阅读说明：本技术 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途 (Trypsin-like serine protease and uses thereof ) 是由 S·希波夫斯科夫 Z·邹 S·于 X·顾 于 2018-03-09 设计创作，主要内容包括：本文描述了新颖胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途。(Described herein are novel trypsin-like serine proteases and uses thereof.)

胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途

相关申请的交叉引用

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技术领域

本领域涉及新颖的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途。

背景技术

蛋白酶(protease)(也称为肽酶或朊酶(proteinase))是一种能够切割肽键的酶。蛋白酶经过多次进化，且不同种类的蛋白酶可以通过完全不同的催化机制进行相同的反应。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。

蛋白质水解可通过目前被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(例如像枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶)、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

丝氨酸蛋白酶属于羰基水解酶亚组，其包含具有广泛特异性和生物学功能的不同类别的酶。尽管存在这种功能多样性，但丝氨酸蛋白酶的催化机制已与至少两种遗传上不同的酶家族接近：1)枯草杆菌蛋白酶；和2)胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(也称为胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶)。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸内肽酶这两个家族具有非常相似的催化机制。这两个酶家族的三级结构汇集了由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的氨基酸的保守的催化三联体。

已经对丝氨酸蛋白酶(具体是枯草杆菌蛋白酶)进行了大量研究，这主要归因于它们在工业应用中有用。另外的工作集中于不利的环境条件(例如，暴露于氧化剂、螯合剂、极端温度和/或pH)，这些条件可能在各种应用中不利地影响这些酶的功能。

因此，对寻找新的丝氨酸蛋白酶(例如，原核生物起源的胰蛋白酶样蛋白酶)存在持续需求，所述新的丝氨酸蛋白酶可以在不利条件下使用并且保留或具有改善的蛋白水解活性和/或稳定性。

发明内容

在第一个实施例中，描述了一种具有丝氨酸蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽选自由以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少94％同一性的氨基酸序列的多肽；

c)与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；

d)与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。

在第二个实施例中，描述了一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且包含预测的前体氨基酸序列的分离的多肽，所述预测的前体氨基酸序列选自：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQID NO:9；和SEQ ID NO:12。

在第三个实施例中，描述了一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且包含蛋白酶催化区的分离的多肽，所述蛋白酶催化区选自：

a)与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列；

c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列；

在第四个实施例中，描述了一种重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列有效地连接到编码至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的核苷酸序列，所述至少一种多肽选自由以下组成的组：

a)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少94％同一性的氨基酸序列的多肽；

c)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；

d)包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。

所述生产宿主可以选自由以下组成的组的宿主：真菌、细菌、和藻类。

在第五个实施例中，描述了一种用于产生至少一种丝氨酸蛋白酶的方法，所述方法包括：

(a)用本文所述的重组构建体转化生产宿主；以及

(b)在产生至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的条件下培养步骤(a)的生产宿主。

根据该方法，任选地从所述生产宿主回收至少一种具有丝氨酸蛋白酶的多肽。

在另一方面，使用本文所述的任何方法可以获得含有丝氨酸蛋白酶的培养物上清液。

在仍另一方面，用于表达至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的重组微生物生产宿主包含如本文所述的重组构建体。

此外，所述生产宿主选自由以下组成的组：细菌、真菌和藻类。

在第六个实施例中，描述了动物饲料，所述动物饲料包含至少一种本文所述的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中所述丝氨酸蛋白酶以1-20g/吨饲料的量存在。

此外，这种动物饲料可以包含(a)至少一种直接饲喂微生物，或(b)至少一种其他酶，或(c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。

在第七个实施例中，描述了一种饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物包含至少一种本文所述的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽。此外，本文所述的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物包含(a)至少一种直接饲喂微生物、或(b)至少一种其他酶、或(c)至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶。

在第七个实施例中，存在如本文所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在第八个实施例中，描述了用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述颗粒状饲料添加剂组合物包含至少一种本文所述的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。

在另一个实施例中，该颗粒状饲料添加剂组合物的颗粒可以具有大于50微米并且小于2000微米的平均直径。

在另一方面，该饲料添加剂组合物可呈液体形式，并且此外，呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。

附图说明

图1.用于表达AprE-SspCPro29蛋白酶的质粒AprE-SspCPro29。

图2.丝氨酸蛋白酶SspCPro29、SspCPro33和ProAct对AAPF-pNA底物的酶活性剂量响应。

图3.丝氨酸蛋白酶SspCPro23、SspCPro29、SspCPro33和SspCPro59的pH曲线。

图4.丝氨酸蛋白酶SspCPro23、SspCPro29、SspCPro33和SspCPro59的温度曲线。

图5A.在pH 6，通过OPA检测的丝氨酸蛋白酶SspCPro29和SspCPro33对玉米大豆粉的水解。

图5B.在pH 6，通过BCA检测的丝氨酸蛋白酶SspCPro29和SspCPro33对玉米大豆粉的水解。

图6.在pH 10.3，SspCPro29和SspCPro33蛋白酶在GSM-B ADW洗涤剂中的清洁性能。

图7.在16℃，SspCPro29、SspCPro33和BPN’Y217L蛋白酶在液体衣物洗涤剂中的清洁性能。

图8.在32℃，SspCPro29、SspCPro33和BPN’Y217L蛋白酶在液体衣物洗涤剂中的清洁性能。

图9.在16℃，SspCPro29、SspCPro33和GG36蛋白酶在粉末衣物洗涤剂中的清洁性能。

图10.在32℃，SspCPro29、SspCPro33和GG36蛋白酶在粉末衣物洗涤剂中的清洁性能。

图11A-11D.多种链霉菌属物种(Streptomyces sp)胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的全长序列的多重序列比对。

图12A-12B.链霉菌属物种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的预测的催化核心序列的多重序列比对。

以下序列遵循37C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(2009)、以及欧洲专利公约(EPC)和专利合作条约(PCT)法规第5.2和49.5(a-bis)条、以及行政章程第208款和附件C关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822中所述的条例。

SEQ ID NO:1列出了从链霉菌属物种C009分离的SspCPro29基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2列出了SspCPro29前体蛋白质的预测的信号序列。

SEQ ID NO:3列出了SspCPro29前体蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4列出了从链霉菌属物种C001分离的SspCPro33基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5列出了SspCPro33前体蛋白质的预测的信号序列。

SEQ ID NO:6列出了SspCPro33前体蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7列出了从链霉菌属物种C003分离的SspCPro23基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8列出了SspCPro23前体蛋白质的预测的信号序列。

SEQ ID NO:9列出了SspCPro23前体蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10列出了从链霉菌属物种C055分离的SspCPro59基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11列出了SspCPro59前体蛋白质的预测的信号序列。

SEQ ID NO:12列出了SspCPro59前体蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13列出了合成的AprE-SspCPro23的核苷酸序列，

SEQ ID NO:14列出了AprE-SspCPro29的核苷酸序列，

SEQ ID NO:15列出了AprE-SspCPro33的核苷酸序列，

SEQ ID NO:16列出了AprE-SspCPro59基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO:17列出了用于指导重组蛋白质在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中分泌的AprE信号序列。

SEQ ID NO:18列出了针对SspCPro29的预测的催化结构域。

SEQ ID NO:19列出了针对SspCPro 23的预测的催化结构域。

SEQ ID NO:20列出了针对SspCPro 33的预测的催化结构域。

SEQ ID NO:21列出了针对SspCPro 59的预测的催化结构域。

SEQ ID NO:22列出了针对SspCPro29的预测的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO:23列出了针对SspCPro33的预测的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO:24列出了针对SspCPro23的预测的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO:25列出了针对SspCPro59的预测的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO:26列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_064069271的序列。

SEQ ID NO:27列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_043225562的序列。

SEQ ID NO:28列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_024756173的序列。

SEQ ID NO:29列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_030548298的序列。

SEQ ID NO:30列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_005320871的序列。

SEQ ID NO:31列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_055639793的序列。

SEQ ID NO:32列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WO 2015048332-44360的序列。

SEQ ID NO:33列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WO 2015048332-44127的序列。

SEQ ID NO:34列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_030313004的序列。

SEQ ID NO:35列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_030212164的序列。

SEQ ID NO:36列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_030749137的序列。

SEQ ID NO:37列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_031004112的序列。

SEQ ID NO:38列出了链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶WP_026277977的序列。

SEQ ID NO:39列出了链霉菌蛋白酶(Streptgrisin)C的催化结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO:40列出了BPN’-Y217L蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:41列出了GG36蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:42列出了白色链霉菌(S_albulus)WP 064069271的残基204-394的氨基酸序列。

SEQ ID NO:43列出了S_sp_NRRL_F-5193_WP_043225562蛋白质的残基204-394的氨基酸序列。

SEQ ID NO:44列出了脱叶链霉菌(S_exfoliatus)_WP_024756173的残基201-391的氨基酸序列。

SEQ ID NO:45列出了正白色链霉菌(S_albus)_WP_030548298的残基207-397的氨基酸序列。

SEQ ID NO:46列出了始旋链霉菌(S_pristinaespiralis)_WP_005320871的残基204-394的氨基酸序列。

SEQ ID NO:47列出了列文虎克链霉菌(S_leeuwenhoekii)_WP_029386953的残基138-328的氨基酸序列。

SEQ ID NO:48列出了链霉菌属物种CNT372_WP_026277977的残基207-397的氨基酸序列。

SEQ ID NO:49列出了蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)_P_044383230的残基208-398的氨基酸序列。

SEQ ID NO:50列出了雪白链霉菌(Streptomyces niveus)_WP_069630550的残基193-383的氨基酸序列。

SEQ ID NO:51列出了委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)_WP_055639793的残基201-391的氨基酸序列。

SEQ ID NO:52列出了链霉菌属物种NRRL F-5755_WP_053699044的残基211-401的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53列出了弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)_WP_031135572的残基205-395的氨基酸序列。

SEQ ID NO 54列出了来自图12的预测的催化结构域共有序列。

具体实施方式

引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用以其全文并入本文。

在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另有特别说明，以下定义适用。

在元素或组分前的冠词“一个/种(a/an)”和“所述(the)”在关于所述元素或组分的实例(即，出现)的数目旨在是非限制性的。因此，“一个/种(a/an)”和“所述(the)”应理解为包括一个/种或至少一个/种，并且元素或组分的单数词语形式还包括复数，除非所述数字明显意指单数。

术语“包含”意指如权利要求书中所提及的说明的特征、整数、步骤或组分的存在，而并未排除一个或多个其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由……组成”和“由……组成”所涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由……组成”旨在包括由术语“由……组成”所涵盖的实施例。

在存在的情况下，所有范围是包含端值的和可组合的。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。

如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5，除非所述pH值另有具体定义。

在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

术语“蛋白酶”意指衍生自微生物(例如真菌、细菌)或衍生自植物或动物的蛋白质或多肽结构域，且其具有催化肽键在蛋白质主链的一个或多个不同位置的切割的能力(例如E.C.3.4)。术语“蛋白酶”、“肽酶”和“朊酶”可以互换地使用。蛋白酶可以在动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中找到。蛋白质水解可通过目前基于其催化机理被分为以下六大组的酶实现：天冬氨酰蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

术语“丝氨酸蛋白酶”是指切割蛋白质中的肽键的酶，其中丝氨酸在酶的活性位点处充当亲核氨基酸。基于其结构将丝氨酸蛋白酶分为两大类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶。在MEROPS蛋白酶分类系统中，蛋白酶分布在16个超家族和众多家族中。家族S8包括枯草杆菌蛋白酶并且家族S1包括胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)酶。亚家族S1E包括来自链霉菌生物体的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，例如链霉菌蛋白酶(Streptogricin)A、B和C。术语“丝氨酸蛋白酶”、“胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”和“胰凝乳蛋白酶样蛋白酶”在本文中可互换地使用。

术语“动物”和“受试者”在本文中可互换地使用。“动物”包括所有非反刍动物(包括人类)和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

“饲料”和“食品”分别意指任何天然或人造饮食、膳食等，或此类膳食的组分，其意在或适合于分别被非人类动物和人类食用、摄取、消化。

如本文所用的，术语“食品”以广义使用，并且涵盖用于人类的食品和食品产品以及用于非人类动物的食品(即饲料)。

关于在饲养家畜时饲喂动物的产品，使用术语“饲料”。术语“饲料”和“动物饲料”可互换地使用。

如本文所用的，术语“直接饲喂微生物”(“DFM”)是活的(有活力的)天然发生的微生物的来源。DFM可以包含一个或多个这样的天然发生的微生物，例如细菌菌株。DFM的类别包括芽孢杆菌属(Bacillus)、乳酸菌和酵母菌。因此，术语DFM涵盖以下一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母及其组合。

