一种暗脉obv基因及其应用
阅读说明：本技术 一种暗脉obv基因及其应用 (Dark pulse obv gene and application thereof ) 是由 刘磊 鹿京华 李君明 李鑫 杜永臣 国艳梅 黄泽军 王孝宣 舒金帅 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种新的暗脉基因obv,该暗脉基因为编码C2H2L结构域的锌指类转录因子,该基因主要在叶脉中的维管束和周围的栅栏组织里表达,并定位于细胞核。本发明的暗脉基因obv能够提高叶脉叶绿素含量、光合速率、气孔导度和增加叶绿体数量。本发明的obv基因参与调节番茄叶片的叶绿体发育和光合作用的调控,可为高光效番茄遗传改良提供了理论依据和技术支撑。本发明的obv基因可提高番茄的产量和可溶性固形物含量,对番茄的优质高产具有重要意义,可应用于番茄杂种优势新品种的培育,具有巨大的开发利用价值,市场应用前景广阔。(The invention provides a novel dark vein gene obv, which is a zinc finger transcription factor encoding C2H2L structural domain, is mainly expressed in vascular bundles in veins and surrounding palisade tissues and is positioned in cell nucleus. The dark vein gene obv can improve the chlorophyll content of veins, the photosynthetic rate, the stomatal conductance and increase the chloroplast quantity. The obv gene of the invention participates in the regulation and control of chloroplast development and photosynthesis of tomato leaves, and can provide theoretical basis and technical support for genetic improvement of high-photosynthetic-efficiency tomatoes. The obv gene can improve the yield and the soluble solid content of the tomato, has important significance for the high quality and the high yield of the tomato, can be applied to the cultivation of new species of the heterosis of the tomato, has great development and utilization values and has wide market application prospect.)
技术领域
本发明涉及一种暗脉obv基因及其应用。本发明采用正向遗传学方法，克隆到控制番茄暗脉基因obv，通过CRISPR/Cas9敲除技术敲除obv基因，使明脉番茄叶片出现暗脉；及通过超表达obv基因，使暗脉番茄叶片出现明脉，证实了该基因的功能。还涉及含有该基因和其它物种的同源基因的载体，以及涉及利用该基因或其功能类似物调控植物叶脉变化和叶绿素含量。
背景技术
叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要器官，光合作用是植物生长发育的基础，也是产量和品质的主要决定因素，叶片相关性状是作物遗传改良的关键性状之一。
番茄原产于南美洲的安第斯山脉、厄瓜多尔海岸以及秘鲁，经过几百年的驯化和改良，番茄成为世界上最重要的蔬菜之一，在全球范围内广泛种植。番茄叶片为复叶，在进化过程中形成了很多变异，但叶脉的变异却十分有限。生产中发现一个自然突变的暗脉obv(Obscuravenosa)基因，在干旱、高光强环境条件下，如美国加州和我国新疆等地区，可有效提高叶片的光合效率和气孔导度，增加果实产量，并对高光照表现出更强的可塑性，因此，在育种过程中被很好地固定在加工用的番茄品种中。
野生种番茄叶脉均表现为透明叶脉，即明脉，暗脉obv基因突变可能来源于十九世纪二十年代一个品种Earliana，该性状为单隐性基因控制，是由于叶脉叶绿素含量增加而引起，对于叶片气体交换相关性状具有明显增益，可明显提高水分利用率和产量。番茄叶脉明暗是由于叶脉中叶绿素含量高低引起的，番茄下表皮细胞和叶肉细胞周围通常没有叶绿体，暗脉番茄材料却相反。其次，番茄暗脉表型是由于叶片中缺乏维管束鞘延伸(BundleSheath Extensions,BSEs)引起的，暗脉叶片栅栏组织在上表皮具有连续性，而明脉的栅栏组织是不连续的。
