阅读说明：本技术 一种用于γ-D谷氨酰肽合成的酶及γ-D谷氨酰肽的合成方法 (Enzyme for synthesizing gamma-D glutamyl peptide and synthesis method of gamma-D glutamyl peptide ) 是由 杨娟 周威佃 曾晓房 白卫东 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及小分子肽制备技术领域,具体公开了一种用于γ-D谷氨酰肽合成的酶及γ-D谷氨酰肽的合成方法。所述的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶,其特征在于,通过如下方法制备得到,(1)将枯草芽孢杆菌中的谷氨酰胺酶基因片段转录到大肠杆菌中,然后将大肠杆菌接种到发酵培养基中培养,取发酵液经离心、过滤后取上清液得粗酶液；(2)在水中加入谷氨酰胺,然后调节pH值至碱性,再加入粗酶液,进行反应即得所述的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶。本发明所述的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶用于γ-D谷氨酰肽的合成过程中可以杜绝副产物的生成以及提高γ-D谷氨酰肽的合成产率,为γ-D谷氨酰肽的大规模工业化生产提供了一种新的方法。(The invention relates to the technical field of preparation of small molecule peptides, and particularly discloses an enzyme for synthesizing gamma-D glutamyl peptide and a synthesis method of the gamma-D glutamyl peptide. The enzyme for synthesizing the gamma-D glutamyl peptide is characterized by being prepared by the following method, (1) transcribing a glutaminase gene fragment in bacillus subtilis into escherichia coli, then inoculating the escherichia coli into a fermentation culture medium for culture, centrifuging and filtering fermentation liquor, and taking supernate to obtain crude enzyme liquid; (2) adding glutamine into water, then adjusting the pH value to be alkaline, then adding crude enzyme liquid, and reacting to obtain the enzyme for synthesizing the gamma-D glutamyl peptide. When the enzyme for synthesizing the gamma-D glutamyl peptide is used in the synthesis process of the gamma-D glutamyl peptide, the generation of byproducts can be avoided, the synthesis yield of the gamma-D glutamyl peptide can be improved, and a novel method is provided for large-scale industrial production of the gamma-D glutamyl peptide.)

一种用于γ-D谷氨酰肽合成的酶及γ-D谷氨酰肽的合成方法

技术领域

本发明涉及小分子肽制备技术领域，具体涉及一种用于γ-D谷氨酰肽合成的酶及γ-D谷氨酰肽的合成方法。

背景技术

γ-D-glutamyl-L-tryptophan(SCV-07)作为一种免疫调节肽，具有多种生理功能，如作为一种临床治疗药物，可治疗肺结核病和减轻头颈部癌症患者在放射性化疗过程中引起的口腔黏膜炎；抑制白血病、淋巴瘤、单纯疱疹病毒2型、头颈部肿瘤等多种肿瘤细胞系的生长；可激发T-淋巴细胞***及特异性免疫应答，增加老鼠的白细胞介素2和干扰素的产生刺激。

γ-谷氨酰肽广泛存与多种动植物和微生物中，与生物体的代谢活动和生理功能有关。大部分γ-谷氨酰肽具有镇定减压、舒缓疲劳、抗癌解毒、络合重金属离子、维持细胞金属离子平衡等特殊生理功能。如γ-Glu-Cys作为谷胱甘肽的前体物质，具有多种类似谷胱甘肽的生理活性。如在急性胰腺炎中具有抗炎作用，静脉注射γ-Glu-Cys和γ-Glu-D-Cys可以防御脑部缺血性中风用药过程出现的再灌注损伤，稳定大脑血管，免于在溶栓过程中出现的伤害。γ-Glu-Cys和γ-Glu-Val可用于慢性炎症性疾病如炎症性肠病(IBD)的治疗。已知药物的γ-谷氨酰基化可增加药物的亲和力以及效能，如对血管活性肠肽(VIP)进行γ-谷氨酰基化后其抗氧化能力得到增加。Liraglutide，是一种胰高血糖素样肽的类似物，可抑制DPP-4酶酶活，用于二型糖尿病的治疗过程，研究发现γ-谷氨酰基化后Liraglutide药效时长增加。γ-谷氨酰化合物可作为药物前体物，在体内经过GGT酶的催化作用后可释放相应药物，如γ-Glu-皮啡肽进入体后在体内GGT酶的催化作用下可释放皮啡肽。低溶解性的氨基酸经过γ-谷氨酰基化后溶解度增加，如酪氨酸经过γ-谷氨酰基化后生成的γ-Glu-Tyr可替代酪氨酸而作为全胃肠外营养(TPN)补充剂。

目前，γ-谷氨酰肽的制备方法主要有提取法，化学合成法和γ-谷氨酰胺转肽酶合成法等。但现有的合成方法中，存在副产物多，以及反应产率不高的问题；因此，限制了γ-谷氨酰肽大规模工业化生产。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于，提供一种用于γ-D谷氨酰肽合成的酶；所述的酶为全新方法制备得到，能够减少γ-D谷氨酰肽合成中副产物的产生。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种用于γ-D谷氨酰肽合成的酶，其通过如下方法制备得到，

