一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在dc疫苗中的应用方法
阅读说明：本技术 一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在dc疫苗中的应用方法 (Application method of tumor cell-derived exosome antigen in DC vaccine ) 是由 王策 李富荣 黄雪 陈尚 于 2018-06-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法。本发明保护一种肿瘤疫苗的制备方法,包括如下步骤：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞,得到所述肿瘤疫苗。本发明提供的肿瘤细胞上清外泌体具有稳定性良好,毒性低,细胞相容性好,便于操作和临床肿瘤免疫治疗应用和推广,是一项简单易行实用的应用技术和方法。解决了现有的DC疫苗构建中抗原来源缺乏,相容性差,不稳定性,以及外援DC抗原载体具有生物毒性,难操作等问题。(The invention discloses an application method of tumor cell-derived exosome antigen in a DC vaccine. The invention provides a preparation method of a tumor vaccine, which comprises the following steps: and (3) sensitizing the DC cells by adopting tumor cell exosomes to obtain the tumor vaccine. The tumor cell supernatant exosome provided by the invention has the advantages of good stability, low toxicity and good cell compatibility, is convenient to operate and apply and popularize in clinical tumor immunotherapy, and is a simple, practicable and practical application technology and method. Solves the problems of the prior DC vaccine construction that the antigen source is lack, the compatibility is poor, the instability is poor, and the externally-applied DC antigen carrier has biological toxicity and is difficult to operate.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法。
背景技术
众所周知，恶性肿瘤是严重危胁人类健康的首要原因，发展高效低副作用的治疗模式对提高患者的生存率和生活质量至关重要。近十年来，尽管抗肿瘤药物治疗的特异性和安全性大大提高，然而肿瘤侵袭、转移、复发，以及病人对常规药物治疗产生抗药性仍然是肿瘤无法得到有效控制的根源，因此如何在机体内引发持久的抗肿瘤作用，避免治疗后复发依然是亟待解决的瓶颈问题。
肿瘤免疫治疗作为一种新型肿瘤治疗模式，主要通过激活机体的免疫系统产生抗肿瘤免疫，从而达到清除肿瘤细胞的目的,不但能引发持久的抗肿瘤免疫，而且对预防术后复发具有重要作用。树突状细胞(Dendritic cells，DC)作为机体产生特异性免疫反应的首要环节，是肿瘤免疫治疗的重要靶点。DC疫苗采用自体或异体肿瘤细胞成份致敏患者外周血来源的单核细胞诱导分化的DC，从而直接诱导特异性的免疫反应，现已成为肿瘤免疫治疗的重要手段。尽管临床研究表明，通过患者自体单核细胞诱导的DC疫苗能被患者较好的耐受，并能产生抗肿瘤免疫应答，但仍无法有效***，原因可能与特异性肿瘤抗原缺乏、抗原负载效率低以及治疗后续调节性T细胞被激活，产生免疫抑制有关。