芽孢杆菌纲(Bacilli)是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可以承受环境条件，如热、湿气和一定范围的pH。这些孢子当被动物摄入后会萌发成有活性的营养细胞，并可用于粗粉和压成丸粒的饮食中。乳酸菌是革兰氏阳性球菌，可产生对病原体有拮抗作用的乳酸。由于乳酸菌似乎有点对热敏感，所以它们不能用于压成丸粒的饮食中。乳酸菌的种类包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌(Lactobacillus)和链球菌(Streptococcus)。

术语“益生菌”意指通过选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性来有益地影响宿主的不可消化食物成分。

如本文所用的，术语“益生菌培养物”定义了当例如以足够数量摄取或局部应用时，有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一个或多个可证明的健康益处)的活的微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可以改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用的，术语“益生菌”还涵盖可以刺激免疫系统的有益分支并同时减少在粘膜表面(例如肠)中的炎症反应的活的微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但是已经表明，至少10⁶-10¹²，优选至少10⁶-10¹⁰，优选10⁸-10⁹cfu作为日剂量将在受试者中有效地实现有益的健康效果。

如本文所用的，术语“CFU”意指“集落形成单位”并且是代表衍生自单个祖细胞的细胞聚集的集落中的活细胞的测量。

术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)任何物质，包括但不限于，任何宿主细胞、酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，其至少部分地从与其天然相关的天然发生的成分中的一种或多种或全部中去除；(3)任何经人手修饰的物质(相对于自然界中发现的物质)；或(4)相对于与其天然相关联的其他成分，通过增加物质的量进行修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换地使用并是指单链或双链的RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非-天然的或改变的核苷酸碱基。呈DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成的DNA的一个或多个区段构成。

术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定材料或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。

如本文所用的，术语“功能测定”是指提供蛋白质活性指示的测定法。在一些实施例中，所述术语是指其中针对以其通常的能力发挥功能的能力来分析蛋白质的测定系统。例如，在蛋白酶的情况下，功能测定涉及确定蛋白酶水解蛋白质底物的有效性。

术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照IUPAC-IUB生物化学术语联合委员会(Joint Commission on BiochemicalNomenclature，JCBN)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母X是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。突变可以由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(G)突变为丝氨酸(S)表示为“G087S”或“G87S”。当描述修饰时，位置后面在括号中列出的氨基酸指示由任何列出的氨基酸在所述位置处的取代清单。例如，6(L,I)意指位置6可以被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，F/V指示特定位置，在所述位置处可以具有苯丙氨酸或缬氨酸。

“前序列(prosequence)”或“前肽序列(propeptide sequence)”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所必需的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。蛋白酶通常表达为前酶。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前肽序列的蛋白质、多肽或酶的功能形式。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羧基末端的前序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。

关于氨基酸序列或核酸序列，术语“野生型”指示氨基酸序列或核酸序列是天然的或天然存在的序列。如本文所用的，术语“天然存在的”是指在自然界中发现的任何物质(例如蛋白质、氨基酸或核酸序列)。相反，术语“非天然存在”是指在自然界中没有发现的任何物质(例如，在实验室中生产的重组核酸和蛋白质序列、或野生型序列的修饰)。

如本文所用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文所用的，“对应区”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的DNA序列编码并且在含有此类DNA序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cDNA来源的DNA序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。

关于本文所述的多肽，术语“参比”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、***或缺失的天然存在的多肽，以及在一个或多个氨基酸位置处包括一个或多个人造的取代、***或缺失的天然存在的或合成的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语“参比”是指在一个或多个核苷处不包括人造的取代、***或缺失的天然存在的多核苷酸，以及在一个或多个核苷处包括一个或多个人造的取代、***或缺失的天然存在的或合成的多核苷酸。例如，编码野生型或亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在表2中可以找到本文中使用的缩写以鉴定特定氨基酸。

表2.单个字母和三个字母的氨基酸缩写

本领域技术人员将认识到，在保留与公开的氨基酸序列相关的功能的同时，可以对本文公开的氨基酸序列进行修改。例如，基因的改变导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性是常见的，这是本领域所熟知的。例如，本文公开的氨基酸序列中的任何特定氨基酸都可以替代另一种功能上等价的氨基酸。出于本公开的目的，取代被定义为以下五组中的一组中的交换：

1.小的脂肪族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro、Gly)；

2.极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性、带正电荷的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.大的芳香族残基：Phe、Tyr、和Trp。

因此，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。相似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基(例如，热稳定丝氨酸取代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸取代精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变所述蛋白的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如确定所编码的产物的生物活性的保留情况。

术语“密码子优化的”，如它是指用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区，是指核酸分子的基因或编码区中密码子的改变，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变DNA编码的多肽。

术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括所述编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含不是在自然界中一起被发现的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自同一来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含***非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。

术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，所述编码序列在启动子的转录控制下)时，启动子与所述编码序列有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调控序列上。

术语“调控序列”或“控制序列”在本文中可互换地使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列可以以正义或反义方向有效地连接到目的编码序列/基因。

“启动子”或“启动子序列”是指定义在何处RNA聚合酶开始基因转录的DNA序列。启动子序列通常直接位于转录起始位点的上游或5'末端。启动子可以全部衍生自天然或天然发生的序列，或者由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可能指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境或生理条件的表达(“诱导型启动子”)。

所述“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括编码能够影响mRNA加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。

如本文所用的，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入到宿主生物体中。所述核酸分子可以作为线性或环状形式的DNA引入。所述核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可以整合进生产宿主的基因组中。含有转化的核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。

如本文所用的，术语“重组”是指例如通过化学合成或者通过经基因工程技术操纵分离的核酸区段来将两个原本分离的核酸序列区段进行人工组合。例如，其中一个或多个区段或基因已经被***的DNA，其自然地或通过实验室操作，从不同的分子、同一分子的另一部分或人工序列***，导致在基因中引入新的序列并随后在生物体中引入。术语“重组”、“转基因”、“转化”、“工程化”或“外源基因表达修饰”在本文中可互换地使用。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文可互换地使用。重组构建体包含核酸片段，例如在自然界中未全部一起发现的调控序列和编码序列的人工组合。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然发生的方式排列的调控序列和编码序列。这样一个构建体可以单独使用或可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上以便成功转化，选择和繁殖宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可以导致不同水平和模式的表达(Jones等人,(1985)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]4:2411-2418；De Almeida等人,(1989)Mol Gen Genetics[分子和普通遗传学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件，从而获得显示所需表达水平和模式的品系。此类筛选可以是完成的标准分子生物学测定、生物化学测定以及其他测定，这些测定包括DNA的印迹分析、mRNA表达的Northern分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白表达的免疫印迹分析、酶测定或活性测定、和/或表型分析。

术语“生产宿主”、“宿主”和“宿主细胞”在本文中可互换地使用，并且指任何生物体或其细胞，无论是人类还是非人类，其中重组构建体可以稳定或瞬时引入以表达基因。所述术语涵盖了亲本细胞的任何后代，由于在繁殖期间发生的突变，其与亲本细胞不同。

术语“百分比同一性”是如通过比较这些序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列的串之间的匹配核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于以下文献中所述的那些：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约州(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑),Academic Press[学术出版社],纽约州(1993)；Computer Analysis ofSequence Data[序列数据的计算机分析],第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡玛纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学的序列分析](von Heinje,G.编辑),Academic Press[学术出版社](1987)；Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约州(1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。

如本文所用的，“％同一性”或“百分比同一性”或“PID”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括BLAST算法(参见Altschul等人，J Mol Biol[分子生物学杂志]，215:403-410,1990；以及Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]，90:5873-5787,1993)。BLAST程序使用若干个搜索参数，其中大部分设置为默认值。NCBI BLAST算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(Altschul等人，Nucleic AcidsRes[核酸研究]，25:3389-3402,1997；以及Schaffer等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：相邻字长阈值＝11；E值截止值＝10；评分矩阵＝NUC.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认BLAST参数包括：字长大小＝3；E值截止值＝10；评分矩阵＝BLOSUM62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。BLAST算法将“参比”序列称为“查询”序列。

如本文所用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自NCBI BLAST的BLASTP和PSI-BLAST使用阈值(E值截止值)0.001进行。(Altschul SF,Madde TL,Shaffer AA,Zhang J,Zhang Z,Miller W,Lipman DJ.Gapped BLAST and PSI BLAST a new generation of protein databasesearch programs.[空位BLAST和PSI BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序]NucleicAcids Res[核酸研究]1997年第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可以将蛋白质序列分组。可以使用氨基酸序列构建系统发育树。

可以使用LASERGENE生物信息计算包的Megalign程序(DNASTAR公司，麦迪逊，威斯康星州)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax公司，贝塞斯达，马里兰州)或EMBOSS开放软件包(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和百分比同一性计算。可以使用具有默认参数的CLUSTAL比对方法(例如CLUSTALW；例如版本1.83)(Higgins和Sharp,CABIOS，5:151-153(1989)；Higgins等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；和Chenna等人,Nucleic AcidsRes[核酸研究]31(13):3497-500(2003))(其可通过欧洲生物信息学研究所从欧洲分子生物学实验室获得)来执行序列的多重比对。用于CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(例如，Gonnet250)、蛋白结束空位(ENDGAP)＝-1、蛋白空位距离(GAPDIST)＝4和KTUPLE＝1。在一个实施例中，在慢比对情况下，使用快或慢比对以及默认设置。可替代地，可以修饰使用CLUSTALW方法(例如版本1.83)的参数以同样使用KTUPLE＝1、空位罚分＝10、空位延伸＝1、矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)、窗口(WINDOW)＝5和顶部存储的对角线(TOP DIAGONALS SAVED)＝5。

MUSCLE程序(Robert C.Edgar,MUSCLE:multiple sequence alignment withhigh accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)是多重序列比对算法的又另一个实例。

本文公开了多种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。在某些实施例中可以使用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，某些实施例中的变体多肽序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有与所公开的序列相同的功能，或具有所公开的序列的功能的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。

关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参比多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然发生的或人造的氨基酸取代、***或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参比多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参比多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。

术语“质粒”、“载体”和“盒”意指染色体外元件，其通常携带非细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常呈双链DNA的形式。这样的元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链DNA或RNA的、处于直链或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体、或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经被连接或重组成能够将目的多核苷酸引入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含基因并具有促进特定宿主细胞转化的基因之外的元件的特定载体。术语“表达盒”和“表达载体”在本文中可互换地使用，并且是指含有基因并具有允许在宿主中表达所述基因的基因之外的元件的特定载体。

如本文所用的，术语“表达”是指处于前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质)的生产。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

基因的表达涉及所述基因的转录并将mRNA翻译成前体或成熟蛋白。“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何原肽(prepeptide)或前肽(propeptide)的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的原肽和前肽。原肽或前肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器的基因组，导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移至宿主生物体的细胞核中或含有DNA的细胞器中，导致基因表达而无整合或稳定的遗传。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”生物体。

所述表达载体可以是用于转化本领域已知的合适的生产宿主的任何数量的载体或盒中的一种。通常，所述载体或盒将包括指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记、和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体通常包括含有转录起始控制的基因的5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区。两个控制区都可以衍生自与转化的生产宿主细胞的基因同源的基因和/或对所述生产宿主来说是天然的基因，尽管这样的控制区不需要如此衍生。

可以包含在表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员熟悉的。实际上任何能够驱动这些基因的启动子都是合适的，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属(Pichia)中表达)；以及lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达)以及用于在芽孢杆菌中表达的amy、apr、npr启动子和各种噬菌体启动子。在一些实施例中，所述启动子是组成型或诱导型启动子。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在一些实施例中，启动子是诱导型或阻抑型的，原因是环境因素的变化，这些环境因素包括但不限于碳、氮或其他可利用的营养素、温度、pH值、渗透压、一种或多种重金属的存在、抑制剂的浓度、应力或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一些实施例中，诱导型或阻抑型的启动子是通过代谢因素诱导或抑制的，例如某些碳源的水平、某些能量源的水平、某些分解代谢物的水平、或上述因素的组合，如在本领域中已知的。在一个实施例中，所述启动子是对宿主细胞天然的启动子。例如，当里氏木霉(T.reesei)为宿主时，启动子是天然的里氏木霉启动子，例如cbh1启动子，其保藏在GenBank中的登录号D86235下。

合适的启动子的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1、和xyn2，产黄青霉菌(P.chrysogenus)的阻抑型酸性磷酸酶基因(phoA)启动子(参见例如Graessle等人,(1997)Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学],63:753-756)，葡萄糖阻抑型PCK1启动子(参见例如Leuker等人,(1997),Gene[基因],192:235-240)，麦芽糖诱导型，葡萄糖阻抑型MET3启动子(参见Liu等人,(2006),Eukary.Cell[真核细胞],5:638-649)，pKi启动子和cpc1启动子。其他有用启动子的实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见Nunberg等人，(1984)Mol.Cell Biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和Boel等人，(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见例如EPA 137280Al)。

控制转录终止的DNA片段也可以衍生自对优选的生产宿主细胞来说是天然的各种基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，所述表达载体包括衍生自优选的宿主细胞的终止控制区。