番茄是重要的世界性蔬菜作物，我国是世界第一大生产国，栽培面积约1600多万亩，年产值1800亿。番茄暗脉基因obv的应用，对番茄高光合效率品种的遗传改良，提高番茄的产量和品质具有重要意义。但该基因目前尚未克隆，其功能尚未清楚，限制了该基因的进一步应用。该基因的研究对高光效番茄的遗传改良具有重要意义，还对揭示番茄维管束鞘的分化、形成和发育以及C3作物番茄的光合调控机制与光合系统的进化研究将有极大的推动作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种暗脉基因obv及其应用。
根据本申请的一个方面，本发明提供了一种暗脉基因obv，所述暗脉基因obv的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
作为本申请的一个
具体实施方式
，所述暗脉基因obv的编码序列如SEQ ID No：2所示。
作为本申请的一个具体实施方式，所述暗脉基因obv的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
根据本申请的另一个方面，本发明还提供了所述的暗脉基因obv在调控植物叶脉明暗中的应用。
根据本申请的另一个方面，本发明还提供了所述的暗脉基因obv在调控植物光合速率中的应用。
根据本申请的另一个方面，本发明还提供了所述的暗脉基因obv在植物遗传育种中的应用。
作为本申请的一个优选实施方式，所述植物选自番茄、辣椒、茄子和黄瓜中的至少一种。
作为本申请的一个具体实施方式，所述植物为番茄。通过控制obv基因或其同源基因在番茄中的表达量来控制番茄叶片、叶脉与维管束鞘中叶绿色含量，从而增强光合效率，达到增产优质的目的。
实现本发明的技术具体如下：
1.明确番茄叶脉为暗脉的鉴定
番茄叶脉明脉和暗脉的表型鉴定(图1)，番茄叶片叶脉的石蜡切片鉴定(图2)。
2.番茄自然群体的全基因组关联分析(GWAS)
利用广泛收集的299份加工番茄种质材料为自然群体，通过对其进行表型观察记录，结合全基因组重测序数据，完成全基因组关联分析。明确了obv基因位于5号染色体长臂的末端，并于SP5G连锁(图3)。
3.番茄明暗脉基因obv的遗传定位
利用番茄明脉材料和暗脉材料构建F2分离群体，通过构建连锁图谱，完成obv基因的精细定位。根据重组单株的基因分型和表型鉴定结果，最终将obv基因定位到第5号染色体分子标记SNP20和SNP24之间，区间大小约为24.141kb(图4)。分子标记SNP20和SNP24的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
4.确定突变位点，获得候选基因
利用SGN网站(https://solgenomics.net)，在定位的24.141kb区间内进行基因预测，结合序列变异分析，发现Solyc05g054030的第三个外显子上存在1个碱基G替换为A的突变，位于CDS区第404个碱基，最终将Solyc05g054030确定为候选基因，该基因属于C2H2类型的锌指结构转录因子，包含4个外显子，CDS区长1,149bp，翻译381个氨基酸，CDS区第404个碱基处存在碱基G突变成A，导致精氨酸(R)变为组氨酸(H)。
5.obv基因的功能验证
Crispr/Cas9敲除实验验证obv基因功能。以pMGET(pKSE401-S)载体为骨架载体，采用T4连接法构建CRISPR/Cas9载体，以明脉番茄Micro-Tom为材料，获得转基因植株。与野生型Micro-Tom的叶脉为明脉相比，转基因株系的叶脉都是暗脉(图6)。同时，转基因植株叶片叶脉的叶绿素含量明显升高，叶脉维管束中叶绿体数量明显增加(图7)。
超量表达obv基因验证其功能。将obv的全长编码序列(CDS)克隆到pBI121双元载体中，采用农杆菌GV3101介导的遗传转化方法，将超表达载体转化到暗脉番茄M82中，获得转基因植株。与野生型M82相比，转基因植株叶片的主脉和侧脉都呈现明脉表型(图8)。说明obv具有具有调控叶脉明暗的功能。
6.obv基因的应用
通过Crispr/Cas9基因编辑或超表达等结合农杆菌介导的遗传转化方法，可以改变叶脉的明暗，进而可以改变番茄叶片和维管束鞘叶绿素含量。可以根据不同番茄品种的要求，改变叶脉的明暗，形成高合效率，达到增产优质的目的。控制番茄暗脉基因obv可以在转基因番茄中应用，也可以在转基因番茄种子中应用，进行品种的遗传改良。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种新的暗脉基因obv，该暗脉基因为编码C2H2L结构域的锌指类转录因子，该基因主要在叶脉中的维管束和周围的栅栏组织里表达，并定位于细胞核。
(2)本发明的暗脉基因obv能够提高叶脉叶绿素含量、光合速率、气孔导度和叶绿体数量。本发明的obv基因参与调节番茄叶片的叶绿体发育和光合作用的调控，可为高光效番茄遗传改良提供了理论依据和技术支撑，可应用于番茄杂种优势新品种的培育，具有巨大的开发利用价值，市场应用前景广阔。
附图说明
图1番茄叶片叶脉表型观察；
图2番茄叶片叶脉石蜡切片；
图3番茄叶脉obv性状的全基因组关联分析；
图4番茄叶脉obv性状的精细定位
图5番茄明脉与暗脉叶片光合指标；
图6番茄Micro-tom及obv基因编辑植株叶片叶脉表型与石蜡切片；
图7番茄Micro-tom及obv基因编辑植株、叶脉叶绿素含量与维管束中叶绿体数量；
图8番茄M82与obv超表达植株叶脉。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
1、番茄叶片明脉与暗脉的鉴定。
