一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法
阅读说明：本技术 一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法 (Separation and purification method of alkaline metalloprotease ) 是由 张国基 张希兰 汤燕雯 赵甜 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法,包括以下步骤：将黏质沙雷氏菌发酵培养,获得粗酶液；用硫酸铵沉淀粗酶液后,用缓冲液溶解、透析；用无菌的去离子水分别将Q Sephacryl Fast Flow和Sephacryl S100 HR溶胀、脱气；在预制Q Sephacryl Fast Flow色谱柱上样,用Tris-HCl平衡液冲洗,用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱,用超滤管,缓冲液进行脱盐,用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱,用超滤管脱盐、浓缩；上样至Sephacryl S100 HR柱,用洗脱液清洗,收集洗脱峰,用超滤管浓缩,即得到碱性金属蛋白酶。从黏质沙雷氏菌的分泌蛋白中分离抗病毒活性的蛋白质类物质,筛选具有良好抗病毒效果、性质稳定的蛋白,丰富抗病毒活性物质的种类,为植物病毒病防治药剂的研究提供理论依据。(The invention discloses a separation and purification method of alkaline metalloprotease, comprising the following steps: fermenting and culturing serratia marcescens to obtain crude enzyme liquid; precipitating the crude enzyme solution with ammonium sulfate, dissolving with buffer solution, and dialyzing; respectively swelling and degassing Q Sephacryl Fast Flow and Sephacryl S100 HR by using sterile deionized water; loading a sample on a prefabricated Q Sephacryl Fast Flow chromatographic column, washing with a Tris-HCl equilibrium solution, performing gradient elution with NaCl of different concentrations, desalting with an ultrafiltration tube and a buffer solution, performing gradient elution with NaCl of different concentrations, desalting with an ultrafiltration tube, and concentrating; and (3) loading the sample to a Sephacryl S100 HR column, washing with eluent, collecting an elution peak, and concentrating by using an ultrafiltration tube to obtain the alkaline metalloprotease. Protein substances with antiviral activity are separated from secretory protein of serratia marcescens, protein with good antiviral effect and stable property is screened, the types of antiviral active substances are enriched, and a theoretical basis is provided for research of plant virus disease prevention and treatment medicaments.)
技术领域
本发明涉及微生物生态学技术领域，尤其涉及一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法。
背景技术