所述表达载体可以包括在所述生产宿主中，具体是在微生物生产宿主的细胞中。所述生产宿主细胞可以是在真菌或细菌家族中发现的微生物宿主，并且其在大范围的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、藻类和真菌(如丝状真菌和酵母)中的任何一种可以合适地容纳所述表达载体。

在所述生产宿主细胞中包括所述表达载体可以用于表达目的蛋白质，使得其可以存在于细胞内、细胞外或细胞内和细胞外的组合中。与用于回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法相比，细胞外表达使从发酵产物中回收所需蛋白质更容易。

本公开的某些实施例涉及具有丝氨酸蛋白酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自：

a)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少94％同一性的氨基酸序列的多肽；

c)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；

d)与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，公开了具有丝氨酸蛋白酶活性并且包含预测的前体氨基酸序列的分离的多肽，所述预测的前体氨基酸序列选自：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ IDNO:9；和SEQ ID NO:12。

在仍另一个实施例中，公开了具有丝氨酸蛋白酶活性并且包含蛋白酶催化区的分离的多肽，所述蛋白酶催化区选自由以下组成的组：

a)与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列；

b)与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列；

c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列

其他实施例包括一种重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列有效地连接到编码至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的核苷酸序列，所述至少一种多肽选自：

a)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少94％同一性的氨基酸序列的多肽；

c)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；

d)包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。

所述生产宿主选自由以下组成的组：真菌、细菌和藻类。所述生产宿主可以用于产生至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法中，所述方法包括：

(a)用本文所述的重组构建体转化生产宿主；以及

(b)在产生至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的条件下培养步骤(a)的生产宿主。

根据该方法，任选地从所述生产宿主回收本文所述的至少一种多肽。在另一方面，通过使用本文所述的任何方法获得含有丝氨酸蛋白酶的培养物上清液。

本文还描述了用于表达至少一种本文所述的多肽的重组微生物生产宿主，所述重组微生物生产宿主包含本文所述的重组构建体。在另一个实施例中，该重组微生物生产宿主选自由以下组成的组：细菌、真菌和藻类。

表达将被理解为包括产生至少一种本文所述的多肽的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

利用克隆方法对核酸序列进行修饰的技术是本领域中众所周知的。

编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的多核苷酸可以以多种方式操作，以提供多核苷酸在芽孢杆菌属宿主细胞中的表达。在***核酸构建体或载体之前对多核苷酸序列的操作可能是希望的或必需的，这取决于核酸构建体或载体或芽孢杆菌属宿主细胞。利用克隆方法修饰核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

上文定义了调控序列。它们包括表达胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶所必需或有利的所有组分。每种控制序列对于编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的核酸序列或可以是天然的或外来的。这种调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。可以提供带接头的调控序列以引入的特定的限制性位点，以利于将调控序列与编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的编码区连接。

包含编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的多核苷酸的核酸构建体可以与一种或多种控制序列有效地连接，所述控制序列能够在与控制序列相容的条件下指导编码序列在芽孢杆菌属宿主细胞中的表达。

每种控制序列对于编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的多核酸或可以是天然的或外来的。这种控制序列包括但不限于前导序列、启动子、信号序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。可以提供带接头的控制序列以引入的特异性限制性位点，以利于将控制序列与编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的多核苷酸的编码区连接。

控制序列可以是适当的启动子区，即芽孢杆菌属宿主细胞识别的核苷酸序列，用于表达编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的多核苷酸。启动子区含有介导胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶表达的转录控制序列。启动子区可以是在所选择的芽孢杆菌属宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，并且可以从指导合成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主细胞同源或异源的基因获得。

启动子区可包含单个启动子或启动子的组合。当启动子区包含启动子的组合时，启动子优选地串联。启动子区的启动子可以是任何启动子，所述启动子可以引发编码在目的芽孢杆菌属宿主细胞中具有生物活性的多肽的多核苷酸的转录。启动子相对于编码具有生物活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的或其组合。这种启动子可以从指导合成具有生物活性的胞外或胞内多肽的、与芽孢杆菌属宿主细胞同源或异源的基因中获得。

因此，在某些实施例中，启动子区包含从细菌来源获得的启动子。在其他实施例中，启动子区包含从***或革兰氏阴性细菌获得的启动子。***包括但不限于芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)和大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和脲原体属(Ureaplasma)。

启动子区可包含获得自芽孢杆菌属菌株(例如，粘琼脂芽孢杆菌(Bacillusagaradherens)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis))的启动子；或获得自链霉菌属菌株(例如，变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus))的启动子。

用于在本公开的方法中指导编码具有生物活性的多肽的多核苷酸转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分、原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proceedings of the National Academy of Sciences USA[美国科学院院报]75:3727-3731)、和巨大芽孢杆菌xylA基因(Rygus和Hillen,1992,J.Bacteriol.[细菌学杂志]174:3049-3055；Kim等人,1996,Gene[基因]181:71-76)。其他实例是spo1细菌噬菌体启动子和tac启动子的启动子(DeBoer等人,1983,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA[美国科学院院报]80:21-25)。另外的启动子描述于在Scientific American[科学美国人]中的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”,1980,242:74-94；和Sambrook,Fritsch和Maniatis,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册]，第2版，冷泉港，纽约州。

启动子区可以包含是“共有”启动子的启动子，所述启动子具有针对“-35”区的序列TTGACA和针对“-10”区的TATAAT。共有启动子可以从任何可以在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的启动子获得。“共有”启动子的构建可以通过使用本领域熟知的方法进行定点诱变来完成，以产生更完美地符合所建立的共有序列的启动子，所述共有序列是针对枯草芽孢杆菌的营养“σA型”启动子的“-10”和“-35”区(Voskuil等人,1995,Molecular Microbiology[分子微生物学]17:271-279)。

控制序列也可以是合适的转录终止子序列，如芽孢杆菌宿主细胞识别的终止转录的序列。终止子序列与编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列的3'末端有效地连接。可以使用任何在芽孢杆菌宿主细胞中起作用的终止子。

控制序列也可以是合适的前导序列，即对芽孢杆菌宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与核苷酸序列的5'末端有效地连接，指导具有生物活性的多肽的合成。在所选择的芽孢杆菌宿主细胞中起作用的任何前导序列均可用于本发明。

控制序列也可以是mRNA稳定序列。术语“mRNA稳定序列”在本文中定义为位于启动子区下游和编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的多核苷酸编码序列上游的序列，其中启动子区有效地连接，使得可以加工从启动子区合成的所有mRNA以产生在转录物的5'末端具有稳定序列的mRNA转录物。例如，在mRNA转录物的5'末端存在这种稳定序列会增加它们的半衰期(Agaisse和Lereclus,1994，同上，Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3'端互补。在某些实施例中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的转录物，在转录物的5'末端具有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选地与细菌16S核糖体RNA的3'端互补。参见，美国专利号6,255,076和美国专利号5,955,310。

然后可以使用本领域已知的方法或本文所述的那些方法将核酸构建体引入芽孢杆菌属宿主细胞中，用于引入和表达胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。

包含编码目的蛋白质的目的DNA的核酸构建体也可以如上所述类似地构建。

为了获得引入的DNA的目的蛋白质的分泌，控制序列还可以包含信号肽编码区，所述信号肽编码区编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以指导表达的多肽进入细胞分泌途径。信号肽编码区相对于多肽可以是天然的或可以从外源获得。核苷酸序列的编码序列的5'末端可以固有地含有信号肽编码区，所述区在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区的区段天然连接。可替代地，编码序列的5'末端可含有信号肽编码区，所述区对编码分泌多肽的编码序列部分而言是外源的。在编码序列通常不含有信号肽编码区的情况下，可能需要外源信号肽编码区。可替代地，外源信号肽编码区可简单地取代天然信号肽编码区，以相对于通常与编码序列相关的天然信号肽编码区获得增强的多肽分泌。信号肽编码区可以从芽孢杆菌属物种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。然而，任何能够指导表达的多肽进入所选择的芽孢杆菌宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。

用于芽孢杆菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从以下获得的信号肽编码区：来自芽孢杆菌NCIB 11837的生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。

因此，可以构建包含编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶构建体的核酸的多核苷酸构建体，所述胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶构建体包含编码目的多肽(POI)的核酸，使宿主细胞表达目的多肽。由于遗传密码中已知的简并性，编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用本领域常规技术进行设计和制备。例如，可以应用密码子优化来优化具体宿主细胞中的生产。

可以将编码目的蛋白质的核酸掺入载体中，其中可以使用熟知的转化技术(例如本文所公开的那些技术)，将所述载体转移至宿主细胞中。

载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如，包含编码POI的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到本公开的芽孢杆菌属表达宿主中，使得编码蛋白质的核酸(例如，ORF)可以被表达为功能性蛋白质。

可用常规技术修饰以包含并且表达编码POI的核酸的代表性载体是载体p2JM103BBI。

可以将编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶或POI的多核苷酸有效地连接到允许在宿主细胞中转录的合适的启动子上。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，并且可以衍生自编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。评估启动子活性/强度的手段对于本领域技术人员是常规的。

(尤其是在细菌宿主细胞中)用于指导编码本公开的comS1多肽或POI的多核苷酸序列的转录的适合的启动子的实例包括大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。

用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子可以是PCT国际公开WO 2001/51643中所阐述的野生型aprE启动子、突变体aprE启动子或共有aprE启动子。在某些其他实施例中，用于指导编码POI的多核苷酸序列的转录的启动子是野生型spoVG启动子、突变体spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber，1991)。

用于指导编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶或POI的多核苷酸序列转录的启动子是核糖体启动子，例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白质启动子。核糖体RNA启动子可以是衍生自枯草芽孢杆菌的rrn启动子，更具体地，rrn启动子可以是来自枯草芽孢杆菌rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中，核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO 2013/086219中阐述的来自枯草芽孢杆菌的P2 rrnI启动子。

适合的载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类赋能序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。

合适的载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。

适合的表达载体典型地包括克隆载体的组分，例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体典型地还包含控制核苷酸序列，例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。

此外，适合的表达载体可以进一步包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将目的蛋白质靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样的靶向序列可以是例如氨基酸序列“SKL”。对于在控制序列的指导下进行表达，将目的蛋白质的核酸序列以适合的方式有效地连接到控制序列，使得表达发生。

如本文所述的用于连接编码目的蛋白质的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件，并将它们***到包含复制必需信息的适合载体中的方案是本领域技术人员熟知的。

包含多核苷酸构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生POI的宿主细胞。所述细胞可以用编码POI的DNA构建体转化，方便地通过将构建体(按一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的，因为如此引入的DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行，例如通过同源或异源重组。例如，PCT国际公开号WO 2002/14490描述了芽孢杆菌转化的方法、其转化体及其文库。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

在其他实施例中，从表达宿主中缺失基因是有利的，其中基因缺陷可以通过表达载体治愈。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的细菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失，通过***失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。

用于转化细菌和培养细菌的技术是本领域中标准和熟知的。它们可以用于转化本发明的改善宿主以产生目的重组蛋白。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括如下技术如：转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染；用磷酸钙DNA沉淀孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；基因枪(gene gun)或生物射弹转化和原生质体融合等。Brigidi等人还公开了细菌的转化和表达方法(1990)。Ferrari等人(美国专利号5,264,366)描述了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的一般转化和表达方案。

将核酸转化为丝状真菌(例如曲霉属物种(Aspergillus spp.)，例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)、灰腐质酶(H.grisea)、特异腐质霉(H.insolens)和里氏木霉)的方法是本领域熟知的。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如EP 238023中。用于转化木霉属宿主细胞的合适的程序描述于例如Steiger等人，2011,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]77:114-121。

生产宿主的选择可以是任何合适的微生物，如细菌、真菌和藻类。

典型地，选择将取决于编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的基因及其来源而变化。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染(例如脂质转染介导的和DEAE-右旋糖酐介导的转染)；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。公开了可以使用的一般方法的基本文献包括Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版,1989)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表达：实验室手册](1990)；以及Ausubel等人编辑,Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学现代方法](1994))。本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或一部分稳定整合到宿主细胞(例如丝状真菌宿主细胞)的基因组中。然而，还考虑了导致维持自主复制的染色体外转化载体的转化。

许多标准转染方法可以用于产生表达大量蛋白酶的细菌和丝状真菌(例如曲霉或木霉)细胞系。用于将DNA构建体引入产生纤维素酶的木霉属菌株的一些公开方法包括：Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,(1993)Curr.Genet.[现代遗传学]24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,(1990)Curr.Genet.[现代遗传学]17:169-174；以及Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,(1987)Gene[基因]6:155-164，还参见USP 6.022,725；USP 6,268,328和Nevalainen等人,“The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes[木霉属的分子生物学及其在同源和异源基因表达中的应用]”，在：Molecular Industrial Mycology[分子工业真菌学],编辑,Leong和Berka,马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker Inc.),纽约州(1992),第129-148页；针对曲霉属，包括Yelton,Hamer和Timberlake,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]81:1470-1474，针对镰刀菌属(Fusarium)，包括Bajar,Podila和Kolattukudy,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88:8202-8212，针对链霉菌属，包括Hopwood等人,1985,GeneticManipulation of Streptomyces:Laboratory Manual[链霉菌属的遗传操作：实验室手册]，[约翰英纳斯基金会],诺维奇，英国和Fernandez-Abalos等人,Microbiol[微生物学]149:1623-1632(2003)，并且针对芽孢杆菌属，包括Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,(1990)FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138。

