阅读说明：本技术 一种番石榴混源萜类新化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用 (New guava mixed source terpenoid compound, preparation method thereof and application thereof in preparation of anti-inflammatory drugs ) 是由 谢志翔 刘珍玲 宁帅 于 2019-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及有机合成和药物化学技术领域,其目的在于提供了一种番石榴混源萜类新化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用,所述的混源萜类化合物具有如下所示的结构：<Image he="483" wi="700" file="DDA0002138419530000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to the technical field of organic synthesis and pharmaceutical chemistry, and aims to provide a guava mixed source terpenoid compound, a preparation method thereof and application thereof in preparing anti-inflammatory drugs, wherein the mixed source terpenoid compound has the following structure:)

一种番石榴混源萜类新化合物及其制备方法和在制备抗炎药 物中的应用

技术领域

本发明涉及有机合成和药物化学技术领域，具体涉及一种番石榴混源萜类新化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。

背景技术

番石榴(Psidium guajava Linn.)是一种具有药用价值的热带乔木，在我国华南各省均有种植。它的果实可以食用，叶子具有极大的药用价值，在非洲及中国民间作为药物使用具有悠久的历史。其叶子提取物被认为具有抗菌、抗糖尿病、降血糖、降血压、抗癌、消炎、抗菌斑、抗过敏、保护心血管、抗氧化性及抗突变等功效。

番石榴混源萜是自2007年开始从番石榴叶的提取物中发现的一类天然代谢产物，这类物质被认为具有良好的生物活性及新颖的骨架结构，报道表明目前发现的四十余种番石榴混源萜类化合物中，不少番石榴混源萜具有对肿瘤细胞的抑制活性(Org.Lett.,2010,12,5040；Natur.Prod.&Bioprosp.,2013,3,14；Sci.Rep.,2016,6,32748)。一些番石榴混源萜还表现出对PTP1B的抑制活性(Org.Lett.,2010,12,656)和保肝活性，其效果大概与保肝药物Bicycol相当(Org.Lett.,2016,18,168-171)。2017年，中山大学尹胜等人报道，其分离的28种番石榴混源萜中，除(±)-guajadial B和guadial B外，所有化合物均对炎症因子PDE4有良好的抑制活性，其中psiguajadial G的半数抑制浓度仅为1.37μM(Sci.Rep.,2017,7,1047)，这表明番石榴混源萜可能具有抗炎活性。

番石榴混源萜新颖的结构和良好的生物活性激起了化学家和药学家的兴趣。这类化合物的合成也成为热点。截止目前，已经有5个小组完成了其中13种混源萜的全合成工作，他们是Thompson课题组对Psidial A和Guajadial的全合成(Org.Lett.,2010,12,1676)；刘吉开课题组对(±)-Guajadial B的全合成(Org.Lett.,2012,14,5936)；Cramer课题组对Psiguadial A、C和D的全合成(Chem.Eur.J.,2014,20,10654)和Psiguadial B的全合成(Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,13776)；Reisman课题组对(+)-Psiguadial B的全合成(J.Am.Chem.Soc.,2016,138,9803)以及2018年，Dethe课题组对Guadial B、Guadial C、Guapsidial A和Psiguajadial D的全合成(Org.Biomol.Chem.,2018,16,4793)。

但是，值得注意的是：Dethe课题组在尝试甲醛、β-石竹烯和间苯三酚衍生物进行串联反应合成Guapsidial A和Psiguajadial D时，因使用30％甲醛水溶液作为反应物而导致反应失败，随后其采用其他反应原料使合成步骤增多，产率下降。本发明通过一系列条件优化实验和对反应物的筛选试验实现了间苯三酚衍生物、多聚甲醛和β-石竹烯的串联反应合成番石榴混源萜，合成产率大大提高。并最终以总体三步或四步的合成步骤实现了从番石榴叶中最新分离得到番石榴混源萜的全合成，使得这几个番石榴混源萜药学方面的进一步深入研究成为可能。