黏质沙雷氏菌是一种在自然生境中广泛存在的革兰氏阴性细菌，在土壤、水等环境中都可以生存。在土壤中，有些菌株是植物根际促生菌(PGPR)。例如，自土壤中分离得到的Serratia marcescens-90-166可以通过群体感应机制诱导植物产生系统抗性，并能提高植物对包括黄瓜花叶病毒在内的几种植物病原体的侵染。此外，黏质沙雷氏菌还能产生多种胞外酶，包括丝胶酶、几丁质酶、金属蛋白酶、脂肪酶、硫醇蛋白酶和核酸酶等(Gercetal,2014；Hover etal,2016；Khanetal,2017；Singhetal,2016)。黏质沙雷氏菌属胞外蛋白在医药、工业等领域都有研究应用，但在农业方面研究极少，而且市场上也没有相关产品的应用。
烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病等的病原体，具有广泛的寄主范围，可侵染十字花科、茄科和葫芦科等至少9个科125种植物，其发生频率高、流行快、为害重、难治理，一旦植物染病，无法得到有效的控制，极易引发病毒病的流行，造成严重的经济损失。每年因烟草花叶病毒造成的经济损失高达数十亿美元。目前在病毒病害治理中主要采用抗病毒品种的选育、传毒媒介防控及交叉保护等方式，而针对植物病毒病的有效化学农药种类少，亟待农业科研人员去解决。
已有研究，植物病毒被细菌污染后其汁液会很快失去侵染活力，随后一些科研工作者开始致力于微生物及其代谢产物抗病毒活性的研究。目前已发现，有许多细菌和真菌及其代谢物质都具有一定钝化烟草花叶病毒病毒粒子的能力，但如何具体分离其中的抗病毒活性的蛋白质类物质还没有较好的方法。
因此，针对上述问题，有必要提出进一步地解决方案。
发明内容
本发明旨在提供一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法，以克服现有技术中存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
将黏质沙雷氏菌发酵培养，获得粗酶液；
用硫酸铵沉淀粗酶液后，用pH 7.2、10mmol/L PBS缓冲液溶解、透析；
用无菌的去离子水分别将Q Sephacryl Fast Flow和Sephacryl S100 HR溶胀、脱气；
在预制Q Sephacryl Fast Flow色谱柱上样，用pH 4.0-9.0、20mmol/L的Tris-HCl平衡液冲洗，用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱，用超滤管，pH 7.2、10mmol/L的PBS缓冲液进行脱盐，用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱，用超滤管脱盐、浓缩；
上样至Sephacryl S100 HR柱，用pH 7.2、10mmol/L的PBS洗脱液清洗，收集洗脱峰，用超滤管浓缩，即得到碱性金属蛋白酶。
优选地，所述Tris-HCl平衡液的pH 5.0。
优选地，所述NaCl洗脱液的浓度为0.2mol/L。
优选地，所述超滤管的最大截留分子量3000Da。
优选地，所述粗酶液的制备方法，步骤为：
黏质沙雷氏菌菌液在28℃恒温、120rpm摇床中振荡培养72h取出后6000×g离心10min，收集上清液，即为粗酶液。
优选地，所述黏质沙雷氏菌菌液的制备方法，步骤为：
取黏质沙雷氏菌单菌落放至LB液体培养基中，28℃、120rpm震荡培养16h。
优选地，所述硫酸铵沉淀粗酶液包括以下步骤：
(1)向粗酶液中缓慢加入硫酸铵并缓慢搅拌，至硫酸铵终浓度达到45％后，静置16h；
(2)然后用高速冷冻离心30min弃沉淀，收集上清；
(3)向上清液中缓慢加入硫酸铵至终浓度达到85％，然后静置16h；
(4)再次高速冷冻离心30min弃上清，收集沉淀。
优选地，所述步骤(1)中在冰上操作加入硫酸铵。
优选地，所述硫酸铵沉淀粗酶液在4℃条件下操作。
优选地，所述高速冷冻离心的条件为4℃、11000×g。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法，从黏质沙雷氏菌的分泌蛋白中分离抗病毒活性的蛋白质类物质，筛选具有良好抗病毒效果、性质稳定的蛋白，丰富抗病毒活性物质的种类，为植物病毒病防治药剂的研究提供理论依据。
附图说明
图1为色谱分离纯化结果，利用Q Sephacryl Fast Flow色谱柱，用不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱得到的组分及其抗病毒效果；
图2为色谱分离纯化结果利用Sephacryl S100 HR排阻色谱分理得到的不同蛋白组分及其抗病毒活性；
图3为SDS-PAGE电泳检测洗脱蛋白，其中a)1、2、4、5分别代表15、16、17、18管洗脱液，b)中1代表第二次排阻色谱分离得到的单一条带；
图4为串联质谱鉴定得到7个肽段；
图5为SAMP与1sat(S.marcescens)、5d7w(Serratia sp.Fs14)和1srp(Serratiasp.E-15)三个同类蛋白氨基酸序列比对结果，相同的氨基酸残基用灰色表示，不同的氨基酸残基用其它颜色标注；
图6为通过SWISS-MODEL预测的SAMP的结构图；
图7为SAMP结构预测及与参照蛋白匹配情况；
图8为SAMP的N-端水解结构域三维结构图；
图9为SAMP的C-端结构域三维结构图；