尽管目前已建立了多种DC肿瘤疫苗制备方法，如用肿瘤细胞裂解物以及肿瘤相关抗原肽段直接致敏DC，将肿瘤相关抗原基因通过电穿孔、质粒DNA等载体转染DC或采用纳米载体负载肿瘤抗原刺激DC等手段。然而，由于DC对游离的抗原直接摄取效率低，因此，构建高效安全的DC疫苗抗原呈递载体是亟待解决的关键问题，也是当前DC疫苗产业面临的重要任务。
癌症病人体内的自身免疫力往往较弱，且缺乏特异性的抗原激活免疫细胞，肿瘤免疫治疗的关键在于寻到肿瘤特异性的抗原。外泌体作为潜在的***的药物已经引起了研究人员的广泛关注，在启动T细胞免疫应答中，需要DC的完全激活，CD40分子在DC的激活过程中具有很重要的作用，经过CD40配体基因修饰的肺癌细胞的外泌体具有更强的免疫原性，含有CD40的外泌体除了含有肿瘤细胞的抗原还富含CD40，可以有效活化DC，引起肿瘤抗原特异性的T细胞活化。这些研究表明，外泌体可能含有肿瘤细胞特异性的抗原，在肿瘤免疫治疗中具有非常重要的作用。
从理论上讲，外泌体是一类由体内多种活细胞分泌的纳米级的双层膜结构小囊泡，可携带包含亲代细胞信息的核酸、蛋白质和脂质等，能够在细胞之间转移蛋白质、脂质和RNA。不同的细胞分泌的外泌体不同，其外泌体具备的生物学功能也有差别。此外，外泌体可以通过三种不同的途径刺激免疫细胞，一是通过与免疫细胞上的MHC复合物直接激活，二是通过外泌体MHC循环将抗原呈递到细胞表面，三是通过外泌体的降解和抗原呈递细胞的呈递作用，将肽加载到内源性的MHC分子上。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在DC疫苗中的应用方法。
本发明提供了一种肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞，得到所述肿瘤疫苗。
采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞时，所述肿瘤细胞外泌体总蛋白浓度为25-100μg/ml。
采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞时，所述肿瘤细胞外泌体总蛋白浓度具体可为25μg/ml。
所述“采用肿瘤细胞外泌体致敏DC细胞”的方法具体包括如下步骤：向DC细胞培养体系中加入肿瘤细胞外泌体，共培养1±0.5天。
所述培养基为无血清的悬浮细胞培养基，具体可为AIM-V(Gibco，USA)培养基。
所述肿瘤细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：采用细胞培养液培养肿瘤细胞，从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体；所述细胞培养液中使用无外泌体的血清。
所述“从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体”通过超速离心实现。
所述“从肿瘤细胞培养液上清中提取所述肿瘤细胞外泌体”的方法具体包括如下步骤：
(1)收集肿瘤细胞培养液上清，首先通过500g低速离心除去细胞和细胞碎片，再经过12 000g离心后取上清，再次4℃、150 000g的离心力离心2h；
(2)完成步骤(1)后，采用含有0.1％(体积百分含量)Tween-20的PBS重悬沉淀，再以150 000g、4℃离心2h；
(3)完成步骤(2)后，采用无Ca2+、Mg2+的PBS重悬沉淀，得到肿瘤细胞外泌体。
所述无外泌体的血清可通过将血清超速离心后取上清得到。
所述超速离心具体可为4℃、150 000g离心12h。
所述肿瘤细胞培养上清具体可为培养48h的肿瘤细胞培养上清。
所述肿瘤细胞为肺癌细胞；所述肿瘤疫苗为肺癌疫苗。
本发明还保护任一所述的方法制备得到的肿瘤疫苗。
本发明还保护一种产品，其活性成分为肿瘤细胞外泌体致敏的DC细胞；所述产品的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)促进CD4+T和CD8+T细胞增殖；
(a2)诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α；
(a3)杀伤肿瘤细胞。
本发明还保护肿瘤细胞外泌体或肿瘤细胞外泌体致敏的DC细胞在制备肿瘤疫苗中的应用。
本发明还保护肿瘤细胞外泌体或肿瘤细胞外泌体致敏的DC细胞在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)促进CD4+T和CD8+T细胞增殖；
(a2)诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α；
