阅读说明：本技术 米曲霉lccc30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用 (Application of aspergillus oryzae LCCC30141 in production of neutral protease and tobacco leaf fermentation ) 是由 叶亚军 张庆华 田数 赵新海 陈晨 陈飞 张永岗 于宏男 刘月明 *** 李力群 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用,米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141能够产生高酶活性的中性蛋白酶,利用米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141生产中性蛋白酶,为中性蛋白酶的生产来源提供了一个新的途径,可以实现中性蛋白酶的规模化生产；将具有产高酶活力的中性蛋白酶的米曲霉应用到烟叶发酵中,能够加速烟叶中蛋白质的分解,明显缩短烟叶的发酵周期,提升烟叶的品质。(The invention provides application of Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) LCCC30141 in production of neutral protease and tobacco fermentation, wherein the Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) LCCC30141 can produce neutral protease with high enzyme activity, and the Aspergillus oryzae (Aspergillus oryzae) LCCC30141 is used for producing the neutral protease, so that a new way is provided for the production source of the neutral protease, and the scale production of the neutral protease can be realized; the aspergillus oryzae with the neutral protease capable of producing high enzyme activity is applied to the fermentation of the tobacco leaves, so that the decomposition of protein in the tobacco leaves can be accelerated, the fermentation period of the tobacco leaves is obviously shortened, and the quality of the tobacco leaves is improved.)

米曲霉LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用

技术领域

本发明涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的技术领域。

背景技术

中性蛋白酶又名沙雷肽酶，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，能将动植物中的大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。米曲霉属于曲霉属，黄曲霉群米曲霉种，是我国酿造业的主要菌种，它具有蛋白酶活力高，生长快，适应性强，安全无毒等优点，是生产中性蛋白酶的优良菌株。

目前，烟叶的发酵多数采用自然发酵与人工发酵。自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，它的主要特点是在烟叶贮藏期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法。但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。

现有技术CN105950481B公开了一种米曲霉Aspergillus oryzae HGD12菌株，该米曲霉HGD12菌株高产蛋白酶，其酸性蛋白酶活大于1000U/g，碱性蛋白酶活大于10000U/g，中性蛋白酶活大于9000U/g，但该菌株主要具有高酶活性的碱性蛋白酶。现有技术中未见利用已有的米曲霉菌株用来生产高活性中性蛋白酶及在烟叶发酵中的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用，米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141能够高产中性蛋白酶，十分适用于生产中性蛋白酶和烟叶发酵。

一方面，本发明提供了米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶中的应用，米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141能够产生高酶活性的中性蛋白酶，为中性蛋白酶的生产来源提供了一个新的来源。

另一方面，本发明还提供了利用米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141生产中性蛋白酶的方法，该方法包括将米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141进行发酵培养，得粗酶液的步骤。

优选的，所述发酵培养为液体发酵培养或固体发酵培养。

液体发酵培养的条件：接种量为10⁵-10⁷cfu/ml，发酵温度为20～40℃，时间为2～4d，所得发酵液为粗酶液；

优选的，接种量为10⁶cfu/ml，发酵温度为30℃，时间为3d；

优选的，所述发酵培养为通风培养，通风量为1:0.4～0.6V/V·min；

优选的，通风量为1:0.5V/V·min；

优选的，液体发酵培养所用的液体发酵培养基含有：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH 6.5-7.0。

优选的，所述固体发酵培养采用三级发酵工艺，具体包括以下步骤：

(1)在斜面PDA培养基上培养米曲霉LCCC30141菌种，得到菌悬浮液；

(2)将菌悬浮液接种于液体菌种培养基上扩大培养，得到种子液；

(3)将种子液以10⁵-10⁷cfu/g接种于固体培养基，温度20～40℃培养2～4d，加入生理盐水浸提后，抽滤，所得滤液为粗酶液；

优选的，PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L；

和/或液体菌种培养基含有：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH 6.5-7.0；

和/或固体培养基含有：麸皮40％、豆粕10％、磷酸氢二钠0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸铵0.2％；