发明内容

本发明的目的是提出一种番石榴混源萜类新化合物，同时提供这类化合物的制备方法，及其在制备抗炎药物中的用途。

一种番石榴混源萜类新化合物，其特征在于：所述的混源萜类化合物具有如下所示的结构：

所述式一还具有如下所示的结构：

所述式二还具有如下所示的结构：

所述式三还具有如下所示的结构：

所述的混源萜类新化合物的制备方法，其特征在于：合成路线如下式所示：

所述步骤i的反应基于仿生合成策略，以间苯三酚衍生物(1)、多聚甲醛(2)和β-石竹烯(3)为原料，通过串联诺文格尔(Knoevnagel)缩合/杂-狄尔斯-阿尔德反应(Hetero-Diels–Alder reaction)来一步制备含有化合物(4)和(5)的混合物，反应要用催化剂，所述催化剂选自硅胶附载的高氯酸、硅胶附载的三氯化铁(FeCl₃)，各类固体酸催化剂(如amberlyst 15,amberlyst A-21,amberlyst IR120)和醋酸钠(NaOAc)，溶剂可选自乙腈、甲苯或醋酸，产率可达61％；

所述步骤ii为还原反应，需要利用还原试剂，所述还原试剂可选自NaBH₄或NaBH₃CN，其在酸性(PH值约为4)条件下将化合物(4)和(5)进行还原得到如式一所示化合物和如式二所示化合物的混合物，对所述混合物分离的操作步骤为：可先用硅胶柱将粗产物分为两部分，一部分含有如式一所示化合物，另一部分含有如式二所示化合物(其中需要利用石油醚:乙酸乙酯＝50:1的洗脱剂)，再利用制备型高效液相分离可得到化合物I和II和III和IV纯品；

所述步骤iii为氧化反应，如式一所示化合物(I和II)可在碱性的CH₃OH-DCM溶液(体积比为1:1)中被氧气，所述碱可选自KOH或NaOH，所述氧气可选自空气或含有不同比例氧气的气体，氧化生成如式三所示化合物；

所述步骤iv为氧化偶联反应，需要利用单电子氧化试剂，所述氧化剂选自AgOAc、Ag₂CO₃或Ag₂O，所述氧化剂可引发化合物II发生自由基二聚反应生成psiguajdianone(VII)，溶剂可选自二氯甲烷或乙腈。

所述混源萜类化合物均从番石榴的叶子中获得。

本发明在测试得到安全给药浓度后，采用酶联免疫吸附实验测试了式一或式二或式三或式四示的番石榴混源萜类新化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌NO、TNF-α、PGE2的影响。这些化合物的抗炎作用(IC₅₀≤12.57μM)均强于阳性对照药物塞来昔布，其中有些化合物的抗炎作用是塞来昔布的近十倍或十几倍。

本发明的特点是化合物制备方法简便可行，化合物结构新颖，经相关实验表示本发明的多数化合物显示了比阳性药物更强的抗炎作用，该作用并不是通过抑制细胞增殖或毒性实现的，可在制备抗炎药物中进行应用。

总之，本发明提供了含有所述的具有式一或式二或式三或式四所示的结构或其药学上可接受的盐的药物，所述药物包括药学上可接受的辅助剂；所属药物为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂等。

所述混源萜类化合物或其在药学上可接受的盐单独或以混合物形式在制备抗炎药物的应用。

本发明提供一种抗炎的药物，其特征在于：包括有效量的所述的混源萜类化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。

本发明的式一或式二或式三或式四示化合物可与各种药物上可接受的载体、赋形剂或辅料配伍制成抗炎药物，用于炎症性疾病的治疗。

本发明化合物可单独或以药物组合物的形式给药。给药途径可以是口服、非肠道或局部给药。药物组合物可根据给药途径配成各种适宜的剂型。

本发明化合物的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药，如：皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服、腹膜内或静脉内给药方式。

当口服给药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如：硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当皮肤局部施用时，本发明可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或几种载体中。软膏剂使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质。如：单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素。包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。

本发明提供了式一或式二或式三或式四示化合物的抗炎活性，为开发新型抗炎药物提供了先导化合物。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明实施例述及的试剂均为本技术领域常规使用的试剂。