两种基因型番茄材料的子叶在出芽时已经表现出不同的叶脉，随着真叶的发育，使得区分明暗脉表型更加容易。两者的叶片大小、厚度和形状差异不大，但是叶脉明暗表型差异显著，在阳光直射下，用肉眼可观察到明显的区别，如图1所示。
为进一步观察明暗脉材料的差异，采用石蜡切片观察材料明脉和暗脉叶片叶脉的横截面，可以明显看出，在明脉材料叶脉中维管束鞘延伸缺失，栅栏组织变得不连续；而在暗脉材料叶脉中维管束鞘延伸的存在，栅栏组织与叶脉保持连续状态，如图2所示。
测定明脉与暗脉番茄的光合指标，如图5所示，图5的结果表明，暗脉番茄叶片的光合速率、气孔导度和蒸腾速率分别是明脉番茄叶片的1.98倍、2.64倍和2.94倍，说明暗脉基因能够提高番茄叶片的光合效率。
1、番茄自然群体的全基因组关联分析(GWAS)
利用广泛收集的299份加工番茄种质材料为自然群体，其中包括明脉材料129份，暗脉材料163份，数据缺失7份，具体表型调查结果见附录1。通过对其进行表型观察记录，结合全基因组重测序数据，完成全基因组关联分析，如图3所示。明确了obv基因位于5号染色体长臂的末端，置信区间为SL2.50chr05：63,049,462bp-64,012,700bp，区间大小为963,238bp，并于SP5G连锁。
2、番茄明暗脉基因obv的遗传定位
利用番茄明脉材料05-62和暗脉材料05-49构建了1500株系的F2分离群体，表型鉴定符合3:1分离规律，说明暗脉性状由隐性单基因控制。根据GWAS结果，选取SNPs位点开发成KASP标记，结合表型鉴定结果，通过构建连锁图谱，完成obv基因的精细定位。根据重组单株的基因分型和表型鉴定结果，最终将obv基因定位到第5号染色体分子标记SNP20和SNP24之间，区间大小约为24.141kb，如图4所示。分子标记SNP20和SNP24的引物核苷酸序列分别表1所示。
表1
3、确定突变位点，获得候选基因
利用SGN网站(https://solgenomics.net)，在定位的24.141kb区间内进行基因预测，发现在此区域内总共3个开放阅读框。我们利用EnsemblPlants网站(https://plants.ensembl.org/Solanum_lycopersicum/Info/Index)查看上述三个基因的表达情况，发现Solyc05g054030和Solyc05g054040在叶片中表达，对上述2个基因的全长逐个测序分析表明：Solyc05g054030的第三个外显子上存在1个碱基G替换为A的突变，位于CDS区第404个碱基处，编码第135个氨基酸；；Solyc05g054040编码区序列无差异；最终将Solyc05g054030确定为候选基因，该基因属于C2H2类型的锌指结构转录因子。该基因的核苷酸序列如下所示。
SEQ ID No：1
Solyc05g054030基因序列
>SL4.0ch05 SL4.0ch05:63395462..63398588(+strand)length＝3127
ATGCTAACTAGCAACTCTTTCTTGTTTGGTGCTCCTTCTAATTATTCTGATCCATTTTCTTCCCCAGAAAATGGTTTTATTATCAAAAGAAAAAGAAGACCTGCTGGTACTCCAGGTATATATATATATTTTTAATTAATTAATTAGTATATTTTTAAAAAAAAATTAATTTACATAAATATATGAAGAAAATGGTACTTTTTTTGATAATTATGTGAAAAAACACTTGAGTTTTAGCTCTTGTGTGTCTATTATATTTCTAAATTGATCAACATGTTCAGTCAGTGACGAAAACAGAATTTTCATCAGAGGATTCATGAGGATGTAACGAAAAGAATTCAGATGAACCTCCTTTTGGCTTTTTCTATCTCCGACCTTGTGTTTTTGAATTCAGAATTTAAACGTTATAGATGAGAAAGTTGAATTATGATTTAACCTTATCTTTATAGTCAAGGGCGGAGCTATAGGTAACAAAGATTGTTTGGTTGATACAACCCCTTTCGTCAGAAAATTATATTTTTATATATTTATTTTTTAAAAAAAATTCTTAACCTAATAGATTTAATTTTTTAAAATTTTCTTAACCTAATAAATTTAGATGTGAAAATTATATTTGAATTACTGGCTCCGCTACTATTGCTAACACACATATGTTTAGGGTTATTCGACTGGTAAGAATGCTATTGAATTCTGTTGAACTCGTAATAATTAAATTTACGAATTTGCACAGATCCCGATGCACAAGTTGTATATCTTACAGCTGAGATGTTAATGGAATCTGATCGTTACGTTTGTGAAATCTGCAACCTTAGCTTTCAAAGAGAGCAAAATCTACAAATGCATCGTCGTCGCCATAAGGTTCCATGGAAGTTGAAGAAGAAGGTAGTTTAATTTATGTATAATTACGTCATCAATATATCGTCTCATCTAAAATCTTAAACTGTTCGATAGAACACAAGTTCTTCATTCGTTCAATAGGGAGTGAGTCTTCCCCTTTTTGAAAAATGAGTTAATATCATGTGTAGACGGAGAATTCATATATCTGATAAGAACAGATGTTACACTTGATCTTAGCCACAAGACCGAGAAAGATATTGATGAGAACTATACAATTTTTATTTACTAAATTATACTTTATATTTCAACACATCTCCTCACGTGCAAGTCATGAAGTTCTTCTTCTTCTTTTTTATTACGAGAACGATACATTTTAATATTTAGAATTTCTCTGTTTATTCTTACTGAAATGATTTATAATAATCACACAAATTGCTAAGGCTTAGTTTTCGACAATAATTTTCAAAAGTCTTTCAATTCTAGACGTCACTCCCCAGTTAAATATAGTCACATAAATTGTAACTGACATATTAGATTATATGATTAGATATGTTAATTTTTTTAATTAAATATAAATATAATTTCATTTACTTGATTATATTTTCAACGTGATCATCAGGAAGAAGAGAAAAATGAGATGGATCAAGTTATTAAGAAGAGAGTATATGTGTGTCCAGAGCCAAGTTGTGTGCACCATGATCCATGTCATGCATTAGGTGATCTTGTTGGAATCAAAAAACATTTTAGAAGAAAACGTAGCAATTACAAACAATGGATTTGTCAAAAATGCAACAAAGGTTATGCTGTTCAATCAGATTATAAAGCTCACATCAAAACTTGTGGTACTAGAGGCCATTCTTGTGATTGTGGAAGAGTTTTCTCTAGGTAAATTCATCTTCTTAATTATATATCTGTGTTCTGTTTTACTTGAGTCGAGAATCTATAAGAAAAAATAGAATCTATTTATCCTCATAGGAGTAAGGTTACAACGTCCTATTCAGATTCCACTAAATATGTTATTGTTATAGTAATTTTTATCATCAGCGTATCTTTATTATCTAGGTTATATTAAATATACTACTAAAAAACGTTAAAGAATTAGCTATGAAATTCGTAGCTGGTTAATTTATAACTAAATAGTCTATATCTACTAAGATTGTCTCATTATAAAATGTCATTTCTATGTAGTCAAATAGAATTAGGTTTAATTCATTGTTTAGTGATATAAATTAAATTTATAAAAATCTTTTAAGTGACTTAATAGCGTAAAAAGTAAATTTACACTATCTTATATATAAAAATTATACACATATATCAAGATGAGATTACCACATGTTACTTGAATTGGTAACATCCTTTAGGTCTAAAACCTAATGTATATATATGTCTTGTAAATGTACAAACATATTTTGTGTGCTCACATTTGAAAATTTCTTCCTTATCTATATGATTATAAAAATCACTATCTTTTTAGTTAAAAACATGAATATTATTATCAGAAAATCACTAATTTTCGACGATATTATATGAGTCAAATTCTGATAGATTTGTTGGAAATATTTTTAATTAAAAATTAGCGATTTTCTGATAGTAAATTTGAGTTATATATAGTATGTTTCTTCTAATTAATCTACTTTTTTTTTCCTCCCATTTTTATTGTGTTTTTTTTTTCAGAGTTGAAACATTTATTGAGCATCAAGATTCATGCAAACCACAAAGTACAACTACTAAAGAATGTCATGATATGCAAATACCAAAACCAATTTTCTTGCCTACTACTACAACTCATATCCCACCACATGATCAATATTCAAAAATATTGCCTAATCTTGATCTTGAGCTTTTCACTTCTCCAAATTATTTCAACCAAAACACACACAATTTTTCATCATTTGTTGATCAAAGTGATCATCATCATCATAATAATAATTACATAGTCCAAAACAATGATATTGAAGTCAAAGAAATTATTGAAGAGGCAACAACACAAGTAACAAGATTGAAAAGTGAAGCAAATGAAATACTCAAAATAGCAATGGAAGAAAAGGCAATGGCTATAGAGAAGAGACAAGAAGCAAAGTGTTTGATTGAATTAGCCAACCTTGAAATGGCAAAAGCAATGGAAATTAGACAAAGTGTTTGTGCTTCATCATCATCATCATCACATGTCATGAAGATAATAAAATGTAGTTCTTGTAATAATAAACAATTTCAAAGTGTGTCATCATCAAAAGATGCTACTTTGACTAATAATTATTATTTGTCATCTTCTATTTATAGAAGATGATGA
SEQ ID No：2
编码序列(CDS)