(a3)杀伤肿瘤细胞。
本发明还保护一种试剂盒，包括肿瘤细胞外泌体和DC细胞；所述试剂盒的用途为如下(a1)或(a2)或(a3)：
(a1)促进CD4+T和CD8+T细胞增殖；
(a2)诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α；
(a3)杀伤肿瘤细胞。
以上任一所述DC细胞的制备方法具体可为：
(I)采集离体的健康人外周血离心收集下层液体(浓缩的血细胞)；
(Ⅱ)吸取步骤(I)得到的血细胞与淋巴细胞分离液混匀离心，吸取白膜层(单个核细胞)，离心收集细胞沉淀；
(Ⅲ)采用无血清的悬浮细胞培养液培养重悬步骤(Ⅱ)得到的细胞沉淀并培养2h；
(Ⅳ)完成步骤(Ⅲ)后，去除悬浮细胞和培养基，添加采用含有GM-CSF和IL-4细胞因子的培养基诱导培养得到DC细胞。
所述无血清的悬浮细胞培养液具体可为AIM-V(Gibco，USA)培养基。
所述含有GM-CSF和IL-4细胞因子的培养基，具体可为含有GM-CSF和IL-4细胞因子的AIM-V(Gibco，USA)培养基。
以上任一所述肿瘤细胞具体可为肺癌细胞，更具体可为A549细胞。
以上任一所述肿瘤细胞具体可为肺癌疫苗。
本发明利用肿瘤细胞A549培养上清中外泌体作为DC抗原，用于抗肺肿瘤DC疫苗的构建，为研制高效的DC疫苗提供新思路。一方面利用外泌体脂膜结构提高入胞效率，另一方面培养上清中外泌体可携带A459细胞相关蛋白，因此肿瘤细胞上清外泌体显著提高体外PBMC来源DC活化效率，从而大大增强机体抗肿瘤免疫作用。此外，肿瘤上清分泌的外泌体构建的DC疫苗可有效刺激同种异体T细胞增殖和增强CTL的细胞毒效应。上述肿瘤细胞A549培养上清中外泌体活化后与T细胞混合后，加入肿瘤细胞中，在效靶比20：1时，能在6小时内对肿瘤细胞进行杀伤，杀伤效率与常规的肿瘤裂解物活化DC组相比能提高1-2倍，能有效的清除肿瘤细胞。
本发明提供的肿瘤细胞上清外泌体具有稳定性良好，毒性低，细胞相容性好，便于操作和临床肿瘤免疫治疗应用和推广，是一项简单易行实用的应用技术和方法。解决了现有的DC疫苗构建中抗原来源缺乏，相容性差，不稳定性，以及外援DC抗原载体具有生物毒性，难操作等问题。
附图说明
图1为A549培养上清来源外泌体表面标志物CD63、CD81表达水平。
图2为外泌体对DC表面分子表达水平的影响。
图3为外泌体对DC分泌IL-12p70的影响。
图4为外泌体活化的DC对效应T细胞活化作用。
图5为外泌体活化的DC对效应T细胞分泌TNF-α、IFN-γ的影响。
图6为外泌体活化的DC对效应T细胞特异性杀伤作用。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
A549细胞(CCL-185TM)：中国科学院干细胞库(SCSP-503)。
以下实施例中A549肿瘤细胞裂解物的制备方法为：消化收集对数期A549细胞，PBS洗3次后，-80℃/37℃反复冻融5次(每次10min)，最后3000g、4℃离心10min，取上清，获得A549肿瘤裂解物。
实施例1、肺肿瘤A549培养上清中外泌体的制备
一、制备无外泌体FBS
将溶解灭活的FBS(Gibco，USA)，12 000g，4℃离心30min去除较大分子量的杂质。使用注射器将血清上清缓慢注射于超速离心管，切记不能产生气泡，待上清加到离心管瓶颈，使用电热熔器对离心管口进行热熔处理。热熔完成的离心管，对角对称放于超速离心机上，4℃，150 000g离心12h。离心完毕后，剪去封口，吸取上清，并使用0.22μm的针头式过滤器过滤上清。
过滤后的上清(去除外泌体的FBS)分装保存，并于-20℃保存备用。
二、获取无血清培养基肿瘤细胞培养上清
用含有10％(体积百分含量)步骤一得到的无外泌体FBS的DMEM培养A549细胞，待细胞密度达到60％-70％时，吸去细胞培养上清，重新加入含有10％(体积百分含量)步骤一得到的无外泌体FBS的DMEM，5％CO2、37℃，饱和湿度下无菌培养48h，收集细胞培养上清。
三、超速离心法提取细胞培养上清外泌体
1、将步骤二得到的细胞培养上清通过500g低速离心除去细胞和细胞碎片，再经过12 000g离心后，经过0.22μm的PVDF滤膜过滤，收集经过滤后的上清于超速离心管中，150000g的离心力，4℃，离心2h。
2、完成步骤1后，弃掉上清，采用含有0.1％(体积百分含量)Tween-20的PBS(Hyclone，USA)，4℃洗涤沉淀，冲洗底部沉淀超过2min，得到含有外泌体的溶液。
