阅读说明：本技术 Cysestermerol A及其在改善糖尿病方面的应用 (Cysestermerol A and application thereof in improving diabetes ) 是由 王峰 张丽 李碧君 鄢琼芳 王淑美 于 2019-08-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,具体公开了一种化合物Cysestermerol A及其在改善糖尿病方面的应用。本发明从狗牙根中提取得到一种新型化合物Cysestermerol A,该化合物可改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗状态,促进胰岛素抵抗细胞对葡萄糖的消耗,还能抑制α-葡萄糖苷酶的活性,从而可有效降低血糖水平,为研究开发新的降血糖药物提供了新的选择和途径,具有很好的应用前景。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly discloses a compound Cysestermerol A and application thereof in improving diabetes. The novel compound Cysestermerol A extracted from bermuda grass can improve the insulin resistance state of IR-HepG2 cells, promote the consumption of glucose by the insulin resistance cells and inhibit the activity of alpha-glucosidase, thereby effectively reducing the blood sugar level, providing a new choice and way for researching and developing new blood sugar-reducing drugs and having good application prospect.)

Cysestermerol A及其在改善糖尿病方面的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种狗牙根化合物Cysestermerol A及其在改善糖尿病方面的应用。

背景技术

糖尿病是一种由多病因引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，以血糖增高和糖尿为特征的终身性代谢疾病。全球糖尿病患者已超过4亿人，2014年流行病学调查结果表明中国糖尿病患者已达1.4亿人，因此对糖尿病的预防和治疗已迫在眉睫。

目前糖尿病的药物治疗有口服药物治疗和胰岛素治疗，但是这些药物往往有明显的副作用，长期服药会给患者带来诸多器官损伤，有些反应较严重甚至引起死亡。其中不良反应包括低血糖、心血管副反应、消化道副反应、乳酸性酸中毒以及肝肾毒性等，因此其临床应用越来越受限制。因此糖尿病患者急切地需要使用方便、作用高效、稳定、持久、毒性和副作用较小并可以延缓并发症发生发展的降血糖新药或胰岛素增敏剂。

另外，中草药是中华民族几千年累积下来的文化瑰宝，与西药相比，其具有药源丰富、价格便宜、副作用小、多环节整体性治疗等优势。狗牙根在我国分布广泛，近年来研究表明其具有抗菌、利尿、降血糖等药理作用，但是关于其具体有效成分的研究极少，故急需以传统中医理论和现代药理药效学为指导，研究开发新型的天然降血糖药物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷和不足，提供狗牙根化合物Cysestermerol A在制备改善糖尿病药物或制剂中的应用，本发明发现Cysestermerol A可改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗状态，促进胰岛素抵抗细胞IR-HepG2对葡萄糖的消耗，还能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而可有效降低血糖水平，因此可用于开发新型的降血糖药物。

本发明的另一目的在于提供一种狗牙根化合物Cysestermerol A。

本发明的另一目的在于提供Cysestermerol A在制备改善胰岛素抵抗的药物或制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供Cysestermerol A在作为或制备胰岛素增敏剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供Cysestermerol A在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性的药物或制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种治疗糖尿病或降血糖的药物。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明从狗牙根中提取得到一种具有降血糖、改善胰岛素抵抗，从而改善糖尿病的新化合物Cysestermerol A，其结构式如下所示：

本发明研究发现，用高浓度胰岛素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型IR-HepG2，运用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)检测Cysestermerol A对IR-HepG2细胞葡萄糖的消耗量的影响，与模型组IR-HepG2细胞比较，添加Cysestermerol A(浓度≥3.125μmol/L)的IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗量显著增加，同时，添加Cysestermerol A剂量组的IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗量呈剂量依赖性的增加，因此表明，Cysestermerol A可促进IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗，改善HepG2细胞对胰岛素的抵抗状态。即实验结果表明，Cysestermerol A可以明显增加胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗，提示其可以胰岛素增敏剂的形式促进细胞的葡萄糖吸收，改善胰岛素抵抗状态。