然而，可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如，Sambrook等人，同上)。还使用的是美国专利号6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。只需要使用能够成功地将至少一个基因引入能够表达所述基因的宿主细胞中的具体基因工程化程序。

将表达载体引入细胞后，在有利于表达在启动子序列控制下的基因的条件下培养转染或转化的细胞。

用于培养细胞的培养基可以是适合于使宿主细胞生长和获得α-葡糖苷酶多肽的表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。

可以将从宿主细胞中分泌的热稳定丝氨酸多肽(最少的生产后加工)用作全肉汤制剂。

取决于所使用的宿主细胞，可以进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。例如，这可以导致使胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶从无活性或基本上无活性的状态变为活性状态，如前肽在进行进一步的翻译后加工后成为具有酶活性的成熟肽的情况一样。在另一个情况下，该剪切可导致获得成熟热稳定丝氨酸蛋白酶多肽并且进一步去除N-末端或C-末端氨基酸以产生截短形式的保留酶活性的热稳定丝氨酸蛋白酶。

转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化、以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可取决于表达蛋白质的宿主生物体。

在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的表达。

因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和允许α-葡糖苷酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。

宿主细胞可以在允许表达胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的合适条件下培养。这些酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如***或IPTG或槐糖来启动蛋白质生产。

本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如上所述的转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中，真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。

经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且所述组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所需生物体接种培养基。换言之，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。

可替代地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格。此外，通常在整个发酵过程中进行尝试来控制因素如pH和氧气浓度。典型地，分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止的时间。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。不经处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。标准分批系统的合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当已知分解代谢物抑制将抑制细胞的代谢时和/或在发酵培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中测量实际的底物浓度是困难的并且因此其是基于可测量因子的变化而估测的，所述因子为如pH、溶解氧、和废气(如CO2)的分压。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。

连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是开放的系统，在所述系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力保持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。

分离和浓缩技术是本领域已知的，并且常规方法可用于制备包含本发明的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶多肽的浓缩溶液或肉汤。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和多种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。

有时可能需要浓缩包含α-葡糖苷酶多肽的溶液或肉汤以优化回收。使用未浓缩的溶液或肉汤通常会增加孵育时间，以便收集富集或纯化的酶沉淀。

可以使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液直至获得所需酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化方法的实例包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

含有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的溶液或肉汤可以浓缩至浓缩的含有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶多肽的溶液或肉汤的酶活性达到所希望的水平。

可以使用例如沉淀剂，如金属卤化物沉淀剂进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。

示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂，氯化钠，也可用作防腐剂。对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述经由用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶多肽。可替代地，可以通过微滤富集或纯化酶，然后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全肉汤培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。

丝氨酸蛋白酶能以本领域技术人员已知的各种方式被分离或纯化，这取决于样品中存在的其他组分。标准纯化方法包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦、免疫学和尺寸排阻)、电泳(例如，制备型等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、提取微量过滤、两相分离。例如，目的蛋白可以使用标准抗目的蛋白抗体柱进行纯化。超滤和渗滤技术联合蛋白浓缩也是有用的。对于合适的纯化技术中的一般指导，请参见Scopes，Protein Purification[蛋白质纯化](1982)。所需的纯化程度将根据目的蛋白质的用途而变化。在一些情况下，将不需要纯化。

用于检测和测量酶的酶活性的测定法，例如胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶多肽是熟知的。用于检测和测量蛋白酶(例如，热稳定丝氨酸蛋白酶多肽)的活性的多种测定法也是本领域普通技术人员已知的。具体地，测定可用于测量基于从酪蛋白或血红蛋白释放酸可溶性肽的蛋白酶活性，其作为280nm下的吸光度测量或使用Folin方法进行比色测量并且染料标记偶氮酪蛋白的水解，其作为440-450nm下的吸光度测量

其他示例性测定涉及显色底物的溶解(参见例如，Ward,“Proteinases[蛋白酶]”,在Fogarty(编辑),Microbial Enzymes and Biotechnology[微生物酶与生物技术],Applied Science[应用科学出版社],伦敦,[1983]，第251-317页中)。一种使用高标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)酪蛋白作为底物的蛋白酶检测方法，也可以使用所述程序的修饰的版本，其描述于Twining[Twining,S.S.,(1984)“Fluorescein Isothiocyanate-LabeledCasein Assay for Proteolytic Enzymes”[荧光素异硫氰酸酯标记酪蛋白酶蛋白水解测定]Anal.Biochem.[生物化学年鉴]143:30-34]。

其他示例性测定包括但不限于：酪蛋白切割成三氯乙酸可溶性肽，其含有酪氨酸和色氨酸残基，随后通过与福林酚试剂反应并在660nm进行产物的比色检测，内部猝灭FRET(荧光共振能量转移)多肽底物的切割，随后使用荧光计检测产物。荧光共振能量转移(FRET)是能量从被激发的荧光团(或供体)非辐射转移到合适的猝灭剂(或受体)分子。FRET用于各种应用，包括含有底物的蛋白酶活性测定，其中荧光团通过含有酶切割位点的短肽序列从猝灭剂中分离出来。当荧光团和猝灭剂分离时，肽的蛋白水解产生荧光。本领域技术人员已知的许多另外的参考文献提供了合适的方法(参见例如，Wells等人,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]11:7911-7925[1983]；Christianson等人,Anal.Biochem.[分析生物化学]223:119-129[1994]；以及Hsia等人，Anal.Biochem.[分析生物化学]242:221-227[1999])。

在仍另一方面，公开了饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产品，所述饲料、喂养料、饲料添加剂组合物、预混物、食物或谷物产品包含单独的或(a)与至少一种直接饲喂微生物组合、或(b)与至少一种其他酶组合、或(c)与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合的至少一种具有如本文所述的丝氨酸蛋白酶活性的多肽。

所述至少一种酶可以选自但不限于以下酶，例如像α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、植酸酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶等。

使用范围从0.5至500微克/g饲料或进料的这些酶中的任一者。

α-淀粉酶(α-1,4-葡萄糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1.)水解淀粉内的α-1,4-糖苷键，主要是随机产生更小的分子量的葡萄糖。这些多肽主要用于淀粉加工和酒精生产。可以使用任何α-淀粉酶，例如美国专利号8,927,250和7,354,752中所述。

淀粉葡糖苷酶催化末端1,4-连接的α-D-葡萄糖残基相继从麦芽寡糖和多糖的非还原末端的水解，并伴随β-D-葡萄糖的释放。可以使用任何淀粉葡糖苷酶。

植酸酶是指能够催化植酸盐水解为(1)肌醇、和/或(2)其一、二、三、四和/或五磷酸盐、以及(3)无机磷酸盐的蛋白质或多肽。例如，具有催化活性的酶如在酶委员会EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26中定义的。可以使用任何植酸酶，例如美国专利号8,144,046、8,673,609和8,053,221中所述。

支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)是一种特殊的葡聚糖酶，是降解支链淀粉(一种由麦芽糖单元组成的多糖聚合物，也称为α-1,4-；α-1,6-葡聚糖)的淀粉分解内切酶。因此，这是脱支酶的一个实例。支链淀粉酶又称出芽短梗霉聚糖-6-葡聚糖水解酶。支链淀粉酶通常由芽孢杆菌属物种分泌。例如，脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)(美国专利号5,817,498；1998)、嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利号0063909)和长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)(美国专利号5,055,403)。生产商业使用的具有支链淀粉酶活性的酶，例如，来自芽孢杆菌物种(来自杜邦-杰能科公司的商品名l-100和来自诺维信的D2)。脱支酶的其他实例包括但不限于来自磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、假单胞菌属物种的异淀粉酶，以及来自结状闪烁杆菌(Fervidobacterium nodosum)的热稳定支链淀粉酶(例如，WO2010/76113)。来自假单胞菌属物种的异淀粉酶可作为来自麦格酶国际公司(Megazyme International)的纯化的酶使用。可以使用任何支链淀粉酶。

葡聚糖酶是分解葡聚糖的酶，是葡萄糖亚单位组成的多糖。当它们进行糖苷键的水解时，它们是水解酶。

β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)消化纤维。它有助于植物细胞壁(纤维素)的分解。

纤维素酶是由真菌、细菌和原生动物产生的几种酶的一种，它能催化溶纤作用、纤维素和一些相关多糖的分解。这个名称也用于任何自然发生的混合物或各种此类酶的复合物，这些酶连续或协同作用以分解纤维素材料。可以使用任何纤维素酶。

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是向直链多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖，其分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶给出的名称。可以使用任何木聚糖酶。

至少一种DFM可以包含至少一种活的微生物，例如活的细菌菌株或活的酵母或活的真菌。优选地，DFM包含至少一种活细菌。

DFM可能是一种形成孢子的菌株，因此术语DFM可能由孢子组成或包含孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所用的“活的微生物”可能包括微生物孢子，如内孢子或分生孢子。可替代地，本文所述饲料添加剂组合物中的DFM可能不由微生物孢子组成或不包含微生物孢子，例如内孢子或分生孢子。

微生物可以是自然发生的微生物，也可以是转化的微生物。

如本文所述的DFM可包含来自一个或多个以下属的微生物：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌、明串珠菌属(Leuconostoc)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、丙酸菌属(Propionibacterium)、双歧杆菌属、梭菌属和巨球型菌属(Megasphaera)及其组合。

优选地，DFM包含一种或多种选自以下的芽孢杆菌属物种的细菌菌株：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

如本文所用的“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。据认识，芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此，所述属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)(现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义性特征，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

在另一方面，DFM可以进一步与如下乳杆菌属物种组合：乳脂链球菌(Lactococcuscremoris)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)及其组合。

DFM可以进一步与如下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳酸杆菌(Lactobacilluscasei)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、双叉乳酸杆菌(Lactobacillusbifidus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、戴耳布吕克氏乳杆菌(Lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)及其任何组合。

在仍另一方面，DFM可以进一步与如下双歧杆菌属物种(Bifidobacteria spp)组合：乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidium)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)和角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)及其任何组合。

可以提到的细菌有以下几个物种：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、枯草芽孢杆菌、特恩丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(Bifidobacterium animalisssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius ssp.Salivarius)、丙酸杆菌物种及其组合。

本文所述的直接饲喂微生物包含一种或多种细菌菌株，可以是同一类型的(属、种和菌株)，也可以包含属、种和/或菌株的混合物。

可替代地，DFM可以与WO 2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中包含的微生物相结合，总结如下：

枯草芽孢杆菌菌株2084登录号NRRl B-50013、枯草芽孢杆菌菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104、和枯草芽孢杆菌菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507(来自Enviva(以前称为)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自)；枯草芽孢杆菌菌株PB6(来自)；短小芽孢杆菌(8G-134)；肠球菌NCIMB 10415(SF68)(来自)；枯草芽孢杆菌菌株C3102(来自&)；地衣芽孢杆菌(来自)；肠球菌和片球菌(来自Poultry)；乳杆菌、双歧杆菌和/或肠球菌来自)；枯草芽孢杆菌菌株QST713(来自)；解淀粉芽孢杆菌CECT-5940(来自&Plus)；屎肠球菌(Enterococcus faecium)SF68(来自)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自)；乳酸菌7屎肠球菌(来自)；芽孢杆菌菌株(来自)；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(来自)；肠球菌(来自Biomin)；乳酸片球菌、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(来自Biomin)；香肠乳杆菌(来自)；肠球菌(来自Oralin)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌DSM 1103(来自Probios-pioneer)；鼠李糖乳杆菌和(来自)；枯草芽孢杆菌(来自)；肠球菌(来自)；酿酒酵母(来自Levucell SB)；酿酒酵母(来自Levucell SC 0&ME)；乳酸片球菌(来自Bactocell)；酿酒酵母(来自(以前称为))；酿酒酵母NCYC Sc47(来自SC47)；丁酸梭菌(来自Miya-)；肠球菌(来自Fecinor and Fecinor)；酿酒酵母NCYC R-625(来自)；酿酒酵母(来自)；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自PepSoyGen-)；蜡样芽孢杆菌(来自)；蜡样芽孢杆菌变体toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012(来自)、或其他DFM，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自YC)和枯草芽孢杆菌(来自)。

DFM可能与PRO结合，PRO可商购自丹尼斯科公司。Enviva是一个芽孢杆菌属菌株2084登录号NRRl B-50013、芽孢杆菌属菌株LSSAO1登录号NRRL B-50104和芽孢杆菌属菌株15A-P4 ATCC登录号PTA-6507的组合(如在US 7,754,469B中所教导的-通过引用并入本文)。