ATGCTAACTAGCAACTCTTTCTTGTTTGGTGCTCCTTCTAATTATTCTGATCCATTTTCTTCCCCAGAAAATGGTTTTATTATCAAAAGAAAAAGAAGACCTGCTGGTACTCCAGATCCCGATGCACAAGTTGTATATCTTACAGCTGAGATGTTAATGGAATCTGATCGTTACGTTTGTGAAATCTGCAACCTTAGCTTTCAAAGAGAGCAAAATCTACAAATGCATCGTCGTCGCCATAAGGTTCCATGGAAGTTGAAGAAGAAGGAAGAAGAGAAAAATGAGATGGATCAAGTTATTAAGAAGAGAGTATATGTGTGTCCAGAGCCAAGTTGTGTGCACCATGATCCATGTCATGCATTAGGTGATCTTGTTGGAATCAAAAAACATTTTAGAAGAAAACGTAGCAATTACAAACAATGGATTTGTCAAAAATGCAACAAAGGTTATGCTGTTCAATCAGATTATAAAGCTCACATCAAAACTTGTGGTACTAGAGGCCATTCTTGTGATTGTGGAAGAGTTTTCTCTAGAGTTGAAACATTTATTGAGCATCAAGATTCATGCAAACCACAAAGTACAACTACTAAAGAATGTCATGATATGCAAATACCAAAACCAATTTTCTTGCCTACTACTACAACTCATATCCCACCACATGATCAATATTCAAAAATATTGCCTAATCTTGATCTTGAGCTTTTCACTTCTCCAAATTATTTCAACCAAAACACACACAATTTTTCATCATTTGTTGATCAAAGTGATCATCATCATCATAATAATAATTACATAGTCCAAAACAATGATATTGAAGTCAAAGAAATTATTGAAGAGGCAACAACACAAGTAACAAGATTGAAAAGTGAAGCAAATGAAATACTCAAAATAGCAATGGAAGAAAAGGCAATGGCTATAGAGAAGAGACAAGAAGCAAAGTGTTTGATTGAATTAGCCAACCTTGAAATGGCAAAAGCAATGGAAATTAGACAAAGTGTTTGTGCTTCATCATCATCATCATCACATGTCATGAAGATAATAAAATGTAGTTCTTGTAATAATAAACAATTTCAAAGTGTGTCATCATCAAAAGATGCTACTTTGACTAATAATTATTATTTGTCATCTTCTATTTATAGAAGATGA
SEQ ID No：3
氨基酸序列
MLTSNSFLFGAPSNYSDPFSSPENGFIIKRKRRPAGTPDPDAQVVYLTAEMLMESDRYVCEICNLSFQREQNLQMHRRRHKVPWKLKKKEEEKNEMDQVIKKRVYVCPEPSCVHHDPCHALGDLVGIKKHFRRKRSNYKQWICQKCNKGYAVQSDYKAHIKTCGTRGHSCDCGRVFSRVETFIEHQDSCKPQSTTTKECHDMQIPKPIFLPTTTTHIPPHDQYSKILPNLDLELFTSPNYFNQNTHNFSSFVDQSDHHHHNNNYIVQNNDIEVKEIIEEATTQVTRLKSEANEILKIAMEEKAMAIEKRQEAKCLIELANLEMAKAMEIRQSVCASSSSSSHVMKIIKCSSCNNKQFQSVSSSKDATLTNNYYLSSSIYRR*
4、obv基因的基因敲除试验
为进一步确定番茄叶脉为暗脉的表型是由于基因Solyc05g054030的变化造成的，在野生型Micro-Tom的背景下，通过Crispr/Cas9敲除实验验证obv基因功能。以pMGET(pKSE401-S)载体为骨架载体，采用T4连接法构建CRISPR/Cas9载体，以明脉番茄Micro-Tom为材料，获得转基因植株。最终共获得12棵转基因阳性株系，最终选择其中三棵阳性植株(Cris-1、Cris-3和Cris-24)开展进一步的实验，与野生型Micro-Tom的叶脉为明脉相比，三个转基因株系的叶脉都是暗脉，如图6所示。
石蜡切片实验观察敲除突变体与野生型叶脉横截面的结果显示，转基因植株Cris-24叶脉中的栅栏组织在上表皮是连续排列的，而野生型Micro-Tom叶脉中的栅栏组织则呈现不连续的排列，如图6所示，这与之前的石蜡切片结果完全一致。
同时，对上述材料叶脉中的叶绿素含量进行检测，结果如图7所示，由图7可知，Cris-obv叶脉中Chl a和Chl b的含量都是WT的1.4倍左右，明显比野生型中的叶绿素含量高；叶脉维管束中叶绿体数量明显增加。
5、obv基因的超表达试验
为进一步验证obv基因功能，我们进行了超量表达obv基因。将obv的全长编码序列(CDS)克隆到pBI121双元载体中，采用农杆菌GV3101介导的遗传转化方法，将超表达载体转化到暗脉番茄M82中，获得转基因植株。与野生型M82相比，转基因植株叶片的主脉和侧脉都呈现明脉表型，见图8。综合敲除和过表达实验的结果，我们可以确定Solyc05g054030就是调控番茄叶片暗脉形成的目标基因，该基因具有具有调控叶脉明暗的功能。
以上对本发明所提供的一种暗脉基因obv及其应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
<110> 中国农业科学院 蔬菜花卉研究所
<120> 一种暗脉obv基因及其应用
<130> CNP210010
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6254
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
