阅读说明：本技术 一种银杏内酯b原料及其制备方法 (Bilobalide B raw material and preparation method thereof ) 是由 肖志勇 李丁 李玉杰 陈芸 王宁 胡林森 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种银杏内酯B原料及其制备方法,所述银杏内酯B原料从银杏叶中提取获得,所述银杏内酯B原料中银杏内酯B化合物的含量大于99％,所述银杏内酯B原料中含有微量银杏内酯成分银杏内酯HK、银杏内酯K和银杏内酯A,且含量均小于0.4％。本发明还涉及银杏内酯B原料的制备方法,包括：提取银杏叶得到银杏叶提取物,提取物用水溶解后,用有机溶剂萃取,得到萃取物后,加入含水乙醇/甲醇进行反复结晶,得精制品I；粗结晶母液部分用含水乙醇/甲醇多次重结晶,得精制品II,将精制品I与II合并混合均匀后,即得。本发明为银杏内酯B化合物的深度研究提供基础,采用试剂安全环保,可回收利用,提高收率,有较大的市场应用前景。(The invention relates to a bilobalide B raw material and a preparation method thereof, wherein the bilobalide B raw material is extracted from ginkgo leaves, the content of a bilobalide B compound in the bilobalide B raw material is more than 99%, and the bilobalide B raw material contains a trace amount of bilobalide components, namely bilobalide HK, bilobalide K and bilobalide A, and the content of the bilobalide B compound is less than 0.4%. The invention also relates to a preparation method of the ginkgolide B raw material, which comprises the following steps: extracting folium Ginkgo to obtain folium Ginkgo extract, dissolving the extract with water, extracting with organic solvent to obtain extract, adding aqueous ethanol/methanol, and repeatedly crystallizing to obtain refined product I; recrystallizing the crude crystallization mother liquor part with hydrous ethanol/methanol for multiple times to obtain a refined product II, and mixing the refined products I and II uniformly to obtain the final product. The invention provides a foundation for deep research of the ginkgolide B compound, adopts safe and environment-friendly reagents, can be recycled, improves the yield and has wide market application prospect.)

一种银杏内酯B原料及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药提取物，具体涉及中药提取物的单体，尤其涉及一种银杏内酯B原料及其制备方法。

背景技术

银杏内酯B，英文名Ginkgolide B；分子式：C20H24O10；分子量：424.40。

银杏内酯B是一种活性强的血小板活化因子(PAF)拮抗剂，能竞争性地与PAF受体结合，抑制PAF的作用；因此，凡涉及与PAF相关的病症，如：血栓形成、脑组织损伤、器官移植排斥、急性炎症、心脏过敏、细胞内毒素及IgG导致的休克等，银杏内酯B均有一定疗效。

CN101182325A涉及一种静脉给药银杏内酯B及提取方法，其中银杏内酯B含量≥97％,银杏酸≤2PPM,白果内酯未检出,它可以直接作为静脉注射或静脉滴注的原料药；其提取采用银杏叶干重8-25倍量、浓度为5％-30％乙醇水溶液回流提取若干次,过滤分离；将滤液浓缩至原体积的0.05-0.2倍量,加入吸附剂在搅拌状态下充分吸附,过滤,滤饼用3-10倍量乙醇回流提取若干次,合并提取液,浓缩至原体积的0.01-0.2倍量,静置析晶,过滤得银杏内酯；银杏内酯用10-50倍量的甲醇进行重结晶若干次,析晶温度-10℃--25℃,过滤结晶、干燥,得银杏内酯B。

CN104817570A涉及一种银杏内酯B的制备方法，该方法采用银杏叶为原料，用中高浓度乙醇回流提取，合并提取液，回收乙醇，过柱分离，以纯水、乙醇分别洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥后，用高浓度乙醇溶解，过酸性氧化铝柱，高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到银杏总内酯粗品，向银杏总内酯粗品中加入纯水，30-90℃下搅拌溶解，过滤，收集滤饼，浓缩，干燥，得干品，再向干品中加入中低浓度乙醇，重结晶，得银杏内酯B。