图10为酸碱度对SAMP酶活力和酶稳定性的影响；
图11为温度对SAMP酶活力和酶稳定性的影响。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本实验所用植物材料为带有枯斑标记基因的三生烟(Nicotiana tabacumcv.SunsamNN)；本氏烟(Nicotiana benthamiana)；
TMV病毒粒体；TMV-GFP(TMV 30B)。
一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法，包括以下步骤：
将黏质沙雷氏菌发酵培养，获得粗酶液；
1、色谱柱预制
用无菌的去离子水分别将Q Sephacryl Fast Flow和Sephacryl S100 HR溶胀、脱气。封住色谱柱出样口，将溶胀后的填料沿着壁缓慢倒入色谱柱中(色谱柱垂直放置，期间避免出现气泡)，静置一段时间后，打开出样口，使无菌水流出，并用平衡缓冲液清洗1-2个柱体积。预制色谱柱放在层析柜暂存。
2、阴离子交换色谱(Q Sephacryl FF)的pH选择
首先，在预制Q Sephacryl FF色谱柱上样1mL，用平衡液(对应的pH)冲洗1个柱体积，然后用不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)的含有2mol/L NaCl的洗脱液，将结合在柱子上的蛋白一次性洗脱出来，用最大截留分子量3000Da的Millipore超滤管，pH为7.2，10mmol/L的PBS缓冲液进行脱盐，最终将蛋白浓缩到2mL。结合“半叶法”检测目的蛋白结合到色谱柱上的最佳pH范围。
3、用Q Sephacryl Fast Flow分离总蛋白
用平衡液清洗1-2个柱体积后，脱盐后的总蛋白沿壁轻轻加入色谱柱中(不要溅起填料)，然后用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱。洗脱条件如下：
每个浓度的洗脱液洗脱1个柱体积，收集各洗脱产物并用截留分子量为3000的Millipore超滤管脱盐、浓缩然后用“半叶法”检测洗脱蛋白对TMV的活性。
4、Sephacryl S100 HR分离具有抗TMV活性的蛋白组分
将自步骤3中洗脱得到的具有抗TMV活性的蛋白全部集中到一起，浓缩后上样至Sephacryl S100 HR柱上。然后用洗脱液(PBS,10mmol/L,pH为7.2)清洗。
色谱条件如下：
收集各洗脱峰，用Millipore截留分子量为3000的超滤管浓缩，用“半叶法”测定每个收集部分对TMV的抑制效果。
5、蛋白浓度的测定(BCA法)：用BCA试剂盒(索莱宝生物技术有限公司)对检测分离得到的蛋白的浓度。
其中，硫酸铵沉淀粗酶液包括以下步骤：
具体步骤：
1、3L菌液在摇床中振荡培养72h(28℃,120rpm)，取出后6000×g离心10min，收集上清弃掉菌体。其中，菌液制备为取黏质沙雷氏菌单菌落放至LB液体培养基中，28℃、120rpm震荡培养16h。
2、用微孔滤膜(孔径为0.45μm)过滤，除去残留的菌体。向菌液上清中缓慢加入硫酸铵并缓慢搅拌，至硫酸铵终浓度达到45％，此步骤需要在冰上操作。
3、将上清液放入层析柜(4℃)，静置16h。
4、将上清液缓慢取出(不要晃动)，用高速冷冻离心机(4℃，11000×g)离心30min弃沉淀，收集上清。
5、向上清液中缓慢加入硫酸铵至终浓度达到85％，然后置于层析柜中，静置16h。(整个过程在4℃条件下操作)
6、高速冷冻离心机(4℃，11000×g)离心30min弃上清。
7、收集沉淀，用100mL磷酸缓冲液溶解(PBS,10mmol/L,pH7.2)。
8、总蛋白粗提液脱盐：将总蛋白提取液放入截留分子量为3kDa的透析袋中，擦用透析脱盐的方法除去总蛋白溶液中的硫酸铵。透析液为10mmol/L的PBS缓冲液,pH为7.2。
脱盐后的蛋白溶液用真空冷冻干燥机冷冻干燥，然后保存于-20℃。
分离得到的蛋白，用SDS-PAGE胶电泳，分离检测蛋白的大小。用串联质谱(MS/MS)鉴定抗TMV蛋白的种类，用Bioedit软件对蛋白序列进行比对，并将蛋白的氨基酸序列通过通过SWISS-MODEL进行结构预测。
用福林法测定碱性金属蛋白酶的酶活性质。
Tris-HCl pH值低于5.0(不包括5.0)时，色谱柱上结合的蛋白对TMV没有显著的抑制效果，当pH值上升至5.0时，结合到色谱柱上的蛋白对TMV开始出现显著的抑制效果，抑制效率达到86.30％；随着pH值的升高，洗脱蛋白对TMV的抑制效率呈现上升趋势，但差异并不显著。这一结果表明：在pH值上升至5.0时，抗病毒活性蛋白开始大量结合到色谱柱上，而且随着缓冲液pH值升高，结合到色谱柱中抗TMV活性蛋白的量也呈现上升趋势(见表1)。
表1.不同pH条件***离子交换柱结合的蛋白对TMV钝化效果的比较
Table1 Inactivation effect of proteins binding onto the anion-exchange chromatography in Tris-HCl buffer(0.02mol·L-1)with different pH.
