗和接种需立即释放的疫苗。

申请号为CN201710854856.9的中国专利提供了一种速释可溶性微针及制备方法，但是该技术没有添加相应的佐剂，导致免疫接种效果差和浪费更多的抗原疫苗。

佐剂是一种加入疫苗后能显著增强抗原的免疫原性，而本身无免疫原性的物质，将其应用于b型流感嗜血杆菌结合疫苗，能显著增强疫苗的免疫效果，减少抗原的用量，从而有利于b型流感嗜血杆菌结合疫苗的生产效率的提高与生产成本的降低，扩大接种人群数量，更好的保护易感人群，降低疫苗生产企业因产量不足而带来的巨大压力。目前应用较为广泛的佐剂主要有：铝佐剂(氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝)、MF59佐剂等。

众所周知，绝大多数疫苗必须与佐剂联合使用才能发挥有效地免疫保护效果，而且并非全部的佐剂和疫苗的联合使用都会对免疫效果产生显著的改善。例如有研究表明，疫苗微针经皮免疫倾向于诱导更强的Th2型体液免疫应答，但对由流感嗜血杆菌引起的侵袭性疾病而言，平衡Th1/Th2型的免疫应答更重要(如外文文献：Kim Y C,Yoo D G,CompansR W,et al.Cross-protection by co-immunization with influenza hemagglutininDNA and inactivated virus vaccine using coated microneedles.Journal ofControlled Release,2013,172(2):579-588)。

亦因此，如何选择合适的佐剂加入到b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴中，开发出一种能够在皮肤组织内快速释药的可溶性微针，并实现平衡Th1/Th2型的免疫应答，提高经皮免疫效果，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明目的在于提供了一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴及其制备方法，解决了上述现有技术存在的瓶颈。

为实现上述研发思路，本发明采用的技术方案具体如下：

一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴，包括针体和基底层，所述的针体由b型流感嗜血杆菌结合疫苗、佐剂、水溶性高分子材料组成，所述的基底层为柔性高分子材料；其中，佐剂与b型流感嗜血杆菌结合疫苗的含量比为(1：1)～(2：1)，所述的佐剂为SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A中的一种或几种。

优选的，所述的水溶性高分子材料为PVP与Gantrez的混合，其中PVP与Gantrez的含量比为3:1。

优选的，所述的佐剂为SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合，三者的含量比为SPO1：黄芪多糖：3-脱-O-酰化单磷酰脂质A＝(1：1：2)～(1：2：1)。

优选的，所述的针体中还包括耐热保护剂。

更优选的，所述的耐热保护剂为海藻糖，所述的柔性高分子材料为羟丙甲纤维素。

优选的，所述的针体由b型流感嗜血杆菌结合疫苗、佐剂、水溶性高分子材料、海藻糖组成，其中佐剂与b型流感嗜血杆菌结合疫苗的含量比为1：1，佐剂为含量比为1：2：1的SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的混合，水溶性高分子材料为含量比为3:1的PVP与Gantrez的混合；所述的基底层为羟丙甲纤维素。

本发明还提供了一种速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴的制备方法，包括如下步骤：

1)针体溶液的制备：将处方量的水溶性高分子材料、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、佐剂均用水溶解，均一混合后，作为针体基质溶液；

2)基层溶液的制备：将处方量的柔性高分子材料用水溶解，作为基底溶液；

3)可溶性微针的制备：将针体溶液注入到微针阴模中，4000rpm离心20min，刮去多余的针体溶液，放入常温干燥箱中干燥1h，再加入基层溶液，再次4000rpm离心20min，并将微针阴模常温干燥24h，脱模，即得。

本发明中，所述微针针体形状可以为圆锥形、多棱锥、柱状等一种或几种，优选为圆锥形；所述的针部底部直径为100-500μm；针体高度为100-2000μm。

本发明提供的速释b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴，与现有技术相比，创新性在于：

该微针采用适当比例的SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A组合物作为佐剂，与经典的铝佐剂相比具有显著的免疫增强效果，可以有效提高疫苗抗原的抗体水平、细胞因子分泌水平等体液免疫和细胞免疫水平，实现平衡Th1/Th2型的免疫应答。此外，该微针采用可溶性生物降解材料制备微针，实现b型流感嗜血杆菌结合疫苗在皮肤组织内快速释放。

附图说明

图1为本发明b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针结构示意图。

图2为本发明b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针制备流程图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明中的附图，对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入到了本发明的保护范围。

实施例1：无佐剂加入的b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴片的制备

采用如下方法制得：

1)针体溶液的制备：将所述水溶性高分子材料(以PVP和Gantrez为例，按含量比为3：1计，但不限于此)、b型流感嗜血杆菌结合疫苗等用水溶解，作为针体基质溶液。

2)基层溶液的制备：将所述柔性高分子材料(以羟丙甲纤维素为例，但不限于此)用水溶解，作为基底溶液。

3)可溶性微针的制备：将针体溶液注入到微针阴模中，4000rpm离心20min，刮去多余的针体溶液，放入常温干燥箱中干燥1h，再加入基层溶液，再次4000rpm离心20min，把微针阴模放到常温干燥箱中常温干燥24h，脱模，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针。