也可以将本文所述的DFM与来自以下属的酵母结合：假单胞菌属物种。

优选地，本文所述的DFM包括通常被认为是安全(GRAS)的微生物，优选地是经GRAS批准的微生物。

本领域普通技术人员将容易地知道来自本文所述属中的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。

在某些实施例中，重要的是DFM具有对热的耐受性，即耐热性。当饲料被压成丸粒时尤其如此。因此，在另一个实施例中，DFM可能是耐热微生物，例如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。

在其他方面，可能需要DFM包含产孢子细菌，例如芽孢杆菌纲，例如芽孢杆菌属物种。芽孢杆菌纲能在生长不利的条件下形成稳定的内孢子，对热、pH、水分和消毒剂有很强的抵抗力。

本文所述的DFM可减少或阻止致病性微生物(如产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种(Salmonella spp)和/或弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp))在肠道内的建立。换句话说，DFM可能具有抗致病性。如本文所用的术语“抗致病性”，是指DFM抵抗病原体的作用(负作用)。

如上所述，DFM可以是任何合适的DFM。例如，下面的测定“DFM测定”可以用来确定微生物是否适合成为DFM。如本文所用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的说明。为了避免疑问，根据本文所讲授的“DFM测定”，选择作为抑制性菌株(或抗致病性DFM)的DFM，是一种适合于根据本公开使用的DFM，即跟据本公开的饲料添加剂组合物中使用的DFM。

每根试管中都植入了来自代表性簇的代表性病原体(如细菌)。

来自潜在DFM的上清液，经好氧或厌氧培养，被添加到接种的管中(不添加上清液的对照组除外)并孵育。孵育后，对每一种病原菌分别测定对照和处理的上清的管的光密度(OD)。

与对照组(不含任何上清液)相比，产生了较低的OD的(潜在的DFM)菌株的集落可以将其分类为抑制性菌株(或抗致病性DFM)。因此，如本文所用的DFM测定在US 2009/0280090中有更详细的说明。

优选地，本DFM测定中使用的代表性病原体可以是下列一种(或多种)：梭菌属，例如产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌物种和/或弯曲杆菌物种。在一个优选的实施例中，所述测定用一个或多个产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌和/或大肠杆菌，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭状芽孢杆菌，更优选地产气荚膜梭菌进行。

抗致病性DFM包括以下一种或多种细菌，并描述于WO 2013029013中：

枯草芽孢杆菌菌株3BP5登录号NRRL B-50510、

枯草芽孢杆菌菌株918ATCC登录号NRRL B-50508、和

枯草芽孢杆菌菌株1013ATCC登录号NRRL B-50509中。

DFM可以作为一种或多种培养物和一种或多种载体制备(如果使用的话)，并可以将它们添加到条带或桨式混合器中，并且混合约15分钟，尽管时间可以增加或减少。将组分混合，这样使得导致培养物和载体的均匀混合物。最终产物优选地为干燥的可流动粉末。DFM包括含一种或多种菌株，然后可以将其添加到动物饲料或饲料预混物，添加到动物的水，或以其他本领域已知的途径施用(优选地与本文所述的酶同时)。

在DFM混合物中包含单个菌株的比例可以从1％到99％不等，优选从25％到75％不等。

动物饲料中DFM的适合剂量范围为约1x 10³CFU/g饲料至约1x 10¹⁰CFU/g饲料，适当地在约1x 10⁴CFU/g饲料至约1x 10⁸CFU/g饲料之间，适当地在约7.5x 10⁴CFU/g饲料至约1x 10⁷CFU/g饲料之间。

在另一方面，喂养料中DFM的剂量超过约1x 10³CFU/g饲料，适当地超过约1x10⁴CFU/g饲料，适当地超过约5x 10⁴CFU/g饲料，或适当地超过约1x 10⁵CFU/g饲料。

饲料添加剂组合物中DFM的剂量从约1x 10³CFU/g组合物至约1x 10¹³CFU/g组合物，优选1x 10⁵CFU/g组合物至约1x 10¹³CFU/g组合物，更优选在约1x 10⁶CFU/g组合物至约1x 10¹²CFU/g组合物之间，并且最优选在约3.75x 10⁷CFU/g组合物至约1x 10¹¹CFU/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约1x 10⁵CFU/g组合物，优选大于约1x 10⁶CFU/g组合物，并且最优选大于约3.75x 10⁷CFU/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中DFM的剂量大于约2x 10⁵CFU/g组合物，适当地大于约2x10⁶ CFU/g组合物，适当地大于约3.7 5x 10⁷CFU/g组合物。

用于在动物饲料中使用的饲料添加剂组合物可包含至少一种具有如本文所述的丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述至少一种多肽单独使用或(a)与至少一种直接饲喂微生物组合、或(b)与至少一种其他酶组合、或(c)与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合、和(d)选自由以下组成的组的至少一种组分组合使用：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在仍另一方面，公开了用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述颗粒状饲料添加剂组合物包含至少一种具有如本文所述的丝氨酸蛋白酶活性的多肽，所述至少一种多肽单独使用或与至少一种直接饲喂微生物组合、或与至少一种其他酶组合、或与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合使用，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。

此外，颗粒状饲料添加剂组合物的颗粒可具有大于50微米并且小于2000微米的平均直径。

饲料添加剂组合物可以是液体形式，并且液体形式也可以是所述适合于在饲料丸粒上喷雾干燥。

动物饲料可以包括植物材料，如玉米、小麦、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵，或针对家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的这些植物材料或植物蛋白源中的任何的混合物。预期动物性能参数，例如生长、采食量和饲料效率，但同时改善的均匀性、降低的动物房内的氨浓度以及因此改善的动物的福利和健康状况，都将得到改善。更具体地，如本文所用的“动物性能”可以通过动物的饲料效率和/或增重和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中的营养素的消化率(例如氨基酸消化率)和/或饲料中的可消化能或代谢能和/或通过氮保留量和/或通过动物避免坏死性肠炎的负面影响的能力和/或通过受试者的免疫应答来确定。

优选地，“动物性能”通过饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率来确定。

“改善的动物性能”意指与不包含本发明的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用所述饲料添加剂组合物，受试者中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中的营养素或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎的负面影响的能力改善和/或免疫应答改善。

优选地，“改善的动物性能”意指存在增加的饲料效率和/或增加的增重和/或降低的饲料转化率。如本文所用的，术语“饲料效率”是指当一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物增重的量。

“增加的饲料效率”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用本发明的饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量中增重增加。

如本文所用的，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加的规定量的饲料量。

改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。

“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致动物增重指定量饲喂给动物的所需要的饲料量低于饲料添加剂组合物的情况下使动物增重相同量时所需的饲料量。

如本文所用的营养素消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养素的比率。营养素消化率可测量为所施用至受试者的营养素与受试者粪便中所排出来的营养素之间的差值、或施用至受试者的营养素与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养素之间的差值。

如本文所用的，营养素消化率可通过在一段时间期间收集总***物，测量所摄入营养素与所***的营养素之间的差值；或利用不会被动物吸收，并允许研究者计算整个胃肠道或胃肠道区段中所消失的营养素的量的惰性标记来测量。这样的惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可以表示为在饲料中营养素的百分比，或表示为可消化的营养素的质量单位/饲料中的营养素的质量单位。

如本文所用的营养素消化率涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。

如本文所用的能量消化率意指所消费的饲料总能量减去粪便的总能量，或所消费的饲料总能量减去动物胃肠道指定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。如本文所用的，代谢能是指表观代谢能，并且意指所消耗的饲料总能量减去粪便、尿和消化的气体产物中包含的总能量。可使用与测定营养素消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮***进行适当校正来计算饲料的代谢能。

在一些实施例中，本文所述的组合物可提高受试者对膳食半纤维素或纤维的消化率或利用率。在一些实施例中，所述受试者是猪。

如本文所用的氮保留意指受试者将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮***量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。

氮保留可以测量为在一段时间内氮的摄入量与通过***物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。

如本文所用的术语存活率，是指存活的受试者人数。术语“改善的生存率”是“降低的死亡率”的另一种说法。

如本文所用的术语屠体收率是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语屠体是指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。如本文所用的，术语产肉量是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。

“增加的增重”是指与饲喂不含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含饲料添加剂组合物的饲料时体重增加的动物。

如本文所用的术语“动物”包括所有非反刍动物和反刍动物。在具体实施例中，所述动物是非反刍动物，例如马和单胃动物。单胃动物的实例包括但不限于猪(pigs和swine)，例如仔猪、生长猪、母猪；家禽，例如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡、下蛋鸡；鱼，例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳动物，例如虾和对虾。在另外的实施例中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、小牛、山羊、绵羊、长颈鹿、北美野牛、驼鹿、麋鹿、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、羚羊、叉角羚和鹿牛羚。

在本发明上下文中，术语“宠物食品”旨在被理解为意指用于以下的食物：家庭动物，例如但不限于狗、猫、沙鼠、仓鼠、南美栗鼠、褐鼠、豚鼠；鸟类宠物，例如金丝雀、长尾小鹦鹉和鹦鹉；爬行动物宠物，例如海龟、蜥蜴和蛇；以及水生宠物，例如热带鱼和青蛙。

术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“喂养料”和“秣料(fodder)”可互换地使用，并且包含选自下组的一种或多种饲料原料，所述组包含：a)谷类，如小粒谷物(如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，如玉米或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、具有可溶物的干酒糟(Distillers Dried Grains with Solubles)(DDGS)(具体是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。

本文所述的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶或饲料添加剂组合物可以用作饲料或用于饲料的制备中。术语“饲料添加剂组合物”和“酶组合物”在本文中可互换地使用。

取决于用途和/或应用模式和/或施用模式，饲料可呈溶液形式或呈固体形式或呈半固体形式。

当用作或用于制备饲料(如功能性饲料)时，本文所述的酶或饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。例如，提及选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

在一个优选的实施例中，将本发明的酶或饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。如本文所用的，“饲料组分”意指喂养料的全部或部分。喂养料的部分可意指喂养料的一种成分或喂养料的一种以上(例如2种或3种或4种或更多种)成分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物成分。优选地，饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。可以将饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分混合或将其混合至复合饲料的预混物或混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。

本文所述的任何喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：a)谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、黑小麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，如玉米蛋白粉、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、干酒糟(DDG)(特别是基于玉米的干酒糟(cDDG))、具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是基于玉米的具有可溶物的干酒糟(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；d)获得自植物和动物来源的油和脂肪；e)矿物质和维生素。

如本文所用的，术语“秣料”意指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已经切下的植物。此外，秣料包括青贮饲料、压缩的和压成丸粒的饲料、油和混合口粮，也包括发芽谷物和豆类。

秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：玉米(玉蜀黍)、苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、休马流甘兰(Chau moellier)、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、羊茅草、雀麦草、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。

术语“复合饲料”意指呈粗粉、丸粒、球丸(nut)、饼或碎屑形式的商业饲料。复合饲料可由多种原料和添加剂共混而来。根据目标动物的特定需求配制这些共混物。

复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的浓缩物或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。

用于复合饲料中的主要成分是饲料谷物，其包括玉米、小麦、低芥酸菜籽粉、油菜籽粉、羽扇豆、大豆、高粱、燕麦和大麦。

合适地，本文所提及的预混物可以是由微量成分构成的组合物，所述微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。

在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、麦麸、或其任何组合。

在一个实施例中，饲料组分可为玉米、DDGS(例如，cDDGS)、小麦、麦麸、或其组合。在一个实施例中，喂养料包含以下或由以下组成：玉米、DDGS(例如，cDDGS)或其组合。

本文所述的喂养料可含有按重量计至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的玉米和大豆粉或玉米及全脂大豆、或者小麦粉或向日葵粉。

例如，喂养料可以含有约5％至约40％的玉米DDGS。对于家禽，所述喂养料平均可含有约7％至15％的玉米DDGS。对于猪(swine或pig)，所述喂养料可含有平均5％至40％的玉米DDGS。它也可以含有玉米作为单一谷物，在这种情况下，所述喂养料可以包含约35％至约80％的玉米。

在包含混合谷物(例如包含如玉米和小麦)的喂养料中，所述喂养料可包含至少10％的玉米。

另外或可替代地，喂养料也可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦、大麦、黑麦、燕麦，来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、玉米蛋白饲料、湿饼、干酒糟(DDG)、具有可溶物的干酒糟(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质源也可视为高纤维：获得自例如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花等来源的蛋白质。在一个方面，如本文所述的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，例如：具有可溶物的干酒糟(DDGS)(特别是cDDGS)、湿饼、干酒糟(DDG)(特别是cDDG)、麦麸和小麦。在一个实施例中，本发明的喂养料包含选自由以下组成的组的至少一种高纤维材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物：例如含可溶物干酒糟(DDGS)(特别是cDDGS)、麦麸和小麦。

所述饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牲畜用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；糖渍饲用植物：青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。