阴离子交换色谱原理是：当蛋白等电点(pI)低于环境中的pH值(色谱柱中平衡液的pH值)，蛋白会带负电荷，可以结合到色谱柱上；反之，蛋白带正电荷，便不能结合到色谱柱上。根据这一原理，平衡液pH值越高，可以与色谱柱结合的蛋白的种类也就会越多，因此我们要筛选到合适的pH值。在本实验中pH值筛选结果说明：在利用阴离子交换色谱进行分离活性蛋白时最佳的pH值可以选择5.0，这样既可以最大限度保留具有抗TMV活性的蛋白，又可以尽量排除杂蛋白的影响。
当pH值为5.0时，用浓度为0.2mol/LNaCl洗脱液进行冲洗，得到的洗脱液对TMV的抑制效果最高达到80％以上，此时洗脱产物A280值最高，说明当NaCl浓度达到0.2mol/L时，洗脱得到的蛋白量也最大，其中包含了对TMV具有抑制作用的蛋白。
总蛋白经Q Sephacryl Fast Flow分离后，得到的具有抗TMV活性的洗脱组分收集并用3000Da的Millipore超滤管进行浓缩，接着用Sephacryl S100 HR排阻色谱进行进一步的分离。结果显示，从第14号管开始，收集液的抗病毒活性、蛋白含量都开始上升，17号管收集液两者都达到最高；自第19号管开始，收集液对TMV抑制效果开始降低，到20号管已经没有显著抗TMV活性；其中第17管收集液对TMV抑制效果达到90％。
将排阻色谱Sephacryl S100 HR分离得到的不同编号的蛋白收集液进行了SDS-PAGE检测。结果表明：这些具有抗TMV效果的蛋白收集液，都出现了明显的蛋白条带，而且第15号管收集液中蛋白的条带比较杂，第17、18号管收集液呈现了比较单一的蛋白条带。我们将16-18号管的收集液集中浓缩后进行第二次排阻色谱分离，将收集到的蛋白溶进行了SDS-PAGE检测，结果表明，可以检测到单一的蛋白条带。
通过两次色谱分离，我们收集得到了对TMV抑制效果最高的蛋白。经过SDS-PAGE凝胶检测发现，总蛋白经过Q Sephacryl FF和Sephacryl S100 HR色谱分离后，具有抗病毒活性的蛋白在PAGE凝胶上的条带逐渐减少，最终经过两次Sephacryl S100 HR分离后，在聚丙烯酰胺凝胶上得呈现出单一的条带。
将分离得到的蛋白组分在SDS-PAGE凝胶上呈现的单一条带切下，用串联质谱的方法进行鉴定。通过与Eubacteria数据库中的已知蛋白的多肽进行对比，得到7个多肽片段均与碱性金属蛋白酶(Protein View No.wP_015377659.1)匹配，这7个确定的多肽片段分别为：DATYFEDSR、TFENAGLELVR、TGDTVYGFNSNTDR、NHTFVNNQIHENEYGR、GEDKIDLTLFNTGSADGIR、DTFVYFAAEESTAAAPDWIR和IIFTAWDAGGNDTFDFSGFGQNQR。
根据串联质谱的分析结果，将该蛋白暂定为碱性金属蛋白酶(secreted alkalinemetalloprotease,SAMP)。
通过已经报道的黏质沙雷氏菌的全基因组序列，我们首先获得了几株黏质沙雷氏菌的碱性金属蛋白酶的核酸序列，通过序列比对发现该编码基因非常保守，通过设计特异性引物(SAPM-F/SAMP-R)，进行PCR扩增得到Serratia marcescensstrain-S3碱性金属蛋白酶SAMP的核酸序列，经核酸测序后确定该SAMP基因共1413bp，推定蛋白由471个氨基酸组成。将SAMP的氨基酸序列与3个已确定蛋白结构的同类蛋白进行序列比对，PDB数据库的获取号分别为1sat(S.Marcescens；Baumann U.,1994)、5d7w(Serratia sp.Fs14；Wu D.etal.,2016)和1srp(Serratia sp.E-15；Hamada K.et al.,1996)，结果表明，SAMP的氨基酸序列与分离自Serratia sp.Fs14菌株的金属蛋白酶5d7w序列一致性达到99.79％，471个氨基酸中仅有1个不同；与1sat和1srp也仅存在9个氨基酸差异。