化合物的制备：

实施例1：Psiguajanone A(I)和Psiguajanone B(II)的制备

如式五所示，将间苯三酚衍生物(1,1004mg,3.89mmol)，多聚甲醛(2,351.4mg,11.7mmol)和醋酸钠(52.9mg,0.389mmol)移至反应管内，氩气保护下向体系中加入β-石竹烯(3,3.0mL,11.7mmol)并用20mL乙酸溶解，快速升温至90℃并搅拌4h；待反应结束后，降至室温，减压浓缩，粗产物经乙酸乙酯萃取，饱和NaHCO₃aq.和NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，再次减压浓缩得粗产物；将粗产物用硅胶柱粗分后，将化合物粗产物(约745.6mg,1.57mmol)、95％NaBH₃CN(920mg,7.86mmol)和0.1mg甲基橙转移至100mL的圆底烧瓶中，氩气保护下向瓶中加入30mL的四氢呋喃，搅拌5min将混合物溶解；向体系中滴加2M HCl水溶液以保持体系内pH值小于4(现象为溶液颜色呈红色)，搅拌过夜(16h)；待反应完成后，将混合物减压浓缩，剩余物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩后得粗产物；将粗产物用硅胶柱纯化，(石油醚/乙酸乙酯:50/1to 25/1)得到分别含有式一和式二的两部分，用制备型高压液相(waters column,CH₃OH/H₂O:90/10,3mL/min)进行分离，由式一部分得到Psiguajanone A和B。

Psiguajanone A(I)黄绿色液体:

R_f＝0.67(silica,hexane/EtOAc:4/1)；[α]22D＝+65.0(c＝1.0,CHCl₃)；IR(thinfilm,νcm^-1):3348,2685,1629,1599,1449；HR-ESI-MS calculated for[C₃₀H₃₆O₄+H]⁺:461.2686,found:461.2683。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.73(s,1H),8.02(s,1H),7.63(d,J＝7.2Hz,2H),7.58(t,J＝7.4Hz,1H),7.52(t,J＝7.5Hz,2H),4.88(br.s,1H),4.85(br.s,1H),2.63(dd,J＝15.8,4.7Hz,1H),2.48–2.41(m,2H),2.19–2.09(m,3H),2.08–2.03(m,1H),1.96(s,3H),1.94-1.91(m,2H),1.88–1.82(m,1H),1.73–1.67(m,2H),1.63-1.55(m,2H),1.43(m,1H),1.16(s,3H),1.00(s,3H),0.98(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ197.2,160.1,157.5,156.3,152.4,140.3,131.9,129.3,127.7,110.1,104.0,103.4,101.8,82.0,53.3,41.9,38.1,36.5,35.4,33.9,33.8,33.8,30.2,25.6,22.5,22.2,21.3,7.3。

Psiguajanone B(II)黄绿色液体:

R_f＝0.67(silica,hexane/EtOAc:4/1)；[α]22D＝-81.0(c＝1.0,CHCl₃)；IR(thinfilm,νcm^-1):3348,2721,1629,1596,1448；HR-ESI-MS calculated for[C₃₀H₃₆O₄+H]⁺:461.2686,found:461.2683。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ9.80(s,1H),7.97(s,1H),7.64(d,J＝7.7Hz,2H),7.59(t,J＝7.5Hz,1H),7.53(t,J＝7.4Hz,2H),4.82(br.s,1H),4.73(br.s,1H),2.87(q,J＝11.4Hz,1H),2.63(q,J＝9.4Hz,1H),2.48–2.41(m,1H),2.19–2.08(m,2H),2.06–2.01(m,2H),1.95(s,3H),1.82–1.74(m,2H),1.67(t,J＝10.2Hz,1H),1.64–1.60(m,1H),1.57–1.44(m,4H),1.09(s,3H),1.00(s,3H),0.96(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ197.2,160.4,157.6,156.3,155.2,140.2,132.0,129.4,127.7,109.7,104.0,103.4,101.6,82.1,56.4,42.6,39.3,38.6,36.7,34.6,34.0,33.4,29.7,24.7,22.7,22.6,20.2,7.4。

实施例2：合成Psiguajanone C(III)和D(IV)

将实施例1中的柱层析得到的第二部分在制备型高压液相上进行分离得到Psiguajanone C和D。

Psiguajanone C(III)黄绿色液体:

R_f＝0.49(silica,hexane/EtOAc:4/1)；[α]21D＝-220.0(c＝0.1,CHCl₃)；IR(thinfilm,νcm^-1):3397,2685,1613,1447；HR-ESI-MS calculated for[C₃₀H₃₆O₄+H]⁺:461.2686,found:461.2684。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ12.61(s,1H),7.43-7.39(m,3H),7.36(t,J＝7.3Hz,2H),5.48(s,1H),4.80(s,1H),4.78(s,1H),2.47(dd,J＝15.9,5.4Hz,1H),2.36–2.34(m,1H),2.25(dd,J＝18.1,9.3Hz,1H),2.10(s,3H),2.08–2.00(m,2H),1.87(m,1H),1.72–1.67(m,1H),1.61-1.57(m,2H),1.56–1.51(m,1H),1.47–1.43(m,1H),1.00–0.95(m,1H),0.94(s,3H),0.92(s,3H),0.90–0.78(m,6H).；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ200.7,161.6,158.3,154.2,152.5,143.6,129.7,127.6,126.9,109.9,105.4,101.4,99.8,81.4,52.7,41.8,37.2,36.4,35.1,34.1,33.6,33.6,30.3,26.0,22.2,22.1,19.9,7.1。

Psiguajanone D(IV)黄绿色液体:

R_f＝0.49(silica,hexane/EtOAc:4/1)；[α]21D＝+100.0(c＝0.1,CHCl₃)；IR(thinfilm,νcm^-1):3348,2686,1615,1448；HR-ESI-MS calculated for[C₃₀H₃₆O₄+H]⁺:461.2686,found:461.2684。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ12.68(s,1H),7.43–7.35(m,5H),5.36(s,1H),4.76(s,1H),4.65(s,1H),2.72(dd,J＝15.9,5.4Hz,1H),2.51(q,J＝9.0Hz,1H),2.35(t,J＝11.7Hz,1H),2.11(s,3H),2.04–1.96(m,2H),1.87(m,1H),1.72(t,J＝10.1Hz,1H),1.60(t,J＝10.1Hz,1H),1.48-1.30(m,4H),0.99(m,1H),0.93(s,3H),0.92(s,3H),0.9–0.86(m,2H),0.83(s,3H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ200.7,161.7,158.3,155.0,154.4,143.7,129.5,127.6,126.6,109.6,105.4,101.3,99.5,81.2,55.9,42.5,38.7,38.6,36.4,34.2,33.9,33.3,29.7,25.0,23.1,22.8,19.0,7.1。

实施例3：合成Psiguajanol A(V)和6’-epi-Psiguajanol A(VI)：

以实施例1中的产物Psiguajanone A(I)为原料，将该原料(217.0mg)和氢氧化钾(26mg)转移至圆底烧瓶内，抽排气，充入氧气。5.0mL体积比为1:1的CH₃OH/DCM混合溶液加入到反应瓶中并于室温下搅拌10h；待反应完全后，蒸干溶剂后加入30mL DCM，再依次加入饱和NH₄Cl水溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩后得粗产物；将粗产物直接用制备型高压液相分离便得到纯净的Psiguajanol A(V)(84.6mg)，产率为39％；6’-epi-PsiguajanolA(VI)41.2mg，产率为19％。

Psiguajanol A(V)粉红色油状液体:

[α]23D＝-170.0(c＝0.1,CHCl₃)；IR(thin film,νcm^-1):3445,2685,1627,1460；HR-ESI-MS calculated for[C₃₀H₃₆O₅+H]⁺:477.2636,found:477.2632.

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.52–7.49(m,3H),7.41(t,J＝7.7Hz,2H),4.93(s,1H),4.90(s,1H),3.81(br.s,1H),2.53(dd,J＝16.8,5.0Hz,1H),2.51–2.45(m,1H),2.42(dd,J＝18.0,9.5Hz,1H),2.19–2.04(m,4H),1.95–1.88(m,2H),1.87–1.81(m,1H),1.74–1.70(m,2H),1.68(s,3H),1.64(dd,J＝10.6,7.9Hz,1H),1.62–1.57(m,1H),1.49–1.44(m,1H),1.23(s,3H),1.00(s,3H),1.00(s,3H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ196.2,194.6,187.9,169.9,151.6,137.2,131.5,127.9,127.8,110.6,103.8,102.4,86.3,74.9,53.4,42.3,37.2,36.4,35.3,33.8,33.7,33.2,30.2,29.1,24.1,22.8,22.0,21.3。

6'-epi-Psiguajanol A(VI)粉红色油状液体:

[α]23D＝-170.0(c＝0.1,CHCl₃)；IR(thin film,νcm^-1):3445,2685,1627,1460；HR-ESI-MS calculated for[C₃₀H₃₆O₅+H]⁺:477.2636,found:477.2632。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.52-7.48(m,3H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),4.92(s,1H),4.87(s,1H),3.81(br.s,1H),2.52(dd,J＝16.6,5.1Hz,1H),2.46-2.42(m,2H),2.19-2.15(m,2H),2.04-2.01(m,2H),1.97-1.92(m,1H),1.90-1.86(m,1H),1.81-1.71(m,2H),1.71-1.67(m,1H),1.64(s,3H),1.63-1.61(m,1H),1.58-1.52(m,1H),1.47-1.42(m,1H),1.23(s,3H),0.98(s,3H),0.97(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ196.7,194.6,187.9,169.2,152.1,137.2,131.8,128.1,128.0,110.8,104.2,102.8,86.2,75.2,53.9,41.3,37.9,36.7,35.4,34.1,33.9,33.5,30.3,28.9,24.2,22.3,22.2,20.9。

实施例4：合成Psiguajdianone(VII)

将实施例1中的目标产物Psiguajanone B(II)(23mg)为原料和AgOAc(10.0mg)一起移至圆底烧瓶中，氩气保护下加入2mL超干乙腈，室温下避光搅拌2.5h；待反应完全后，将混合物用一只短硅胶柱过滤，减压浓缩后得到粗产物。以diphenylacetonitrile作为内标物测得NMR产率为52％，回收产率为57％。粗产物以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，目标产物集中在100:1的洗脱物中，收集浓缩后以DCM重结晶得目标产物纯品(8.7mg)。

b.p.＝185℃；[α]23D＝+90.0(c＝0.1,CHCl₃)；IR(thin film,νcm^-1):3347,2686,1665,1440；HR-ESI-MS calculated for[C₆₀H₇₀O₈+H]⁺:919.5143,found:919.5142。

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.47(d,J＝6.9Hz,4H),7.37–7.32(m,6H),4.81(s,2H),4.72(s,2H),2.33–2.24(m,6H),2.16–2.10(m,2H),2.00(dd,J＝15.6,10.4Hz,2H),1.91–1.87(m,2H),1.79–1.76(m,2H),1.69–1.62(m,4H),1.60–1.57(m,2H),1.49–1.43(m,4H),1.37(s,6H),1.33–1.27(m,4H),1.22–1.17(m,2H),0.95(s,6H),0.93(s,6H),0.91(s,6H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ194.3,191.2,188.5,171.4,155.5,138.9,129.6,128.0,126.8,109.3,107.0,104.2,86.2,58.5,55.9,41.5,38.9,38.6,36.2,33.7,33.4,32.2,29.7,23.6,22.3,22.2,19.7,17.7。

从番石榴叶子中提取分离式一、式二、式三和式四化合物。

番石榴的叶子均于2016年11月在厦门市植物园采摘，并由马教授鉴定。标本存放于兰州大学有机功能分子国家重点研究室，编号为20161121。

天然产物分离流程图见式六。用工业甲醇于室温下将3.2kg番石榴的干叶子了浸泡3次，每次7天。收集滤液并减压蒸馏除去溶剂，得到甲醇提取的粗浸膏256.5g，然后再用石油醚/丙酮作为洗脱剂将粗浸膏切成5段(Fr.A-E)。然后，选取了混源萜较为集中的极性段Fr.B进行正相柱层析得到四个亚组分(Fr.B1-Fr.B4)，洗脱体系为PE/EtOAc 100:1、50:1、30:1和10:1。得到Fr.B3之后，我们随后又利用手工反相柱层析RP-18对其进行切段并将其分为3部分(洗脱体系是体积比为80％、90％、100％MeOH/H₂O)，psiguajdianone的单晶便是Fr.B3b组份在静置时得到的。通过标准样品式一、式二和式三的引导，首先在Fr.B3b中找到了化合物I(1.3mg，命名为psiguajanone A)和化合物II(1.1mg，命名为psiguajanoneB)；在Fr.C2a中找到了化合物III(7.7mg，命名为psiguajanone C)和化合物IV(3.8mg，命名为psiguajanone D)。化合物V(1.4mg,命名为psiguajanol A)在Fr.C4中被分离得到。