3、将步骤2得到的含有外泌体的溶液注入超速离心管中，再以150 000g，4℃离心2h。离心完毕后，剪去封口，弃去上清，用无Ca2+、Mg2+的PBS重悬收集外泌体，得到外泌体悬液，并于-80℃保存备用。
四、外泌体性质鉴定表征
1、BCA法检测外泌体的总蛋白浓度
采用BCA试剂盒检测步骤三制备得到的外泌体悬液中的总蛋白浓度。取外泌体悬液于无酶EP管中，放于冰盒待用。配置BCA试剂盒工作液，涡旋混匀，96孔透明酶标板每孔加入200ul现配的BCA工作液。将标准品蛋白(2mg/ml)依次对倍稀释，每孔10ul，制备标准曲线。加入不同稀释浓度的待测外泌体悬液，每孔10ul，并设置3个复孔。将96孔酶标板室温赋予30min。显色完毕，多功能酶标仪检测在562nm处的OD值，通过标准蛋白浓度-OD值曲线，算出待测的外泌体蛋白浓度为1.27mg/ml。
2、流式检测外泌体表面标记物
外泌体是在正常和病理条件下通过细胞分泌的，并含有各种膜蛋白和细胞质蛋白。常见的外泌体特异性标志物，包括CD9，CD63和CD81等膜蛋白。
将步骤三制备得到的外泌体悬液分为三份流式检测样品，一份采用FITC标记的CD63(Biolegend，USA)染色，一份采用FITC标记的CD81(Biolegend，USA)染色，一份不染色(阴性对照，NC)，充分震荡混匀，4℃避光孵育20min。孵育完毕后，加入1ml 4℃预冷的含1％BSA(Sigma，USA)的PBS(Hyclone，USA)洗两次细胞，每次1 400r/min，离心5min，洗去未结合的抗体。加入300μl 4℃预冷的含1％BSA的PBS重悬细胞，通过流式细胞术对外泌体进行鉴定，从而判断外泌体的纯度。
结果如图1所示。通过FCM检测外泌体表面CD63和CD81的表达，外泌体标志性表面分子CD63的阳性率为32.8％±3.5，CD81的阳性率为53.6％±5.6。
3、粒径仪检测外泌体粒径
Zetasizer粒径仪根据Stokes-Einstein原理，使用动态光散射检测由于颗粒布朗运动而产生散射光的波动随时间的变化。将步骤三制备得到的外泌体悬液采用按照ZETASIZER Nano series-Nano-ZS仪器操作规程上机检测。
结果如表1所示。
表1外泌体粒径及分布系数统计
结果表明，通过粒径仪检测外泌体的粒径大小，颗粒大小相近，粒径分布较为均一，其平均粒径为60.25nm，其分布系数为0.239。
实施例2、肿瘤细胞培养上清中外泌体在DC疫苗中的应用
一、A549细胞培养上清来源外泌体活化DC
1、人外周血来源树突状细胞(DC)诱导培养
(1)采集离体的健康志愿者外周血25ml，将外周血用移液器上下吹打混匀，800g，离心5min，上层为淡黄色血浆层，剩余液体为浓缩的血细胞。
(2)将步骤(1)得到的上层血浆装入离心管用封口膜密封，于56℃水浴锅内进行灭活30min，离心后取上清待用。
(3)吸取步骤(1)得到的血细胞在分离液斜面1cm处慢慢将稀释血细胞移入装有淋巴细胞分离液(GE，USA)的离心管。将转移完毕的血细胞，800g、离心15min。将白膜层以上的血浆稀释液吸到废液管内；再吸取离心管内的白膜层(单个核细胞)，转移到新的离心管内，800g，离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀。
(4)用未添加细胞因子的AIM-V(Gibco，USA)无血清培养基对步骤(3)得到的细胞进行重悬，调整细胞密度为2×106个/孔，接种在24孔培养板中，5％CO2、37℃，饱和湿度下无菌培养2h。
(5)完成步骤(4)后，收集悬浮细胞和培养基于新的15ml离心管中，向去除悬浮细胞和培养基的24孔板中，每孔加入1ml添加GM-CSF(Peprotech，USA)和IL-4(Peprotech，USA)细胞因子的AIM-V(Gibco，USA)培养基，5％CO2、37℃，饱和湿度下无菌培养2天。第3天，使用移液枪吸去500μl旧培养基，枪头不可深入板底，避免损失过多细胞，补充500μl新鲜的含GM-CSF和IL-4细胞因子的AIM-V(Gibco，USA)培养基继续培养。第5天，显微镜下观察细胞具有明显树突状形态，收集半悬浮细胞检测DC表面标记CD11c，表达率大于90％以上，即DC细胞诱导培养完成。
2、A549细胞培养上清来源外泌体致敏DC
取步骤1制备得到的DC细胞，按照如下分组操作：
肿瘤裂解物组(A549-lys)：向培养体系中加入A549肿瘤细胞裂解物(A549肿瘤细胞裂解物总蛋白的浓度为25μg/ml)。