如本文所用的，术语“饲料”在一些实施例中涵盖宠物食物。宠物食物是旨在由宠物消费的植物或动物材料，如狗食或猫食。宠物食物(如狗食和猫食)可以干燥形式(如用于狗的磨碎食物)或湿罐装形式。猫食可含有氨基酸牛磺酸。

动物饲料还可以包括鱼食。鱼食通常含有使养殖鱼保持良好健康所需的大量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以呈小片、丸粒或片的形式。压成丸粒的形式(其中的一些快速沉降)经常用于较大鱼或底饲物种。一些鱼食还含有添加剂(如β胡萝卜素或性激素)以人工增强观赏性鱼的颜色。

在仍另一方面，动物饲料涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器中以及用于饲喂宠物鸟的食物。典型地，鸟食由多种种子组成，但也可涵盖板油(牛肉或羊肉脂肪)。

如本文所用的，术语“接触”指的是间接或直接将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(或包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的组合物)应用到产品(例如饲料)中。可以使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品、通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷涂至产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的配制品中。在一个实施例中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。可替代地，喂养料的乳液或原始成分中可包括饲料添加剂组合物。对于一些应用而言，重要的是，使组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。这允许所述组合物赋予性能益处。

在一些方面，所述的热稳定丝氨酸蛋白酶用于食品或饲料的预处理。例如,饲料具有10％-300％的水分混合并与蛋白酶在5℃-80℃下孵育，优选地在25℃-50℃，更优选地在30℃-45℃之间在有氧条件下孵育1分钟至72小时或在厌氧条件下孵育1天至2个月。预处理后的材料可以直接饲喂给动物(所谓的液体饲喂)。预处理的材料也可以在升高的温度(60℃-120℃)下蒸汽制粒。蛋白酶可以通过真空喷涂机浸渍到饲料或食品材料中。

可将胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(或包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的组合物)和受控量的所述酶用以散布、涂层和/或浸渍产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。

优选地，饲料添加剂组合物将是热稳定的以便进行高至约70℃、高至约85℃、或高至约95℃的热处理。热处理可以进行长达约1分钟；长达约5分钟；长达约10分钟；长达约30分钟；长达约60分钟。术语“热稳定”意指加热至特定温度之前添加剂中存在/有活性的酶组分和/或DFM的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有活性。优选地，加热至特定温度之前添加剂中存在且有活性的包含一种或多种细菌菌株的蛋白酶组分和/或DFM的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有活性。在一个特别优选的实施例中，将饲料添加剂组合物均化，以制成粉末。

可替代地，将饲料添加剂组合物配制成如WO 2007/044968中所述的颗粒(称为TPT颗粒)，所述文献通过引用并入本文。

在另一个优选的实施例中，当将饲料添加剂组合物配制成颗粒时，这些颗粒包含喷涂在蛋白质核心上的水合屏障盐。此类的盐涂层的优点在于使耐热性改善、使储存稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响所述至少一种蛋白酶和/或包含一种或多种细菌菌株的DFM的饲料添加剂的影响。优选地，用于盐涂层的盐在20℃具有大于0.25的水活度或大于60％的恒定湿度。优选地，盐涂层包含Na₂SO₄。

制备饲料添加剂组合物的方法也可包括将粉末制成丸粒的另外的步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸料。

制备胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(或包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的组合物)的方法还可以包括将粉末制成粒料的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可强加力使粉末、或包含粉末的混合物通过模具，并将所得线料切成适宜的不同长度的丸料。

任选地，制粒步骤可包括在丸粒形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。将混合物在达到指定温度的调节器中加热，如从60℃-100℃，典型的温度将是70℃、80℃、85℃、90℃、或95℃。停留时间可以是从几秒钟到几分钟并且甚至几小时不等。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。应当理解，本文所述的热稳定丝氨酸蛋白酶(或包含热稳定丝氨酸蛋白酶的组合物)适于添加到任何适当的饲料材料中。

技术人员应当理解，不同的动物要求不同的喂养料，甚至同一种动物也可能要求不同的喂养料，这取决于饲养所述动物的目的。

任选地，喂养料还可含有另外的矿物质(如，例如钙)和/或另外的维生素。在一些实施例中，喂养料为玉米大豆粉混合物。

喂养料典型地在饲料磨机中生产，在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度，然后与适当的添加剂混合。然后，可以将喂养料生产成糊状或丸粒；后者通常涉及这样的方法，通过所述方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而生产出特定大小的丸粒。让丸粒冷却。随后，可添加液体添加剂例如脂肪和酶。制备喂养料也可涉及另外的步骤，所述步骤包括制粒之前的挤出或膨化，具体是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。

所述喂养料可为用于以下的喂养料：单胃动物，如家禽(例如肉鸡、下蛋鸡、肉用种鸡、产仔鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)和猪类(所有年龄类别)；反刍动物，如牛(例如奶牛或公牛(包括牛犊))、马、绵羊、宠物(例如狗、猫)或鱼(例如无胃鱼，有胃鱼，淡水鱼，如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤鱼)，海鱼(如黑鲈)；和甲壳类动物，如虾、贻贝和扇贝)。优选地，所述喂养料用于家禽。

所述饲料添加剂组合物和/或包含其的喂养料可以任何合适的形式使用。所述饲料添加剂组合物能以固体或液体配制品或其替代物形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。

在一些应用中，可将所述饲料添加剂组合物与饲料混合或在饮用水中施用。

饲料添加剂组合物，包含将如本文所教导的蛋白酶与饲料可接受载体、稀释剂或赋形剂混合，并且(任选地)进行包装。

可使喂养料和/或饲料添加剂组合物与至少一种矿物质和/或至少一种维生素混合。由此衍生的组合物可在本文中称为预混物。

在一些实施例中，基于纯酶蛋白，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在喂养料中可以以1ppb(十亿分之几)到10％(w/w)的范围存在。在一些实施例中，蛋白酶在喂养料中以1-100ppm(百万分之一)的范围存在。优选剂量可以是每吨饲料产品或饲料组合物1-20g胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，或在最终产品中1-20ppm胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的最终剂量。

优选地，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶可以在喂养料中以至少约200PU/kg或至少约300PU/kg饲料或至少约400PU/kg饲料或至少约500PU/kg饲料或至少约600PU/kg饲料、或至少约700PU/kg饲料、至少约800PU/kg饲料、至少约900PU/kg饲料、或至少约1000PU/kg饲料、或至少约1500PU/kg饲料、或至少约2000PU/kg饲料、或至少约2500PU/kg饲料、或至少约3000PU/kg饲料、或至少约3500PU/kg饲料、或至少约4000PU/kg饲料、或至少约4500PU/kg饲料、或至少约5000PU/kg饲料存在。

在另一方面，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶可以在喂养料中以低于约60,000PU/kg饲料、或以低于约70,000PU/kg饲料、或以低于约80,000PU/kg饲料、或以低于约90,000PU/kg饲料、或以低于约100,000PU/kg饲料、或以低于约200,000PU/kg饲料、或以低于约60000PU/kg饲料、或以低于约70000PU/kg饲料存在。

范围可以包括但不限于上面讨论的较低和较高范围的任何组合。

应当理解，一个蛋白酶单位(PU)是在pH 10.0在50℃下，每分钟内从酪蛋白底物释放2.3微克酚类化合物(表示为酪氨酸等价物)的酶量。这可被称为确定1PU的测定法。

包含胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和本文所述的组合物的制剂可以以任何合适的方式制备以确保所述制剂包含活性酶。此类制剂可以呈液体、干粉或颗粒。优选地，所述饲料添加剂组合物可以呈液体形式，并且液体形式也可以适合于在饲料丸粒上喷雾干燥。

干粉或颗粒可以通过本领域技术人员已知的手段制备，例如高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷雾。

本文所述的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和组合物可以被包衣，例如被包入胶囊内。在一个实施例中，涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。

将本文所述的饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如WO 2007/044968(称为TPT颗粒)或WO 1997/016076或WO 1992/012645中所述(所述文献各自通过引用并入本文)。

在一个实施例中，可以将饲料添加剂组合物配制成用于饲料组合物的颗粒，所述颗粒包含：芯；活性剂；和至少一个涂层，在选自以下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制粒方法，b)蒸汽加热的饲料预处理方法，c)储存，d)作为未经制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。

关于颗粒，至少一个涂层可包含占所述颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个涂层可包含两个涂层。所述两个涂层可为水分水合涂层和防潮涂层。在一些实施例中，所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至60％w/w并且所述防潮涂层可为所述颗粒的2％w/w至15％w/w。所述水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且所述防潮涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。

所述颗粒可使用饲料制粒方法制备并且所述饲料预处理方法可在70℃至95℃(如在85℃至95℃)进行长达若干分钟。

可将饲料添加剂组合物配制成用于动物饲料的颗粒，所述颗粒包含：芯；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒方法之后，所述颗粒的活性剂保持至少80％活性；防潮涂层；和水分水合涂层，其至少为所述颗粒的25％w/w，所述颗粒在蒸汽加热制粒方法之前具有小于0.5的水活度。

所述颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮涂层并且所述水分水合材料可为无机盐。所述水分水合涂层可为所述颗粒的25％w/w至45％w/w并且所述防潮涂层可为所述颗粒的2％w/w至10％w/w。

颗粒可使用蒸汽加热制丸方法制备，所述方法可在85℃至95℃进行长达若干分钟。

可替代地，所述组合物处于适合于消耗的液体制剂中，优选地，这种液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲剂、盐、山梨糖醇和/或甘油。

此外，可通过将一种或多种酶施用(例如喷涂)于载体底物(如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。

在一个实施例中，饲料添加剂组合物可以被配制成预混物。仅举个实例，所述预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。

在一个实施例中，将直接饲喂微生物(“DFM”)和/或热稳定丝氨酸蛋白酶与至少一种生理学上可接受的载体一起配制，所述载体选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na₂SO₄、滑石、PVA、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。

本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：

1.一种具有丝氨酸蛋白酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽选自由以下组成的组：

a)包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列的多肽；

b)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少94％同一性的氨基酸序列的多肽；

c)包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列的多肽；

d)包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽。

2.一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且包含预测的前体氨基酸序列的分离的多肽，所述预测的前体氨基酸序列选自：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:9；和SEQ ID NO:12。

3.一种具有丝氨酸蛋白酶活性并且包含蛋白酶催化区的分离的多肽，所述蛋白酶催化区选自：

a)与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列的蛋白酶催化区；

b)与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列；

c)SEQ ID NO:20的氨基酸序列；

d)与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少91％同一性的氨基酸序列；

4.一种重组构建体，所述重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，所述调控序列有效地连接到核苷酸序列，所述核苷酸序列编码至少一种如实施例1-3中所述的具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽。

5.如实施例5所述的重组构建体，其中所述宿主选自由以下组成的组：真菌、细菌和藻类。

6.一种用于产生至少一种具有丝氨酸蛋白酶的多肽的方法，所述方法包括：

(a)用如实施例4所述的重组构建体转化生产宿主；和

(b)在产生至少一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的条件下培养步骤(a)的生产宿主。

7.如实施例6所述的方法，其中任选地从所述生产宿主回收所述丝氨酸蛋白酶。

8.一种含有丝氨酸蛋白酶的培养物上清液，所述培养物上清液通过如实施例6或7中任一项所述的方法获得。

9.一种用于表达至少一种多肽的重组微生物生产宿主，所述重组微生物生产宿主包含如实施例4所述的重组构建体。

10.如实施例9所述的生产宿主，其中所述宿主选自由以下组成的组：细菌、真菌和藻类。

11.一种动物饲料，所述动物饲料包含至少一种如实施例1-3中任一项所述的多肽，其中所述多肽以1-20g/吨饲料的量存在。

12.如实施例11所述的动物饲料，所述动物饲料进一步包含至少一种直接饲喂微生物。

13.如实施例11或12所述的动物饲料，所述动物饲料进一步包含至少一种其他酶。

14.一种饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物包含至少一种如实施例1-3中任一项所述的多肽。

15.如实施例14所述的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物进一步包含至少一种直接饲喂微生物。

16.如实施例14或15所述的饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物，所述饲料、喂养料、饲料添加剂组合物或预混物进一步包含至少一种其他酶。

17.如实施例14-17中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的至少一种组分：蛋白质、肽、蔗糖、乳糖、山梨糖醇、甘油、丙二醇、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、山梨酸钠、氯化钾、硫酸钾、乙酸钾、柠檬酸钾、甲酸钾、乙酸钾、山梨酸钾、氯化镁、硫酸镁、乙酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、山梨酸镁、焦亚硫酸钠、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

18.一种用于在动物饲料中使用的颗粒状饲料添加剂组合物，所述颗粒状饲料添加剂组合物包含至少一种如实施例1-3中任一项所述的多肽，其中所述颗粒状饲料添加剂组合物包含通过选自由以下组成的组的方法产生的颗粒：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷涂、喷雾干燥、冷冻干燥、造粒、喷雾冷却、旋转式圆盘雾化、凝聚、压片及其组合。