本发明进一步研究发现，以4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物，测定Cysestermerol A对α-葡萄糖苷酶的抑制率，质量浓度为0～250mg/L的Cysestermerol A对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率随着其质量浓度的增加而迅速增大，当质量浓度高于250mg/L时，抑制率增长缓慢，其半数抑制浓度为99.58mg/L。因此表明，Cysestermerol A可抑制α-葡萄糖苷酶活性，减缓肠道中淀粉类物质消化分解为葡萄糖的速度，从而减少肠道葡萄糖的吸收，较好的降低餐后血糖。

因此，本发明请求保护Cysestermerol A在制备改善糖尿病药物或制剂中的应用。

本发明还请求保护一种治疗糖尿病或降血糖的药物。

本发明还请求保护Cysestermerol A在制备改善胰岛素抵抗药物或制剂中的应用。

本发明还请求保护Cysestermerol A在作为或制备胰岛素增敏剂中的应用。

本发明还请求保护Cysestermerol A在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性药物或制剂中的应用。

另外，狗牙根在制备上述化合物Cysestermerol A方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。另外，本发明的化合物Cysestermerol A亦可通过化学手段合成。

作为一种可选择的方案，从狗牙根中提取制备Cysestermerol A的方法包括以下步骤：

S1.狗牙根经95％的乙醇水溶液提取，获得提取物浸膏，依次经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，获得乙酸乙酯萃取物；

S2.乙酸乙酯萃取物上样于硅胶色谱柱(200～300目)，CH₂Cl₂/Acetone梯度洗脱给出5个流分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5；

S3.Fr.5(1:1)经过MCI gel CHP 20P柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱和半制备色谱获得Cysestermerol A。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的Cysestermerol A可通过改善IR-HepG2细胞胰岛素抵抗状态，促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗，并能抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而有效降低血糖水平。

2.本发明提供的Cysestermerol A为狗牙根降血糖方面的物质基础研究奠定了基础，为开发天然新型的胰岛素增敏剂提供了新思路。

附图说明

图1是cysestermerol A的1H-1H COSY和HMBC相关信号示意图(A)以及关键的NOESY相关信号示意图(B)；

图2是cysestermerol A的实验和计算ECD谱图；

图3是Cysestermerol A对HepG2细胞增值的影响；

图4是Cysestermerol A和罗格列酮对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响；

图5是Cysestermerol A和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

研究表明，抑制机体肠道对淀粉类物质的降解和葡萄糖的吸收，可较好的降低餐后血糖水平；而改善机体细胞对胰岛素抵抗的状态，增强对葡萄糖的敏感性，促进血糖的消耗，可较好的降低血糖水平。近年来用胰岛素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞模型，进行糖尿病药物筛选研究，取得了较好的研究成果。α-葡萄糖苷酶是肠道中对碳水化合物消化吸收起重要的作用，目前该类酶的抑制剂已用于2型糖尿病的治疗。

因此，本研究通过体外建立高浓度胰岛素诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型进行狗牙根改善胰岛素抵抗初步研究，探讨从狗牙根中提取的新化合物Cysestermerol A对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗的影响及体外α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，旨在为狗牙根降血糖方面的物质基础研究提供数据，为开发新型的胰岛素增敏剂提供研究基础。

以下实施例中所用材料来源：

HepG2细胞购自中科院上海细胞所；罗格列酮购自美国Sigma公司；南美巴西胎牛血清(NBCS)购自美国GIBCO公司；DMEM高糖培养基购自美国GIBCO公司；青霉素/链霉素原液和胰蛋白酶均购自中国医学科院生物医学工程研究所；胰岛素购自Sigma；葡萄糖测试盒(BestBio)购自南京建成生物工程研究所；磷酸缓冲盐(PBS)购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒购自东仁化学科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司；96孔细胞培养板购自美国NEST公司；实验所配试剂用水均为双蒸水；实验用75％酒精购自于山东利尔康有限公司；实验用无水乙醇(分析纯)购自天津市致远化学试剂有限公司。