表1不同针体基质材料配比的处方

根据上表1不同针体基质材料配比的处方制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴片，通过下面的实施例2中进行的微针贴片皮内溶解实验用于微针针体的水溶性高分子材料及配比的筛选。

实施例2：实施例1制得的可溶性微针贴在皮内溶解性能比较

根据上述实施例1不同处方制得b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针后，利用拇指将微针按入不同的6只大鼠皮内后，分别在0.2min，0.5min，1min，2min，3min，4min、5min、6min、7min等时间点将微针拔出，通过显微镜观察微针的皮内溶解情况。结果见表2。

表2各微针皮内溶解情况(n＝6)

从表2中可知，2号处方在微针皮内溶解速率优于其他处方，故针体中的水溶性材料选择PVP与Gantrez的混合，且两者的含量比为3：1。

实施例3：含佐剂的b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴片的制备

参考实施例1和2，采用如下方法制得：

1)针体溶液的制备：将所述水溶性高分子材料PVP和Gantrez(按含量比为3：1计)、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、耐热保护剂(以海藻糖为例，但不限于此)和佐剂(见表3中的佐剂处方)用水溶解，作为针体基质溶液。本实施例中，为剔除不必要的影响因素，限定水溶性高分子材料、耐热保护剂的含量为固定值，以方便统计，但不限于此。

2)基层溶液的制备：将所述柔性高分子材料(以羟丙甲纤维素为例，但不限于此)用水溶解，作为基底溶液。

3)可溶性微针的制备：将针体溶液注入到微针阴模中，4000rpm离心20min，刮去多余的针体溶液，放入常温干燥箱中干燥1h，再加入基层溶液，再次4000rpm离心20min，把微针阴模放到常温干燥箱中常温干燥24h，脱模，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针。

表3不同佐剂配比的处方

实施例4：含不同佐剂的b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴片的活性及体内免疫原性比较

(1)b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针活性检测

按上述实施例3不同处方制得b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针后，将微针针体溶解于生理盐水中，疫苗活性检测采用免疫双扩散法，运用b型流感嗜血杆菌的超免血清和破伤风类毒素抗体检测微针中Hib结合疫苗中的疫苗活性。以Hib结合疫苗均能分别与b型流感嗜血杆菌超免血清和破伤风类毒素抗体形成沉淀线为正常。检测结果见表4。

(2)b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针免疫原性检测

按上述实施例3不同处方制得b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针后，采用小鼠为模型证实结合疫苗的免疫原性。

选用SPF级小鼠，每组十只，所有实验组，豚鼠背部脊柱两侧，经电动除毛器，去除体毛，空白盐水注射组、其余各组分别用手将给药微针贴片按压于小鼠背侧皮肤3min，后将微针贴片用亚敏胶布固定贴附于背侧皮肤，并于4小时后，剥离贴片及压敏胶。于1、14天皮下注射2次，第21-28天采血。采用Elisa法测定HibIgG抗体，以生理氯化钠溶液对照组。用含2μg/ml Hib PRP-酪胺的包被缓冲液包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜；用含20％小牛血清的PBS 37℃孵育1h；样品倍比稀释后加入酶标板，100μl/孔，37℃孵育1h；标准品含抗HibPRP抗体20μg，以其绘制标准曲线，2份质控血清抗体含量分别为2.000和8.987μg/ml；再加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h；加入底物溶液100μl，37℃孵育1h；以50μl终止液终止反应，酶标仪读取A405值，并分析血清中针对Hib的特异性IgG1和IgG2a抗体的比例，试验结果见表4。

表4各微针疫苗的活性及体内免疫原性比较(mean％±SD％,n＝10)

注：与空白组相比，△P<0.05；与阳性对照组相比，*P<0.05；

结论：

1)与空白组比较，编号3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9实验组均可显著增加微针疫苗免疫活性(P<0.05)，而其他实验组与空白组差异不明显(P>0.05)，无统计学意义；

2)与阳性对照比较，编号3.4、3.6、3.7、3.8、3.9实验组均可显著增加微针疫苗免疫活性，具有显著性差异(P<0.05)，而其他实验组与阳性对照组差异不明显(P>0.05)，无统计学意义。

3)采用SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A组合构成的佐剂(编号3.6与3.7实验组)，所制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗可溶性微针贴的HibIgG抗体水平含量高，免疫效果好，表明前述三个成分组合使用的佐剂效果要优于两者组合或单个使用；且佐剂与疫苗的含量比为(1：1)～(2：1)。

4)编号为3.6实验组为最优处方，即SPO1、黄芪多糖、3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的最优含量比＝1：1：2，佐剂和疫苗的最优含量比＝1：1。

5)编号为3.6实验组，其IgG2a/IgG1的比例明显高于其他组，并且最靠近1，表明平衡Th1/Th2型的免疫应答的效果最佳；而且，从IgG抗体的数值可以看出免疫的效果最佳。