19.如实施例18所述的颗粒状饲料添加剂组合物，其中所述颗粒的平均直径大于50微米并且小于2000微米。

20.如实施例14-17中任一项所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈液体形式。

21.如实施例20所述的饲料添加剂组合物，其中所述组合物呈适合于在饲料丸粒上喷雾干燥的液体形式。

实例

除非在本文中另有定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY[微生物学和分子生物学词典]，第2版，John Wileyand Sons[约翰威利父子公司]，纽约(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约州(1991)为技术人员提供了本公开中所使用的许多术语的通用词典。

本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解，这些实例尽管说明了某些实施例，但仅以示例的方式给出。从以上的讨论和所述实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的本质特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。

实例1

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的克隆

选择四株真菌菌株(链霉菌属物种C004、链霉菌属物种C009、链霉菌属物种C001和链霉菌属物种S055)作为酶的潜在来源，这些菌株可用于多种工业应用中。从四株菌株中分离出染色体DNA，使用Illumina的下一代测序技术进行测序。对上述四种链霉菌属物种进行注释后，鉴定出编码胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的基因；并且鉴定出其核苷酸或氨基酸序列。

如通过SignalP软件版本4.0预测的(Nordahl Petersen等人,(2011)NatureMethods[自然方法]8:785-786)，所有4种蛋白质的基因具有N-末端信号肽，这说明它们都分泌酶。

从链霉菌属物种C009分离的SspCPro29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。SspCPro29前体蛋白质的预测的信号序列如SEQ ID NO:2所示。SspCPro29前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

从链霉菌属物种C001分离的SspCPro33基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。SspCPro33前体蛋白质的预测的信号序列如SEQ ID NO:5所示。SspCPro33前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

从链霉菌属物种C003分离的SspCPro23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。SspCPro23前体蛋白质的预测的信号序列如SEQ ID NO:8所示。SspCPro23前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

从链霉菌属物种C055分离的SspCPro59基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。SspCPro59前体蛋白质的预测的信号序列如SEQ ID NO:11所示。SspCPro59前体蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。基于信号序列预测，全长氨基酸序列预测如下：SspCPro29(SEQ ID NO:22)；SspCPro33(SEQ ID NO:23)；SspCPro23(SEQ ID NO:24)；和SspCPro59(SEQ ID NO:25)。

实例2

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的表达

将编码链霉菌属物种胰蛋白酶同源物SspCPro23、SspC29、SspC33和SspC59的前肽成熟形式(前体蛋白质减去信号序列)的DNA序列由捷瑞公司(Generay)(中国上海)合成，并且各自***到枯草芽孢杆菌表达载体p2JM103BBI(Vogtentanz,Protein Expr Purif[蛋白质表达与纯化],55:40-52,2007)中。所得的质粒被命名为pGX384(AprE-SspCPro23)、pGX390(AprE-SspCPro29)、pGX394(AprE-SspCPro33)和pGX738(AprE-SspCPro59)。所述合成基因具有替代性起始密码子(GTG)。

图1提供了pGX390(AprE-SspCPro29)的质粒图谱，另外三个质粒除了编码每个丝氨酸蛋白酶目的基因(GOI)的***基因外，组成相似。合成的AprE-SspCPro23、AprE-SspCPro29、AprE-SspCPro33、AprE-SspCPro59基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13、14、15和16所示。将编码每个GOI的基因连接到线性化的表达载体中导致在编码枯草芽孢杆菌AprE信号的序列的3'末端和编码前肽-成熟序列的序列的5'末端之间添加了三个密码子(编码残基Ala-Gly-Lys)。AprE信号序列(SEQ ID NO:17)用于指导重组蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌。

然后将表达质粒转化到合适的枯草芽孢杆菌细胞中，并且将转化的细胞在补充有5ppm氯霉素和1.2％脱脂奶(目录号232100，Difco)的卢里亚琼脂(Luria Agar)平板上培养。挑取形成最大明显光环的集落并将其用于接种液体培养物。使用基于MOPS的限定培养基(补充有5mM CaCl₂)，在250mL摇瓶中进行发酵。

为了纯化SspCPro29和SspCPro33蛋白酶，使用疏水相互作用和离子交换树脂，使来自摇瓶培养物的澄清的上清液经受柱色谱法。然后将所得的活性蛋白级分进行合并，经由10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃在40％甘油中储存直至使用。

利用灰色链霉菌(Streptomyces griseus)丝氨酸蛋白酶链霉菌蛋白酶C(Uniprot登录号P52320)的蛋白质序列注释，进一步分析SspCPro29、SspCPro 23、SspCPro 33和SspCPro 59的多种序列区以鉴定包含这些蛋白酶的催化结构域的推定的氨基酸残基。链霉菌蛋白酶C被表示为包含信号序列(残基1-34)、前肽区(残基35-202)和成熟链(残基203至457)的457残基多肽。

所述成熟链进一步地由催化结构域(残基203至393，SEQ ID NO:39)、接头(残基394-413)和几丁质结合区(残基415-457)构成。基于该信息，SspCPro29、SspCPro 23、SspCPro 33和SspCPro 59的催化结构域预测为：分别是SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20和SEQ ID NO:21。

实例3

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的蛋白水解活性

使用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(AAPF-pNA，目录号L-1400.0250，BACHEM)作为底物，在50mM HEPES缓冲液(pH 8)中测量纯化的SspCPro29和SspCPro33的蛋白水解活性。使用商业产品ProAct蛋白酶(DSM)的样品作为参考。反应前，用纯化水(密理博公司(Millipore))将酶稀释到特定浓度。将AAPF-pNA溶解在二甲亚砜(DMSO，目录号STBD2470V，西格玛公司(Sigma))中至最终浓度为10mM。

为了启动反应，首先将5μL的AAPF-pNA与85μL的HEPES缓冲液混合于非结合96孔微量滴定板(96-MTP)(康宁生命科学公司(Corning Life Sciences)，#3641)中，并在恒温混合器(艾本德公司(Eppendorf))中在40℃以600rpm孵育5min，然后添加10μL经稀释的酶(或仅纯化的H₂O作为空白对照)。在恒温混合器中在40℃和600rpm孵育10min后，使用SpectraMax 190在410nm处直接读取反应板。通过从酶的A₄₁₀中减去空白对照的A₄₁₀来计算净A₄₁₀，并且然后绘制出相对于不同蛋白质浓度(从0.02ppm到0.3125ppm)的图。每个值为三次重复测定的平均值。

对AAPF-pNA底物的蛋白水解活性在图2中显示为净A₄₁₀。使用来自摇瓶培养物的澄清的上清液测量SspCPro23和SsCPro59的蛋白水解活性。将用p2JM103BBI(缺少蛋白酶基因)转化的枯草芽孢杆菌细胞的澄清的培养物上清液用作载体对照。反应前，用纯化水将上清液稀释200倍。如上所述进行测定程序，并且通过从酶样品的A₄₁₀中减去载体对照的A₄₁₀来计算净A₄₁₀。每个值为三次重复测定的平均值。蛋白水解活性在表1中显示为净A₄₁₀，表明SspCPro23和SspCPro59是活性蛋白酶。

实例4

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的pH曲线

以AAPF-pNA为底物，在不同pH值(范围从pH 3至10)的25mM甘氨酸/乙酸钠/HEPES缓冲液中研究胰蛋白酶同源物的pH曲线。测定前，首先将具有特定pH值的85μL的25mM甘氨酸/乙酸钠/HEPES缓冲液与5μL的10mM AAPF-pNA混合于96-MTP中，然后与10μL的纯化水混合。然后添加经稀释的酶(对于纯化的SspCPro29和SspCPro33为0.2ppm，或者将SspCPro23和SspCPro59的澄清的上清液稀释200倍)以开始反应。将水或来自载体对照的上清液(稀释200倍)分别用作纯化的或未纯化的酶的空白对照。反应的进行和分析如实例3所述。各pH值下的酶活性报告为相对活性，其中最佳pH值下的酶活性被设置为100％。对于纯化的酶(SspCPro29和SspCPro33)测试的pH值为3、4、5、6、7、8、9和10；并且对于未纯化的酶(SspCPro23和SspCPro59)为3、5.5、8、9、10。每个值为三次重复测定的平均值。

如图3所示，所有胰蛋白酶同源物都是碱性蛋白酶。

实例5

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的温度曲线

使用AAPF-pNA测定，在50mM HEPES缓冲液(pH 8)中分析胰蛋白酶同源物的温度曲线。反应前，将85μL的50mM pH 8.0HEPES缓冲液和5μL的10mM AAPF-pNA添加到200μL PCR管中，然后将其随后在Peltier热循环仪(伯乐公司(BioRad))中在所希望的温度(30℃至80℃)下孵育5min。孵育后，将10μL的酶样品(对于纯化的SspCPro29和SspCPro33为0.2ppm，或者对于SspCPro23和SspCPro59为澄清的上清液(稀释200倍))添加到底物中以启动反应。仅添加水或来自载体对照的上清液(稀释200倍)分别作为纯化的或未纯化的酶的空白对照。在不同温度下在Peltier热循环仪中孵育10min后，将80μL的反应混合物转移到新的96-MTP中并在410nm处读取吸光度。所述活性报告为相对活性，其中最佳温度下的活性被设置为100％。对于纯化的酶(SspCPro29和SspCPro33)的测试的温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃；并且在35℃、40℃、50℃、60℃和70℃下测试未纯化的蛋白质SspCPro23和SspCPro59。报告的每个值为三次重复测定的平均值。结果示于图4中。

实例6

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶对玉米大豆粉的水解。

使用如下描述的OPA(邻苯二甲醛)或BCA(二喹啉甲酸)检测测定来评估胰蛋白酶同源物对玉米大豆粉(具有40％大豆粉和60％玉米面粉的混合物)的水解程度，以测量酶促反应后分别释放到上清液中的新产生的N-末端胺基团或可溶性肽的量。为了进行所述测定，将140μL的玉米大豆粉底物(悬浮在MES pH 6缓冲液中的10％(w/w)玉米大豆粉浆液)与20μL的经稀释的纯化的酶样品(SspCPro29和SspCPro33)或与60μL的澄清的上清液(SspCPro23和SspCPro59)混合于96-MTP中。在孵育器中在40℃下孵育2hr后，将板在4℃下以3700rpm离心15min。将得到的上清液在水中稀释10倍，使用OPA和BCA测定进行后续反应产物检测。对于纯化的蛋白酶，ProAct蛋白酶(DSM)的样品被包括作为商业基准蛋白酶，并且将水用作(无酶)空白对照。对于未纯化的，将来自载体对照的上清液用作空白对照。

通过混合30mL的2％磷酸三钠缓冲液(pH 11)、800μL的4％OPA(目录号P1378，西格玛公司，溶解在96％乙醇中)、1mL的3.52％二硫苏糖醇(目录号D0632，西格玛公司)和8.2mL的H₂O来制备OPA试剂。通过将10μL 10X稀释的蛋白酶反应物添加至96-MTP(目录号3635，康宁生命科学公司)中的175μL OPA试剂中来启动反应。在20℃下孵育2min后，使用分光光度计在340nm(A₃₄₀)处测量所得溶液的吸光度。通过从每个蛋白酶反应物的A₃₄₀中减去空白对照(对于SspCPro29和SspCPro33是水；对于SspCPro23和SspCPro59是来自载体对照的上清液)的A₃₄₀来计算净A₃₄₀，以测量每个蛋白酶样品对玉米大豆粉的水解程度。结果示于图5A和表2中。

根据制造商指南，BCA反应是由混合10μL稀释的上清液与200μL BCA试剂进行的。在恒温混合器中在37℃下进行孵育30min，并且在分光光度计中测量反应产物，作为在562nm处的终点吸光度读数。通过从每个蛋白酶反应物的A₅₆₂中减去空白对照(对于SspCPro29和SspCPro33是水；对于SspCPro23和SspCPro59是来自载体对照的上清液)的A₅₆₂来计算净A₅₆₂，以测量每个蛋白酶样品对玉米大豆粉的水解程度。结果示于图5B和表2中。

实例7

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的胃蛋白酶稳定性

通过将胰蛋白酶同源物与胃蛋白酶(西格玛公司，目录号P7000)在50mM乙酸钠缓冲液(pH 3.0)中孵育并使用AAPF-pNA作为底物进行残余活性测量来分析胰蛋白酶同源物的胃蛋白酶稳定性。首先将胰蛋白酶同源物和胃蛋白酶以1:0、1:25、1:250或1:2500的比率(w/w)混合，其中胰蛋白酶同源物的剂量为20ppm；并且随后将所得的混合物在37℃下孵育30min。同时，将20ppm等分试样的每种胰蛋白酶同源物保持在冰上作为未处理的对照。为了进行残余活性测量，将5μL的10mM AAPF-pNA与85μL的HEPES缓冲液(50mM，pH 8.0)混合于96-MTP中，然后添加10μL的纯化水稀释的混合物(0.2ppm或仅H₂O作为空白对照)。反应的进行和分析如实例3所述。