二氧化碳细胞培养箱(SERIES 8000WJ)：Therno Scientific；超净工作台(SW-CJ-1F)：苏净集团苏州安泰空气技术；倒置相差显微镜剂(CDX41)：奥林巴斯(中国)有限公司上海分公司；全自动高压蒸汽灭菌器(MJ-78A)：广州飞迪生物科技有限公司；数显恒温水浴锅(DK-S22)：上海精宏实验设备有限公司；-80℃超低温冰箱(DW-HW328)：中科美菱；电热恒温干燥箱(DHG-9077A)：上海精宏实验设备有限公司；十万分之一分析天平(S125D)：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；全自动酶标仪(ELX800)：BicTek Instruments；低速台式离心机(TDL-80-2B)：上海安亭科学仪器厂；低温高速离心机(TG16MW2-16KL)：美国Sigma公司；冷冻干燥器(FD-1C-50)：北京博医康实验仪器有限公司；低温冰箱(BCD-216SMK)：合肥美的荣事达电冰箱有限公司；微量分析型超纯水机(WP-UP-WF-10)：四川沃特尔水处理设备有限公司。

所用统计学处理方法：用SPSS24.0统计软件进行统计分析。两组间计量资料比较采用独立样本t检验，三组(或三组以上)比较采用单因素ANOVA方差分析方法。结果表示为当P<0.05时，差异显著，P<0.01表明差异极显著，两种均具有一定的统计意义。

实施例1Cysestermerol A的提取和鉴定

1、提取方法

狗牙根经95％的乙醇水溶液提取，获得提取物浸膏，依次经过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，获得乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物上样于硅胶色谱柱(200～300目)，不同比例的CH₂Cl₂/丙酮梯度洗脱给出5个流分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5；经过测试目标化合物集中在Fr.5(CH₂Cl₂:丙酮＝1:1)中，再将Fr.5经过MCI gel CHP 20P柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱和半制备色谱获得目标单体化合物，记为Cysestermerol A。

2、结构鉴定方法

Cysestermerol A的平面结构及相对构型通过HR-ESI-MS和NMR得以确定，其绝对构型通过计算ECD的方法确定。

3、鉴定结果

Cysestermerol A为棕色无定型粉末。该化合物的分子式由HR-ESI-MS确定为C₃₅H₂₈O₈(m/z 577.1860[M+H]⁺，calcd 577.1862)，显示该分子存在22个不饱和度。表1中的氢谱数据显示存在3套对位羟基取代的苯环信号[ring A1：δ_H 6.78×2(1H，d，J＝8.5Hz)，6.62×2(1H，d，J＝8.5Hz)，ring B1：δ_H 6.73×2(1H，d，J＝8.5Hz)，6.39×2(1H，d，J＝8.5Hz)，ring C1：δ_H 7.02×2(1H，d，J＝8.5Hz)，6.75×2(1H，d，J＝8.5Hz)]，1套对称的1，3，5-三取代苯环信号，[ring A2：δ_H 5.81×2(1H，brs)，5.87(1H，d，J＝2.0Hz)]和1个五取代的苯环信号，[r ing B2：δ_H 6.20(1H，s)]。除了以上的苯基信号，该化合物还含有5个sp³杂化的次甲基，其核磁信号分别位于δ_H 4.28(1H，d，J＝2.0Hz，H-7a)，2.69(1H，t-l ike，J＝9.5Hz，H-8a)，4.23(1H，d，J＝10.0Hz，H-7b)，3.60(1H，dd，J＝10.0，9.5Hz，H-8b)和5.96(1H，s，H-7c)。