外泌体组(A549-exo)：向培养体系中加入实施例1中制备的外泌体悬液(外泌体总蛋白的浓度为25μg/ml)。
未处理组(Medium)：不进行处理。
第2天收集各组细胞和培养上清用于后续检测。
3、流式细胞术检测DC表面标记物的表达
各组DC细胞用含1％BSA的PBS洗两次细胞，每次1 200r/min，离心5min，收集细胞待检，分别加入PE标记的CD11c(Biolegend，USA)、APC标记的CD80(Biolegend，USA)、FITC标记的CD83(Biolegend，USA)、APC标记的CD86(Biolegend，USA)、PE标记的CD14(Biolegend，USA)，充分震荡混匀，4℃避光孵育20min。孵育完毕后，加入1ml 4℃预冷的含1％BSA(Sigma，USA)的PBS(Hyclone，USA)洗两次细胞，每次1 400r/min，离心5min，洗去未结合的抗体。加入300μl 4℃预冷的含1％BSA的PBS重悬细胞，流式细胞仪分析表面分子的表达。
结果见图2。A549-exo和A549-lys均不同程度促进DC表面分子CD86、CD83和CD80的表达。其中，A549-exo较对照组CD83的表达率提高近3倍，与对照组相比差异具有统计学意义。
4、DC培养上清中IL-12p70的分泌水平
通过ELISA的方法检测各组培养上清中IL-12p70细胞因子的分泌水平，按Biolegend说明书执行操作，具体如下：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、样品孔。抗体加入到96孔酶标板中，每孔加入100ul，4℃过夜孵育。用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入200μl的缓冲稀释液，于室温封闭1h。去除孔板中稀释液，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的标准品和各组的DC上清，室温孵育2h。孵育完毕后，去除孔板中的液体，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的检测抗体，室温孵育1h。孵育完毕后，去除孔板中的液体，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的HPR标记的亲和素，室温避光孵育30min。孵育完毕后，去除孔板中的液体，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板5次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的TMB显色液，室温避光孵育15min。孵育完毕后，每孔加入100μl 1mol/L H2SO4加入终止液终止显色，酶标仪测定450nm处的吸光值(OD值)，并计算检测的样品中的细胞因子的浓度。
结果如图3所示。IL-12p70是DC诱导Th1型免疫反应最主要的细胞诱导因子，结果表明A549-lys对IL-12p70水平无显著影响，而A549-exo则显著诱导了DC分泌IL-12p70。
5、最佳使用剂量
按照步骤2进行操作，其中外泌体组(A549-exo)采用不同浓度的外泌体悬液进行处理(外泌体总蛋白的浓度为0μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)，按照步骤4的方法检测DC培养上清中IL-12p70的分泌水平。
实验重复3次。结果见表2。
表2IL-12p70分泌水平(pg/ml)
结果表明，按上述外泌体总蛋白浓度梯度处理后，其细胞培养上清中IL-12p70的平均分泌水平分别为32.96pg/ml、37.14pg/ml、41.81pg/ml、76.13pg/ml、74.67pg/ml、77.67pg/ml。当外泌体总蛋白浓度为较低剂量时与IL-12分泌水平之间存在剂量依赖关系，然而当外泌体总蛋白浓度梯度达到25μg/ml后，IL-12分泌水平没有明显变化。因此筛选外泌体最佳使用剂量为25μg/ml。
二、A549细胞培养上清来源外泌体活化的DC对T淋巴细胞作用
1、A549细胞培养上清来源外泌体活化的DC对T淋巴细胞的活化作用
利用密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞，贴壁2h后收获悬浮细胞即为T淋巴细胞。
实验分为如下3组操作：