表3显示了胃蛋白酶处理后的残余酶活性，其中保持在冰上的未处理的样品的活性被设置为100％。

实例8

饲料制粒条件下SspCPro29蛋白酶的稳定性

制粒条件如下：将62.5g由38.37g蛋白质组成的SspCPro29蛋白酶的浓缩溶液在自来水中稀释至600mL，并且将其与120kg的玉米大豆饲料(按重量计，60％玉米，31.5％大豆粉，4.0％大豆油，0.4％盐，0.2％DL-甲硫氨酸，1.16％石灰石，1.46％磷酸钙以及1.25％维生素和矿物质混合物)混合。将该混合物在90℃或95℃下制粒30秒。未经过制粒的相似制备的酶样品和玉米大豆饲料(糊状饲料)的混合物充当对照。提取条件如下：在室温下(22℃)在10mL烧杯中用磁力搅拌棒将1g压成丸粒的饲料或糊状饲料研磨，与10mL缓冲液(100mMTris缓冲液，含有1％SDS pH 10)混合10min，然后使用台式离心机以4000rpm离心10min。将上清液通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液直接用于酶活性测定中。酶活性测定条件如下：将0.18mL 0.1M曲辛(Tricine)缓冲液(pH 9.75，含有1％SDS)、1μL酶饲料提取物和20μLAAPF-pNA底物(10mg/ml，在DMSO中)以900rpm混合1min。将样品在30℃下孵育120min，伴随连续振荡。

通过在分光光度计中测量410nm处的吸光度来确定反应程度。结果示于表4中。

实例9

用SspCPro29蛋白酶和SspCPro33蛋白酶在玉米大豆饲料中水解并溶解蛋白质

所述反应在96孔MTP中包含140μL 10％(w/w)玉米大豆饲料浆液(Yu S,CowiesonA,Gilbert C,Plumstead P,Dalsgaard S.,Interactions of phytate and myo-inositolphosphate esters(IP1-5)including IP5 isomers with dietary protein and ironand inhibition of pepsin.[植酸盐和包括IP5异构体的肌醇磷酸酯(IP1-5)与膳食蛋白质和铁的相互作用以及胃蛋白酶的抑制]J.Anim.Sci.[动物科学杂志]2012,90:1824-1832)，其中pH调节至pH 3.0；给出玉米大豆饲料的最终浓度为0、250、500、750、1000和1250ppm的在50mM乙酸钠(pH 3.0)中的20μL蛋白酶；以及10μL胃蛋白酶(西格玛公司P7000以1.69mg/ml溶解在水中)。在iEMS孵育器/振荡器(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))中以1150rpm，在40℃下将板孵育45min。在孵育结束时，添加34μL猪胰酶(西格玛公司P7545，0.4636mg/mL在1M碳酸氢钠中)，并且在iEMS孵育器/振荡器中以1150rpm，在40℃下将板进一步孵育60min。孵育后，在5℃，4000rpm下将板离心15min。将10μL上清液转移到含有90μL水(10x稀释)的新的96孔MTP中。分别在340nm和562nm处确定10倍稀释的上清液的OPA(蛋白质水解)和BCA(蛋白质溶解)值。

使用邻苯二甲醛(OPA)试剂的蛋白质水解基本上如前所述(稍作修改)进行(P.M.NIELSEN,D.PETERSEN和C.DAMBMANN,Improved method for determining foodprotein degree of hydrolysis[用于确定食品蛋白质水解度的改善的方法],J.FoodSci.[食品科学杂志]66:642-646,2001)。通过混合30mL磷酸三钠(Na3PO4.12H2O，2％w/v在水中，其中将pH调节至pH 11)、0.8mL OPA(0.4g邻苯二甲醛97％(OPA)在10mL96％乙醇中，在-20℃下保存)、1ml DTT溶液(0.352g DL-二硫苏糖醇(DTT)99％在10mL水中)以及至最终体积为40mL的水来新鲜制备OPA试剂。将试剂保持在黑暗中并在制备后立即使用。将10x稀释的上清液20μL与175μL的OPA试剂混合5秒，并在2min后在340nm处准确读取。

通过使用皮尔斯公司(Pierce)BCA蛋白质测定试剂盒(来自赛默飞世尔科技公司的目录号23225)来测量蛋白质溶解。将20μL上清液与200μL的BCA试剂(根据制造商的说明，在使用前通过将50mL BCA试剂A与1mL BCA试剂B混合制备)混合。将混合物在37℃下孵育30min，然后测量在562nm处的吸光度。

表5.1和5.2显示，在胃蛋白酶和胰酶两者的存在下，玉米大豆饲料中的蛋白质水解和蛋白质溶解(分别)随着SspCPro29和SspCPro33蛋白酶剂量从0至1250ppm的增加而增加。水解和溶解的各自相关系数(R²)为0.90和0.97。

实例10

在ADW中SspCPro29和SspCPro33的清洁性能

使用PA-S-38(调入色素的蛋黄，通过加热熟化的)微型样本(CFT-符拉尔丁根(Vlaardingen)，荷兰)，在pH 10.3下使用模型自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂来测试SspCPro29和SspCPro33的清洁性能。为了制备漂洗过的PAS38样本，将180μL 10mM CAPS缓冲液(pH11)添加到含有PAS38样本的96-MTP中。将板密封并在iEMs孵育器中在60℃，1100rpm下孵育30min。孵育后，除去缓冲液，并用纯化的H₂O漂洗样本。用于性能测定之前将板风干。

将纯化的蛋白酶样品在含有0.1mM CaCl₂和0.005％的10mM NaCl中稀释至200ppm。测试在3g/L GSM-B洗涤剂中进行。GSM-B洗涤剂(以重量百分比计)的组成如下：将30％柠檬酸钠脱水物、25％二硅酸钠(Protil A，科宁公司(Cognis))、12％马来酸/丙烯酸共聚物钠盐(CP5BASF)、5％过硼酸钠一水合物、2％TAED、2％直链脂肪醇乙氧基化物、和无水碳酸钠添加到100％。将190μL等分试样的GSM-B洗涤剂添加到每孔含有1个漂洗的PAS38微型样本的96-MTP中，并且通过添加10μL经稀释的酶(或仅稀释溶液作为空白对照)来开始反应。将96-MTP密封并在孵育器/振荡器中在40℃和1150rpm下放置30min。孵育后，将来自每孔的100μL洗涤液转移到新的96-MTP上，并且使用分光光度计在405nm处测量其吸光度。对PAS38模型污渍的蛋白酶活性报告为净A₄₀₅(通过从经酶处理的样品的A₄₀₅中减去空白对照的A₄₀₅)。

使用在pH 10.3下的GSM-B洗涤剂，PAS38微型样本对SspCPro29和SspCPro33的剂量响应显示在图6中。

实例11

在衣物条件下SspCPro29和SspCPro33的清洁性能

使用EMPA-116(被血液/奶/墨汁弄脏的棉花)微型样本(获得自CFT符拉尔丁根，荷兰)，在pH 8.0或pH 10.0下，测试SspCPro29和SspCPro33蛋白酶在液体和粉末衣物洗涤剂中的清洁性能。测试前，将商业液体洗涤剂(Tide Clean宝洁公司(Proctor&Gamble)，美国)在95℃下孵育1小时以灭活洗涤剂中存在的酶。用5mM HEPES(pH 8.0)将热处理的洗涤剂进一步稀释至最终浓度为0.788g/L。将该缓冲的液体洗涤剂的水硬度调节至100ppm Ca²⁺:Mg²⁺(3:1比率)。对于缓冲的粉末洗涤剂制剂，将商业洗涤剂(宝洁公司，中国)溶解至在水中(水硬度为100ppm)达到2g/L，并在微波炉中加热至仅沸腾以灭活酶。随后进行蛋白水解测定以证实商业洗涤剂中蛋白酶的灭活。

测试前，将EMPA-116微型样本用水漂洗并风干。为了启动反应，将190μL缓冲的洗涤剂添加到含有漂洗的EMPA-116微型样本的96-MTP孔中，随后添加10μL的经稀释的酶(或H₂O作为空白对照)。将96-MTP密封并分别在32℃的iEMs和16℃的恒温混合器中孵育20min。孵育后，将来自每孔的100μL洗涤液转移到新的96-MTP上，并且使用分光光度计在600nm处测量吸光度。通过从经酶处理的样品的A₆₀₀中减去空白对照的A₆₀₀来计算净A₆₀₀。SspCPro29和SspCPro33在16℃和32℃下的液体和粉末衣物洗涤剂中的EMPA-116微型样本上进行的剂量响应曲线。将BPN’Y217L蛋白酶(SEQ ID NO:40)用作HDL评估的参考，并且将GG36蛋白酶(SEQ ID NO:41)用作HDD评估的参考。

图7、图8显示了在16℃和32℃下使用HDL洗涤剂的清洁性能结果，图9和图10显示了在16℃和32℃下使用HDD洗涤剂的清洁性能结果。

实例12

预测的全长链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的蛋白质序列分析

针对公共和基因组查询专利(Public and Genome Quest Patent)数据库(其中搜索参数设置为默认值)，使用SspCPro29(SEQ ID NO:22)、SspCPro33(SEQ ID NO:23)、SspCPro23(SEQ ID NO:24)和SspCPro59(SEQ ID NO:25)的预测全长氨基酸序列，通过BLAST搜索(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-402,1997)鉴定了相关蛋白质，并且子集分别显示于表6A和6B中(SspCPro29)；表7A和7B中(SspCPro33)；表8A和8B中(SspCPro23)；以及表9A和9B中(SspCPro59)。将两个搜索集的百分比同一性(PID)定义为相同残基的数量除以成对比对中经比对残基的数量。表上标有“序列长度”的值对应于以所列出的登录号提及的蛋白质的长度(以氨基酸计)，而“比对长度”是针对用于比对和PID计算的序列。

SspCPro29(SEQ ID NO:22)；SspCPro33(SEQ ID NO:23)；SspCPro23(SEQ ID NO:24)；和SspCPro59(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列以及其他链霉菌属物种丝氨酸蛋白酶：WP_064069271(SEQ ID NO:26)；WP_043225562(SEQ ID NO:27)；WP_024756173(SEQ ID NO:28)；WP_030548298(SEQ ID NO:29)；WP_005320871(SEQ ID NO:30)；WP_055639793(SEQ IDNO:31)；WO 2015048332-44360(SEQ ID NO:32)；WO 2015048332-44127(SEQ ID NO:33)；WP_030313004(SEQ ID NO:34)；WP_030212164(SEQ ID NO:35)；WP_030749137(SEQ ID NO:36)；WP_031004112(SEQ ID NO:37)；和WP_026277977(SEQ ID NO:38)的序列使用来自Geneious软件(生物物质有限公司(Biomatters Ltd.))(Robert C.Edgar.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多重序列比对],Nucl.Acids Res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)的MUSCLE程序使用默认参数来比对。重叠区域的多序列比对显示在图11中。

实例13

链霉菌属物种胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶的预测的催化结构域的蛋白质序列分析

针对公共和基因组查询专利数据库(其中搜索参数设置为默认值)，使用SspCPro29(SEQ ID NO:18)、SspCPro33(SEQ ID NO:19)、SspCPro23(SEQ ID NO:20)和SspCPro59(SEQ ID NO:21)的预测催化结构域序列，通过BLAST搜索(Altschul等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],25:3389-402,1997)鉴定了相关蛋白质，并且子集分别显示于表10A和10B中(SspCPro29)；表11A和11B中(SspCPro33)；表12A和12B中(SspCPro23)；以及表13A和13B中(SspCPro59)。

如上所述进行SspCPro29(SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:3的aa 213-403)；SspCPro33(SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:6的aa 204-394)；SspCPro23(SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:9的aa201-391)；SspCPro59(SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:12的aa 206-395)；WP_064069271(SEQ IDNO:42，SEQ ID NO:26的aa 204-394)；WP_043225562(SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:27的aa204-394)；WP_024756173(SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:28的aa 201-391)；WP_030548298(SEQID NO:45，SEQ ID NO:29的aa 207-397)；WP_005320871(SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:30的aa204-394)；WP_029386953(SEQ ID NO:47)的氨基酸残基138-328；WP_026277977(SEQ IDNO:48，SEQ ID NO:38的aa 207-397)；WP_044383230(SEQ ID NO:49)的氨基酸残基208-398；WP_069630550(SEQ ID NO:50)的氨基酸残基193-383；WP_055639793(SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:31的aa 201-391)；WP_053699044(SEQ ID NO:52)的氨基酸残基211-401；WP_031135572(SEQ ID NO:53)的氨基酸残基205-395的预测的催化结构域序列的比对，并示于图12中。来自图12的预测的催化结构域共有序列如SEQ ID NO:54所示。对于共有序列中的位置，考虑多个氨基酸，使用X＝I或L和IUPAC代码描绘它们：B＝D或N。