通过SWISS-MODEL网站预测SAMP的三维结构图，结果显示SAMP的三维结构与5d7w最相近，N-端连接蛋白水解结构域，并具有一个Zn2+结合位点和7个Ca2+配合位点(BienertS.et al.,2017；Guex N.et al.,2009)。
通过比对SAMP与已知晶体结构的同源蛋白(PDB:5d7w)并用SPDBView_4.10软件对SAMP的结构进行分析。Model_01代表SAMP，5d7w.1.A代表从菌株Serratia sp.FS14中分离得到的SAMP的同源蛋白。通过结构分析，可知SAMP由6个α-螺旋结构和24个β-折叠结构。参照5d7w结构分析，SAMP可分为两个大结构域N-端水解结构域(23-253)和“平行β-辊”C-端结构域。N-端水解结构域主要包含5个α-螺旋结构和8个β-折叠片，以及一些不规则的结构区域，它们共同组成一凹陷的“cave”结构，底部结合一Zn2+离子。SAMP蛋白主链第176位的组氨酸、177位的谷氨酸、180、186位的组氨酸和216位的络氨酸(H176，E177，H180，H186，Y216)五个氨基酸残基形成锌离子的结合部位。整个凹陷的“cave”结构便是SAMP的活性部位。
C-端结构域由10多个β-折叠片相互连接、平行排列形成长条形“平行β-辊”状结构(见图10)。β-辊状结构域中有7个Ca2+结合部位，分别在CA.1(R 253，G 255，T 257，D 285，G287，D 290)、CA.2(G.288，D.290，T.327，E.329)、CA.3(G.334，G.336，D.338，G.351)；CA.4(N.343，A.345，N.347，G.360)、CA.5(G.352，G.354，D.356，G.369)；CA.6(G.370，A.371，G.372，D.374，D.400)和CA.7(G.361，G.362，G.363，D.365，D.383，D.390)每个Ca2+结合位点有4-6个氨基酸残基构成。
酶活试验表明，色谱分离得到的单一蛋白组分具有很强的金属蛋白酶活性(见图3-6)；当反应缓冲液pH值为8.0-9.0时，酶活值最高；当反应温度达到40-50℃时酶活力最高。酶对酸碱度的稳定性实验证明，当反应溶液的酸碱度低于5.0时，碱性金属蛋白酶(SAMP)的酶活性能降低到原来的40％左右；而在碱性条件下(pH＞7.0)，SAMP的酶活性能比较稳定，保持在70％以上。热稳定性实验表明：当实验温度为30-50℃时，SAMP活性相对稳定，保持在80％以上；当温度高于50℃时(60-70℃)，SAMP的酶活性迅速下降至20％左右，当温度继续上升至80℃及以上时，酶活力又恢复到40％左右，说明SAMP具有一定的热稳定性。
综上所述，本发明公开了一种碱性金属蛋白酶的分离纯化方法，从黏质沙雷氏菌的分泌蛋白中分离抗病毒活性的蛋白质类物质，筛选具有良好抗病毒效果、性质稳定的蛋白，丰富抗病毒活性物质的种类，为植物病毒病防治药剂的研究提供理论依据。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。