CN103130817B公开一种新的银杏内酯B化合物及其制备方法，涉及一种新的银杏内酯B化合物，所述银杏内酯B化合物从银杏叶中提取获得，所述银杏内酯B化合物中银杏内酯B的含量大于99％，所述银杏内酯B化合物中含有银杏内酯A，所述银杏内酯A的含量低至0.4％。还提供该银杏内酯B化合物的制备方法，包括：在搅拌条件下加入硅藻土、银杏叶提取物，于78-85℃加热回流0.5-1.5h，过滤，浓缩；再加入蒸馏水除杂，分出乙酸乙酯层，乙酸乙酯层过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙酯味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为60-70％，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇和乙酸乙酯重结晶，得成品银杏内酯B化合物。

CN1680392A涉及采用高速逆流色谱法(HSCCC)从银杏叶中分离一种高纯度银杏内酯的制备方法。用三个溶剂体系,分别经过两次HSCCC分离后,可得到银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯,纯度均达到99％以上。

中国发明专利CN103130818A和CN103130817B中银杏内酯B化合物中的微量杂质分别为银杏内酯A和银杏内酯K，含量都低于0.4％，不含白果内酯，银杏酸含量低于0.12ppm。

目前，药用的银杏内酯B主要从银杏叶中提取，由于银杏内酯B含量在银杏叶中含量极低，且银杏内酯B与银杏内酯A结构相似，化学性质差异很小，因此，从银杏叶中提取分离高纯度的银杏内酯B单体较为困难，特别是银杏内酯B与银杏内酯A的分离更为困难。银杏内酯B作为药用原料药在制药中应用时需要对杂质的种类和含量进行定性和定量分析并制定相应质量标准，现有技术对银杏内酯B的杂质研究还有待提高。

由于现有技术中提取得到的银杏内酯B单体纯度不够高，只能作为口服制剂用的原料而不能作为注射剂原料药，或者虽然可以达到较高的纯度，但是所使用的方法不适用于工业化生产。因此，期待改进提取方法，积极寻求提取效率高、产品质量好的银杏内酯B单体的方法有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种高纯度的银杏内酯B原料及其制备方法

本发明提供了一种高纯度的银杏内酯B原料，该原料中含有微量的银杏内酯HK化合物、银杏内酯K化合物和银杏内酯A化合物。

所述银杏内酯B原料中银杏内酯B化合物的含量≥99％，所述银杏内酯B原料中含有银杏内酯HK化合物、银杏内酯K化合物和银杏内酯A化合物，每个化合物含量均≤0.4％。

所述银杏内酯B化合物的化学结构式为结构式Ⅰ，所述银杏内酯HK化合物的化学结构式为式Ⅱ，所述银杏内酯K化合物的化学结构式为式Ⅲ，所述银杏内酯A化合物的化学结构式为式Ⅳ：

所述银杏内酯B原料中不含有白果内酯。

所述银杏内酯B原料中不含有银杏酸。

所述银杏内酯B原料从银杏叶中提取获得。

本发明的另一目的在于提供一种上述银杏内酯B原料的制备方法。

该方法包括以下步骤：

(1)用乙醇水溶液回流提取银杏叶三次，乙醇水溶液用量为5～8倍药材重量，减压浓缩提取液至无乙醇味，加水静置澄清后，过滤，滤液上大孔吸附树脂，洗脱浓缩得到银杏叶提取物；

(2)银杏叶提取物加水溶解至浓度为0.1-1.0g/ml，用有机溶剂萃取，收集萃取液，减压浓缩至无溶剂，得到萃取物；

(3)向萃取物中加入浓缩物重量0.5-1.5倍的含水溶剂(V/W)，加热至完全溶解，冷藏静置析晶，抽滤，滤饼用含水溶剂洗晶，得结晶A；

(4)继续按结晶A重量加入适量含水溶剂(V/W),加热至完全溶解，冷藏静置析晶，抽滤，滤饼用含水溶剂洗晶，反复以此方法重结晶3-4次，得结晶Ⅰ，将每次重结晶后母液收集合并，备用；