进一步的，该方法还包括在粗酶液中加入硫酸铵沉淀，沉淀溶解后经透析、离心、冷冻干燥后，得酶粉的步骤。

优选的，硫酸铵的饱和度为60～80％；

优选的，离心的温度为0～4℃，转速为5000～8000r/min，时间为10～30min。

另一方面，本发明还提供了米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141或所述的方法在烟叶发酵中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141进行发酵。

优选的，米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。

本发明的有益效果为：

本发明公开了米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141能够产生高酶活性的中性蛋白酶，为中性蛋白酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现中性蛋白酶的规模化生产；将具有产高酶活力的中性蛋白酶的黑曲霉应用到烟叶发酵中，能够加速烟叶中蛋白质的分解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。

本发明中，如未指定，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本发明使用的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为：LCCC30141。

实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1利用米曲霉LCCC30141发酵生产中性蛋白酶

米曲霉LCCC30141液体发酵工艺

综合单因素多水平、多因素多水平正交试验结果，确定米曲霉LCCC30141的液体发酵工艺：

菌种制备：将斜面菌种用无菌水制成孢子悬液，孢子悬液菌数为10⁷cfu/mL。

液体培养基：培养基配方为麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH 6.5-7.0，培养基装量为罐体容积的75％。

发酵罐培养基灭菌：121℃，2h。

接种：利用火焰圈无菌接种，接种量为10％。

液体培养：培养温度30℃，通风培养60-65h，搅拌速度180rpm，通风量为1:0.5(v/v·min)。

米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141固体发酵工艺

米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141固体发酵工艺采用三级发酵工艺：斜面菌种—液体菌种—固体培养。

(1)斜面菌种：采用PDA培养基，培养72h。

(2)液体菌种：培养基配方为：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH 6.5-7.0。

通风培养48-50h，通风量为1:0.5(V/V·min)。

(3)固体培养：培养基配方为：将麸皮与豆粕按4:1比例混匀后，按照1：1的质量加入蒸馏水，每1000g固体培养基中加入磷酸氢二钠1g、硫酸镁0.5g、硫酸铵2g，初始pH值自然。250ml的三角瓶中装入10g。

灭菌：0.1MPa、121℃，灭菌50min；

接种量：10⁸cfu/100g固体培养基；

培养温度：30±2℃；

培养周期：72h。

测得发酵上清液的酶活为：2480U/g。

中性蛋白酶分离纯化

粗酶液的制备

准确称取固体发酵产品，按重量的5倍添加生理盐水，用高效组织捣碎机捣碎搅拌均匀，于40℃恒温振荡器以100r/min速度浸提30min。浸提液用真空过滤泵抽滤，所得滤液即为粗酶液。

中性蛋白酶粗酶制备

采用硫酸铵沉降法。

向2L粗酶液中加入硫酸铵至70％饱和度，4℃放置过夜。离心弃上清液，用预冷的蒸馏水溶解沉淀得溶解液100mL。此溶液4℃下对预冷蒸馏水透析24h，6000r/min、20min离心，得上清液。将此上清液冷冻干燥，得酶粉，酶活力单位大于50000U/g。

实施例2米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在烟叶发酵中的应用

将米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141接种于烟叶，米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为40～70％，时间为7～14d。

或将实施例1得到的米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141的发酵液或其酶粉添加到烟叶中，用于发酵，加入的发酵液在烟叶中的中性蛋白酶酶活力为10-20U/mg，发酵条件为：温度20～40℃，湿度为40～70％，时间为7～14d。

本发明以2018重庆B4F原烟作为对照组，以加入10⁶cfu/g的米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141作为处理组1，或加入制得的15U/mg的中性蛋白酶的酶粉作为处理组2，来发酵烟叶，发酵的温度为30℃，湿度为55％，时间为10d，明显缩短了烟叶的发酵周期，烟叶中各化学成分的变化如表1所示。

由表1可知，加入米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141或中性蛋白酶酶粉后，烟叶中还原糖、硫、木质素有明显的减少，明显改善了烟叶的品质。

表1各处理中烟叶的化学成分

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。