表1中的碳谱数据展示35个碳信号吸收峰，包括21个次甲基(其中16个为烯碳，5个为脂肪族碳)，14个烯族季碳。以上涉及的官能团占据20个不饱和度，因此推测该化合物为一个二苯乙烯二聚体类，且含有额外的双环结构片段。

如图1中A和B所示，¹H-¹H COSY谱(A)中H-7a/H-8a/H-8b/H-7b存在相关峰，其中HMBC谱(A)中H-8a与C-7a、C-8b、C-7b存在相关，H-8b与C-7b存在远程相关，以上数据揭示丁烷结构片段的存在。同样，H-7a与C-10b、H-8b与C-9b存在的相关峰证实了C-7a/C-8a/C-8b/C-9b/C-10b五元环结构片段的存在。此外，吡喃环的存在由下列数据得以证明：HMBC(A)谱中H-7c到C-7b、9b、13b、14b存在远程相关；CH-7b和CH-7c具有较高的化学位移值。因此，在Cysestermerol A的结构核心存在一个5/6/6三环的骨架。ring A1，A2，B1and C1的取代位置由HMBC(A)谱确定，在谱图中明显观察到从H-7a到C-2a、H-8a、C-10a的相关信号、H-7b到C-2b的相关信号、H-7c到C-2c的相关信号。该化合物的相对构型由N OESY谱中存在的关键相关信号峰确定，如图1中B所示：H-10a与H-7a、H-8b，H-7b与H-8a、H-7c。

通过比较实验ECD与计算ECD，Cysestermerol A的绝对构型得以确定，由图2可以看出，两者的谱线具有很高的吻合度。

表1cysestermerol A的氢谱(500MHz)和碳谱(125MHz)数据(MeOD，δin ppm，J inHz)

综上所述，化合物Cysestermerol A为一个结构新颖的二苯乙烯二聚体化合物，其结构式如下式所示：

实施例2Cysestermerol A对IR-HepG2细胞的改善作用

1、HepG2细胞培养

HepG2细胞复苏后，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养液培养于25cm²培养瓶中，存放在恒温CO₂培养箱中37℃，5％CO₂条件下培养。当细胞贴壁长满至90％，用PBS清洗2次，0.25％胰酶消化，按1:3比例传代，取对数生长期的细胞用于实验。

2、给药安全范围的确定(CCK8法)

(1)实验方法

将对数生长期的HepG2细胞按每孔100μL含3x10⁴个细胞接种于96孔板中，37℃，5％CO₂培养。待细胞贴壁后，给药组加入用含10％FBS的DMEM培养液稀释的浓度梯度为50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625μmol/L的Cysestermerol A，每孔100μL，每个剂量设6个复孔。调零孔不接种细胞，与正常对照组均加不含药物的培养液，各设6个复孔。加药后轻轻摇匀，放置37℃，5％CO₂条件下培养24h后，每孔加入10μL CCK-8，振荡摇匀。继续培养2h，用酶标仪450nm测吸光度值(A)，监测细胞活力。

细胞存活率＝(实验组平均A值一调零孔A值)/(正常组平均A值一调零孔A值)×100％

(2)实验结果

如图3所示，Cysestermerol A在浓度大于12.5μmol/L时，有明显的细胞毒作用；在0～12.5μmol/L的浓度范围内，基本不影响HepG2细胞的生长繁殖，生存率均大于95％。因此在0～12.5μmol/L浓度剂量范围下研究Cysestermerol A对细胞葡萄糖消耗量影响。

3、IR-HepG2细胞模型的建立

取对数生长期的细胞，在细胞计数板上计数后，调整细胞悬液浓度为2×10⁴个/mL，每孔100μL接种于96孔板，37℃，5％CO₂条件下培养24h后，用PBS洗涤1次，每孔加入无胎牛血清且含1×10^-6mol/L胰岛素的DMEM培养液100μL，设对照组不加胰岛素，37℃，5％CO₂条件下培养24h。