(1)将枯草芽孢杆菌中的谷氨酰胺酶基因片段转录到大肠杆菌中，然后将大肠杆菌接种到发酵培养基中培养，取发酵液经离心、过滤后取上清液得粗酶液；

(2)在水中加入谷氨酰胺，然后调节pH值至碱性，再加入粗酶液，进行反应即得所述的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶。

优选地，步骤(1)中所述的发酵培养基中包含如下重量百分比的组分：3～5％豆粕、1～3％麸皮、1～3％玉米粉。

最优选地，步骤(1)中所述的发酵培养基中包含如下重量百分比的组分：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉。

优选地，步骤(1)中大肠杆菌的接种量为发酵培养基总重量的0.5～2％。

最优选地，步骤(1)中大肠杆菌的接种量为发酵培养基总重量的1％。

优选地，步骤(1)中所述的培养是指在37～39℃下发酵培养24～36h。

优选地，步骤(2)中谷氨酰胺、粗酶液以及水的用量比为80～120mM：3～5g：100g。

最优选地，步骤(2)中谷氨酰胺、粗酶液以及水的用量比为100mM：4g：100g。

优选地，步骤(2)中所述的反应是指在38～42℃下反应3～5h。

本发明还提供一种γ-D谷氨酰肽的合成方法，其包含如下步骤：

将D-谷氨酰胺与L-氨基酸混合后溶于水中，然后调节pH值至碱性，添加用于γ-D谷氨酰肽合成的酶进行反应，即得所述的γ-D谷氨酰肽。

优选地，D-谷氨酰胺、L-氨基酸与水的用量比为100mM：50～1000mM：100g。

最优选地，D-谷氨酰胺、L-氨基酸与水的用量比为100mM：100～200mM：100g。

优选地，用于γ-D谷氨酰肽合成的酶的添加量与水的重量用量比为0.03～0.1：100。

最优选地，用于γ-D谷氨酰肽合成的酶的添加量与水的重量用量比为0.05：100。

优选地，所述的反应是指在30～55℃下反应1～12小时。

最优选地，所述的调节pH值至碱性是指调节pH值至8.0～11.0。

优选地，所述的L-氨基酸选自L-色氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-组氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-酪氨酸中的一种或多种。

有益效果：本发明通过全新的方法合成了一种全新的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶。该酶用于γ-D谷氨酰肽的合成过程中可以杜绝副产物的生成，以及提高γ-D谷氨酰肽的合成产率，为γ-D谷氨酰肽的大规模工业化生产提供了一种新的方法。

附图说明

图1为γ-D-glutamyl-L-tryptophan的一级质谱图。

图2为γ-D-glutamyl-L-tryptophan的二级质谱图。

图3为γ-D-glutamyl-L-tryptophan的核磁共振图。

图4为副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan的一级质谱图。

图5为γ-D-Glu-L-Ile的二级质谱图。

图6为γ-D-Glu-L-Val的二级质谱图。

图7为γ-D-Glu-L-Tyr的二级质谱图。

图8为γ-D-Glu-L-Leu的二级质谱图。

图9为γ-D-Glu-L-Phe的二级质谱图。

图10为γ-D-Glu-L-Met的二级质谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例中采用UPLC-MS/MS对反应产物进行定性分析：包括：AnAgilent1290series UPLC system(Agilent Technologies)用于分离各γ-D-glutamyl-L-peptides,带有ESI的质谱系统(Q-TOF MS/MS，Bruker Daltonics)进行定性分析。色谱柱为：a Agilent ZORBAX RRHD SB-C18(2.1x 50mm,1.8μm)，进样量为5μL。液相条件为：溶液A：0.1％甲酸-水，和溶液B：0.1％甲酸-乙腈,梯度洗脱程序为：0–10％B,0-5.0min；10-15％B,5.0-10.0min；然后100％B,10.0-12.0min。MS条件：Ionization(离子化)：正离子模式；Drying gas(干燥气体)：350℃下10L/min；Nebulizer(喷雾器压力)：25psig；Fragmentor(毛细管电压)：30V。

实施例中采用HPLC液相对反应产物进行定量分析：分析柱：XSelect HSS T35μm4.6x 250mm；流动相：A液：0.1％(V/V)甲酸-水溶液；B液：0.1％(V/V)甲酸-乙腈溶液；柱温：40℃，流速：1mL/min。进样量10μL。流动相进行梯度变化如表1所示。

表1.流动相进行梯度条件

<u>Time/min</u>	<u>0</u>	<u>5</u>	<u>10</u>	<u>15</u>	<u>20</u>
						<u>A/％</u>	<u>90</u>	<u>85</u>	<u>20</u>	<u>90</u>	<u>90</u>