抗炎体外实验及结果：

1实验方法

1.1主要溶液的配制

1.1.1 DMEM完全培养液：含1％双抗、10％胎牛血清的DMEM高糖培养液。

1.1.2冻存液：含90％胎牛血清和10％DMSO溶液。

1.1.3供试品配制：样品及阳性对照药塞来昔布，分别用DMSO配制成10μmol/L储存液，-20℃冰箱避光保存备用，加药时用无血清DMEM培养基稀释成20μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1.25μmol/L的供试品药液。

2.2实验分组：

空白对照组：细胞+培养基

LPS组：细胞+LPS(1μg/mL)+培养基

给药组：细胞+各化合物(20μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1.25μmol/L)+LPS(1μg/mL)+培养基

2.3 RAW264.7细胞培养

本专利选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7进行研究，用DMEM完全培养基培养。

复苏：将细胞从-80℃超低温冰箱中取出，迅速放入37℃水中并不时摇晃大约1min使细胞冻存液复融(勿将冻存管管口浸入水中),转移置于已有4mL完全培养液的离心管后离心，弃去上清液，加入5mL已配制好的无菌DMEM完全培养液，待吹打成单个细胞后转移到细胞培养瓶中，置于条件为37℃和5％CO2细胞培养箱中培养，次日换液。

传代：当细胞生长密度达到80％-90％时传代，用放置至室温的无菌PBS清洗细胞2遍，加入无菌胰酶1mL，置于培养箱消化1min,弃去胰酶，加入2mL的完全培养基，用无菌吸管轻轻吹打瓶底细胞，根据细胞的数量按比例传代。

冻存：按细胞传代步骤收集细胞，将细胞悬液移入带塞离心管内，1000rpm/min离心5min，弃去上清液，用预冷的细胞冻存液轻轻吹打成细胞至悬浮状态后。将细胞分装于已灭菌的冻存管中，同时标记细胞名称，代数与冻存日期，梯度冻存(4℃30min，-20℃2h，之后转移于-80℃超低温冰箱)。

2.4 cck-8法检测各化合物对细胞增值的影响

⑴取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，用完全培养液调整细胞浓度至1×105个/mL，备用；

⑵将上述浓度的细胞接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h，同时设置不加细胞的调零孔以及不加样品的DMSO对照组，每个浓度设三个复孔；

⑶取出贮存于-20℃的含各番石榴混源萜供试品药液，用恢复至室温的无血清DMEM高糖培养基稀释，按20μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1.25μmol/L的浓度将各化合物加入之前备用的细胞培养板中，对照组加入相应浓度的DMSO溶液，置于细胞培养箱孵育24h；

⑷孵育结束后，各孔加入10μL cck-8试剂，于细胞培养箱避光孵育2h，酶标仪450nm处检测其OD值。

细胞存活率＝药物组平均OD值/空白组平均OD值×100％

2.5各化合物对LPS诱导巨噬细胞分泌NO、TNF-α、PGE2的影响

方法：收集处于对数生长期的细胞，用配制好的无菌DMEM完全培养液稀释细胞浓度至1×10⁵个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL，置于细胞培养箱中培养；设空白对照组与LPS组，24h后取出加入20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L和1.25μmol/L各药物稀释液预作用2h，之后加入10μL的LPS(终浓度为1μg/mL)共孵育24h；24h后收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附实验(ELISA试剂盒)检测NO、TNF-α、PGE2含量，研究各化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α、PGE2的影响。

2.6酶联免疫吸附实验(ELISA试剂盒)操作步骤

1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7.显色：每孔先加入50μl显色剂A，再加入50μl显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

8.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

3.实验结果

3.1在各化合物对细胞增值无影响的安全浓度范围(20μM)内，各化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO的影响

3.2在各化合物对细胞增值无影响的安全浓度范围(20μM)内，各化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响

3.3在各化合物对细胞增值无影响的安全浓度范围(20μM)内，各化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌PGE2的影响

结论:在各化合物对细胞增值无影响的安全浓度范围内，化合物I-VII对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α、PGE2均具有良好抑制活性，并且这些化合物的抗炎作用(IC₅₀≤12.57μM)均强于阳性对照药物塞来昔布，其中有些化合物的抗炎作用是塞来昔布的近十倍或十几倍，因此可作为抗炎药物研发的先导化合物来开发新型抗炎药并用于治疗炎症性疾病。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。