4、Cysestermerol A对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响

(1)实验方法

取对数生长期的HepG2细胞，2×10⁴个/mL，100μL每孔接种于96孔板。实验分为空白组，对照组，模型组，给药组，罗格列酮阳性对照组。每组设6个复孔。给药组给药剂量范围分别为0～50μmol/L，罗格列酮剂量为10μmol/L。除给药组和罗格列酮组加药培养，其他组均加含10％FBS的完全培养液培养，培养24h后，吸去培养液，PBS洗涤1次。

参照上述第3点建立胰岛素抵抗模型，吸取细胞上清液，用葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)测定其葡萄糖的含量。计算各孔细胞的葡萄糖消耗量，以未接种细胞的空白组葡萄糖含量均值减去测得的培养液中葡萄糖含量即得各孔细胞的葡萄糖消耗量。为了考虑细胞增殖的影响，用GC/OD来表示葡萄糖消耗改善率，以消除细胞数量差异带来的影响。

(2)实验结果

如图4所示，与对照组比较，模型组IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗量显著降低，差异有统计学意义((P<0.01)，提示经过1×10^-6mol/L胰岛素诱导后，可降低HepG2细胞对胰岛素的敏感性，减少细胞对葡萄糖的消耗，说明建立的HepG2细胞模型可产生胰岛素抵抗。

与模型组比较，Cysestermerol A剂量组(浓度≥3.125μmol/L)和罗格列酮组(10μmol/L)均可显著增加IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗，改善胰岛素抵抗状态，差异有统计学意义((P<0.05，P<0.01)。浓度0～12.5μmol/L的Cysestermerol A剂量组葡萄糖消耗量呈剂量依赖性的增加，而浓度大于12.5μmol/L的Cysestermerol A剂量组葡萄糖消耗量下降。与罗格列酮比较，Cysestermerol A剂量组(12.5μmol/l)差异无统计学意义(P>0.05)，其他剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。因此表明添加12.5μmol/L的Cysestermerol A与10μmol/L罗格列酮对IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗影响作用相当。

实施例3Cysestermerol A对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

1、实验方法

称取(Na₂HPO₄)12H₂0 3.58g用蒸馏水定容至1000mL作为A液；称取KH₂PO₄ 1.36g用蒸馏水定容至1000mL作为B液；取A液49.6mL与B液50.4mL混匀，定容至1000mL，从中移取100mL再定容至1000mL，调pH至6.8即得0.1mmol/L PB溶液。

将底物PNPG和α-葡萄糖苷酶都溶于PB溶液，其浓度为20mmol/L和0.1mg/ml。取0.5mLα-葡萄糖苷酶溶液与一定量的待测样品溶液，补充缓冲溶液至混合溶液体积为3.5mL，混匀，37℃恒温水浴中孵育10min，加入0.5mL PNPG，混匀启动反应，于37℃恒温反应30min，然后加入1mol/L Na₂CO₃溶液1mL终止反应，在405nm波长处测定吸光度值，以Acarbose为阳性对照。按下面公式计算抑制率，求出相应的半数抑制浓度(IC50)

式中，Aa为空白对照吸光度值，Ab为空白对照的本底吸光度值，Ac为待测样品吸光度值，Ad为待测样品的本底吸光度值。

2、实验结果

如图5所示，0～500mg/l质量浓度范围的Cysestermerol A和阿卡波糖，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均随浓度升高而抑制率上升，Cysestermerol A和阿卡波糖的IC50值分别为99.58mg/L和67.23mg/L。在质量浓度0～125mg/L的阿卡波糖的抑制率随着质量浓度的增加而迅速增大。当质量浓度高于125mg/L时，抑制率增长缓慢。在质量浓度0～250mg/l，Cysestermerol A对α-葡萄糖苷酶活性抑制率随着质量浓度的增加而迅速增大具有剂量依赖性。当质量浓度高于250mg/L时，抑制率增长缓慢。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。