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ggtacttttt ttgataatta tgtgaaaaaa cacttgagtt ttagctcttg tgtgtctatt 3360
atatttctaa attgatcaac atgttcagtc agtgacgaaa acagaatttt catcagagga 3420
ttcatgagga tgtaacgaaa agaattcaga tgaacctcct tttggctttt tctatctccg 3480
accttgtgtt tttgaattca gaatttaaac gttatagatg agaaagttga attatgattt 3540
aaccttatct ttatagtcaa gggcggagct ataggtaaca aagattgttt ggttgataca 3600
acccctttcg tcagaaaatt atatttttat atatttattt tttaaaaaaa attcttaacc 3660
taatagattt aattttttaa aattttctta acctaataaa tttagatgtg aaaattatat 3720
ttgaattact ggctccgcta ctattgctaa cacacatatg tttagggtta ttcgactggt 3780
aagaatgcta ttgaattctg ttgaactcgt aataattaaa tttacgaatt tgcacagatc 3840
ccgatgcaca agttgtatat cttacagctg agatgttaat ggaatctgat cgttacgttt 3900
gtgaaatctg caaccttagc tttcaaagag agcaaaatct acaaatgcat cgtcgtcgcc 3960
ataaggttcc atggaagttg aagaagaagg tagtttaatt tatgtataat tacgtcatca 4020
atatatcgtc tcatctaaaa tcttaaactg ttcgatagaa cacaagttct tcattcgttc 4080
aatagggagt gagtcttccc ctttttgaaa aatgagttaa tatcatgtgt agacggagaa 4140
ttcatatatc tgataagaac agatgttaca cttgatctta gccacaagac cgagaaagat 4200
attgatgaga actatacaat ttttatttac taaattatac tttatatttc aacacatctc 4260
ctcacgtgca agtcatgaag ttcttcttct tcttttttat tacgagaacg atacatttta 4320
atatttagaa tttctctgtt tattcttact gaaatgattt ataataatca cacaaattgc 4380
taaggcttag ttttcgacaa taattttcaa aagtctttca attctagacg tcactcccca 4440
gttaaatata gtcacataaa ttgtaactga catattagat tatatgatta gatatgttaa 4500
tttttttaat taaatataaa tataatttca tttacttgat tatattttca acgtgatcat 4560
caggaagaag agaaaaatga gatggatcaa gttattaaga agagagtata tgtgtgtcca 4620
gagccaagtt gtgtgcacca tgatccatgt catgcattag gtgatcttgt tggaatcaaa 4680
aaacatttta gaagaaaacg tagcaattac aaacaatgga tttgtcaaaa atgcaacaaa 4740
ggttatgctg ttcaatcaga ttataaagct cacatcaaaa cttgtggtac tagaggccat 4800
tcttgtgatt gtggaagagt tttctctagg taaattcatc ttcttaatta tatatctgtg 4860
ttctgtttta cttgagtcga gaatctataa gaaaaaatag aatctattta tcctcatagg 4920
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gtacaaacat attttgtgtg ctcacatttg aaaatttctt ccttatctat atgattataa 5400
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gtccaaaaca atgatattga agtcaaagaa attattgaag aggcaacaac acaagtaaca 5940
agattgaaaa gtgaagcaaa tgaaatactc aaaatagcaa tggaagaaaa ggcaatggct 6000