实施例1用于γ-D谷氨酰肽合成的酶的制备

(1)将枯草芽孢杆菌中的谷氨酰胺酶基因片段转录到大肠杆菌中，然后将大肠杆菌接种到发酵培养基中在37～39℃下发酵培养32h，取发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤取上清液得粗酶液；

所述的发酵培养基中包含如下重量百分比的组分：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉，92％水；37～39℃发酵培养30h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。大肠杆菌的接种量为发酵培养基总重量的1％。

(2)在100g水中加入谷氨酰胺100mM，然后调节pH值至10.0，再加入粗酶液4g，在40℃下反应4h即得所述的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶。

实施例2γ-D-glutamyl-L-tryptophan的合成

将D-谷氨酰胺100mM与L-氨基酸100mM混合后溶于100g水中，然后调节pH值至10.0，添加0.05g用于实施例1制备得到的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶在37℃下反应3小时，即得所述的γ-D-glutamyl-L-tryptophan。由图1的产物的一级质谱图、图2产物的二级质谱图以及图3产物的核磁共振图可以看出，本实施例成功合成了γ-D-glutamyl-L-tryptophan。经检测，本实施例制备得到的产物全部为γ-D-glutamyl-L-tryptophan，并无副产物生产，其产量为88.76mM，其相对L-色氨酸的产率为88.76％。

由此可见，采用本发明制备得到的γ-D谷氨酰肽合成的酶无副产物产生，产率高；且反应条件温和，在37℃下反应3小时即可完成；因此，该方法可以用于γ-D谷氨酰肽的大规模工业化生产。

对比例1γ-D-glutamyl-L-tryptophan的合成

将D-谷氨酰胺100mM与L-氨基酸100mM混合后溶于100g水中，然后调节pH值至10.0，添加0.05g粗酶液(实施例1步骤(1)制备得到)在37℃下反应3小时，即得产物。经分析，产物中除了含有γ-D-glutamyl-L-tryptophan外，还含有大量的副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan；副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan的一级质谱图如图4所示。经分析，本对比制备得到的γ-D-glutamyl-L-tryptophan的产量为33.75mM，其相对L-色氨酸的产率为33.75％；副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan的产率为19.57mM，其相对L-色氨酸的产率为19.57％。

由对比例1可知，对比例1在γ-D-glutamyl-L-tryptophan的合成中使用的是实施例1步骤(1)的粗酶液；结果表明，其比实施例1制备得到的γ-D-glutamyl-L-tryptophan的产率大幅降低，且出现了大量的副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan。这说明实施例1中步骤(1)的粗酶液必须经过与谷氨酰胺反应的步骤(2)才能得到高效且无副产物的用于合成γ-D-glutamyl-L-tryptophan的酶。

对比例2γ-D-glutamyl-L-tryptophan的合成

将D-谷氨酰胺100mM与L-氨基酸100mM混合后溶于100g水中，然后调节pH值至10.0，添加0.05g谷氨酰胺酶(日本Amano公司生产，活力为100GTU/g)在37℃下反应3小时，即得产物。

经分析，产物中除了含有γ-D-glutamyl-L-tryptophan外，同样还有大量的如图4一级质谱图所示结构的副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan。经分析，本对比制备得到的γ-D-glutamyl-L-tryptophan的产量为58.54mM，其相对L-色氨酸的产率为58.54％；副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan的产率为11.32mM，其相对L-色氨酸的产率为11.32％。

由对比例2可知，采用常用的谷氨酰胺酶用于γ-D-glutamyl-L-tryptophan的合成同样会存在副产物γ-D-glutamyl-γ-D-glutamyl-L-tryptophan；且其产率也仅仅为58.54％；远远小于采用实施例1用于γ-D谷氨酰肽合成的酶的产率。由此可见，采用本发明所述的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶相对于现有技术而言，一方面可以大幅提高产率，另一方面可以杜绝副产物的产生，减少了后期副产物处理的难题。

实施例3其它γ-D谷氨酰肽的合成

将D-谷氨酰胺100mM与不同的L-氨基酸(L-Leu、L-Ile、L-Val、L-Met、L-Phe和L-Tyr)100mM混合后溶于100g水中，然后调节pH值至10.0，添加0.05g实施例1制备得到的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶在37℃下反应3小时，即得γ-D-Glu-L-Ile,γ-D-Glu-L-Val、γ-D-Glu-L-Tyr、γ-D-Glu-L-Leu、γ-D-Glu-L-Phe和γ-D-Glu-L-Met。γ-D-Glu-L-Ile,γ-D-Glu-L-Val、γ-D-Glu-L-Tyr、γ-D-Glu-L-Leu、γ-D-Glu-L-Phe和γ-D-Glu-L-Met的二级质谱图分别如图5～10所示。

实施例3试验表明，实施例1制备得到的用于γ-D谷氨酰肽合成的酶除了可以有效合成γ-D-glutamyl-L-tryptophan外，同样还可以合成其它γ-D谷氨酰肽。