实验组：步骤一的2中收集的外泌体组(A549-exo)DC细胞与T淋巴细胞按1:10混合培养，第1天加入1000U/ml的IL-2细胞因子，第3天予以半量换液处理并加添加上述细胞因子，第4天收集细胞上清和细胞。
对照组：步骤一的2中收集的肿瘤裂解物组(A549-lys)收集的DC细胞与T淋巴细胞按1:10混合培养，第1天加入1000U/ml的IL-2细胞因子，第3天予以半量换液处理并加添加上述细胞因子，第4天收集细胞上清和细胞。
空白组：步骤一的2中收集的未处理组(Medium)加入培养T淋巴，第1天加入1000U/ml的IL-2细胞因子，第3天予以半量换液处理并加添加上述细胞因子，第4天收集细胞上清和细胞。
进行上述处理后，各组收集的细胞分别加入PE标记的CD4(Biolegend，USA)和FITC标记的CD8(Biolegend，USA)，充分震荡混匀，4℃避光孵育20min。孵育完毕后，加入1ml 4℃预冷的含1％BSA(Sigma，USA)的PBS(Hyclone，USA)洗两次细胞，每次1 400r/min，离心5min，洗去未结合的抗体。加入300μl 4℃预冷的含1％BSA的PBS重悬细胞，流式细胞仪分析表面分子的表达。
结果如图4所示。结果表明，A549-exo可以显著促进CD4+T和CD8+T细胞增殖，均提高了1.5倍，与对照组相比差异具有统计学意义，而A549-lys基本不能产生作用。
2、ELISA检测培养上清中IFN-γ和TNF-α含量
将步骤1中各组收集的细胞上清通过ELISA的方法分别检测上述收集的上清中IFN-γ和TNF-α含量。分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、样品孔。抗体加入到96孔酶标板中，每孔加入100ul，4℃过夜孵育。用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入200μl的缓冲稀释液，于室温封闭1h。去除孔板中稀释液，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的标准品和各组的DC上清，室温孵育2h。孵育完毕后，去除孔板中的液体，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的检测抗体，室温孵育1h。孵育完毕后，去除孔板中的液体，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板4次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的HPR标记的亲和素，室温避光孵育30min。孵育完毕后，去除孔板中的液体，用0.5％Tween-20的PBS洗涤96孔板5次，最后一次尽量拍干孔板中残留的液体，每孔加入100μl的TMB显色液，室温避光孵育15min。孵育完毕后，每孔加入100μl 1mol/L H2SO4加入终止液终止显色，酶标仪测定450nm处的吸光值(OD值)，并计算检测的样品中的细胞因子的浓度。
结果如图5所示。结果表明，A549-exo活化的DC显著诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α，较Medium相比差异具有统计学意义(P<0.05)，而A549-lys组较Medium无显著差异。
3、A549细胞上清来源外泌体活化的DC对肿瘤细胞的杀伤作用
将A549细胞以1×104个/ml浓度重悬于96孔培养板中，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养4h，然后用37℃培养基冲洗一次，洗去未贴壁的细胞。
将步骤1中三组得到的活化的T淋巴细胞以效靶比5:1、10:1和20:1与A549细胞混合培养，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养6h。
乳酸脱氢酶法检测其杀伤作用，酶标仪测波长为492nm处的OD值。细胞活性杀伤率计算：细胞杀伤率(％)＝(实验组OD值-最小杀伤对照组OD值)/(最大杀伤对照组OD值-最小杀伤对照组OD值)×100％。
结果如图6所示。结果表明，不同处理组活化的DC刺激的效应细胞与靶细胞按不同效靶比(20:1、10:1和5:1)共培养6h后，A549-exo可有效地诱导抗肿瘤细胞毒性杀伤应答，当效靶比为20:1时，杀伤效率与A549-lys活化DC组相比能提高1-2倍。