atagagaaga gacaagaagc aaagtgtttg attgaattag ccaaccttga aatggcaaaa 6060
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gctactttga ctaataatta ttatttgtca tcttctattt atagaagatg atgactattt 6240
atagaagatg atga 6254
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atgctaacta gcaactcttt cttgtttggt gctccttcta attattctga tccattttct 60
tccccagaaa atggttttat tatcaaaaga aaaagaagac ctgctggtac tccagatccc 120
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agatga 1146
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Met Leu Thr Ser Asn Ser Phe Leu Phe Gly Ala Pro Ser Asn Tyr Ser
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Asp Pro Phe Ser Ser Pro Glu Asn Gly Phe Ile Ile Lys Arg Lys Arg
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Arg Pro Ala Gly Thr Pro Asp Pro Asp Ala Gln Val Val Tyr Leu Thr
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Ala Glu Met Leu Met Glu Ser Asp Arg Tyr Val Cys Glu Ile Cys Asn
50 55 60
Leu Ser Phe Gln Arg Glu Gln Asn Leu Gln Met His Arg Arg Arg His
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Lys Val Pro Trp Lys Leu Lys Lys Lys Glu Glu Glu Lys Asn Glu Met
85 90 95
Asp Gln Val Ile Lys Lys Arg Val Tyr Val Cys Pro Glu Pro Ser Cys
100 105 110
Val His His Asp Pro Cys His Ala Leu Gly Asp Leu Val Gly Ile Lys
115 120 125
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130 135 140
Lys Cys Asn Lys Gly Tyr Ala Val Gln Ser Asp Tyr Lys Ala His Ile
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Lys Thr Cys Gly Thr Arg Gly His Ser Cys Asp Cys Gly Arg Val Phe
165 170 175
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180 185 190
Ser Thr Thr Thr Lys Glu Cys His Asp Met Gln Ile Pro Lys Pro Ile
195 200 205
Phe Leu Pro Thr Thr Thr Thr His Ile Pro Pro His Asp Gln Tyr Ser
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Phe Asn Gln Asn Thr His Asn Phe Ser Ser Phe Val Asp Gln Ser Asp
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His His His His Asn Asn Asn Tyr Ile Val Gln Asn Asn Asp Ile Glu
260 265 270
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275 280 285
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Leu Glu Met Ala Lys Ala Met Glu Ile Arg Gln Ser Val Cys Ala Ser
325 330 335
Ser Ser Ser Ser Ser His Val Met Lys Ile Ile Lys Cys Ser Ser Cys
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