(5)合并后母液减压浓缩至无溶剂，按浓缩物重量加入含水溶剂(V/W)，加热至完全溶解，冷藏静置析晶，抽滤，滤饼用含水溶剂洗晶，得结晶B；

(6)继续按结晶B重量加入适量含水乙醇(V/W)，加热至完全溶解，冷藏静置析晶，抽滤，滤饼用含水溶剂洗晶，反复以此方法重结晶3-4次，得结晶Ⅱ；

(7)将结晶Ⅰ与结晶Ⅱ合并，用乙醇完全回流溶解后，减压浓缩至无溶剂，即得银杏内酯B原料。

所述步骤(1)，加入乙醇水溶液，浓度为70％-80％，优选的，加入乙醇水溶液回流提取2次，第1次加入8倍药材重量的80％乙醇水溶液(V/W)回流提取2h，第2次加入6倍药材重量的70％乙醇水溶液(V/W)回流提取2h，合并2次提取液，减压浓缩至无乙醇味，加入1倍药液体积的冷水(V/V)搅拌并静置8-10h，抽滤，通过1倍滤液体积的大孔树脂(V/V)，先用10-30％乙醇洗脱2BV(BV，树脂床体积，下同)除杂，再用60％乙醇洗脱2BV，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩至无溶剂。

所述步骤(2)，银杏叶提取物加水溶解使浓度为0.1-1.0g/ml，优选的，水溶解银杏叶提取物的浓度为0.2-0.4g/ml，萃取溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯或二者的混合溶剂，优选的，萃取溶剂为乙酸乙酯，萃取体积为0.5-2倍药液体积(V/V),萃取次数为3-5次；收集萃取液，减压浓缩至无溶剂，得到萃取物。

所述步骤(3)，加入0.5-1.5倍浓缩物重量的含水溶剂(V/W)，优选的，溶解浓缩物的体积为0.9-1.1倍浓缩物重量(V/W),溶解浓缩物所用的含水溶剂为30-50％含水甲醇或乙醇，优选的，含水溶剂为50％含水乙醇，静置冷藏析晶时间8-16h，优选的，冷藏析晶时间为12-16h，洗涤滤饼的含水溶剂为30-50％含水甲醇或乙醇，洗涤次数为1-2次。

所述步骤(4)，溶解结晶A所用的含水溶剂为60-80％甲醇或乙醇，加入量为25-35倍结晶A重量(V/W)，优选的，溶解结晶所用的体积为25-30倍结晶A重量(V/W)，静置时间为8-16h，优选的，静置时间为12-16h，重结晶次数为3-4次，优选的，重结晶次数为4次。

所述步骤(5)，合并后母液减压浓缩至无溶剂；所述加热溶解浓缩物的含水溶剂为30-50％含水甲醇或乙醇，加入量为10-15倍浓缩物重量(V/W)，优选的，溶剂加入量为12-14倍浓缩物重量(V/W)；所述冷藏静置时间为8-16h析晶，抽滤，滤饼以结晶的相同含水溶剂洗晶，得结晶B。

所述步骤(6)，用含水溶剂为60-80％甲醇或乙醇溶解结晶，优选的，含水溶剂为80％甲醇，含水溶剂加入量为25-35倍结晶重量(V/W)，优选的，含水溶剂加入量为30-32倍结晶重(V/W)；冷藏静置析晶，抽滤，滤饼以结晶的相同含水溶剂洗晶，得结晶Ⅱ。

本发明步骤(1)、(2)、(5)或(7)中所述减压浓缩的压力为-0.08～-0.1Mpa；所述减压浓缩的温度为45～65℃。

本发明步骤(3)、(4)、(5)或(6)中所述冷藏静置析晶的温度为0～10℃，优选地，3～5℃；所述冷藏静置析晶的时间为8～16h，优选的，析晶时间为12～16h。

本发明的又一目的是提供了银杏内酯B原料在制备治疗涉及与血小板活化因子(PAF)相关的病症的药物中应用。

提供了银杏内酯B原料在制备治疗淤血阻络引起的心血管疾病、缺血性脑卒中和缺血性脑组织损伤的药物中应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的银杏内酯B原料的纯度可达99％以上，该银杏内酯B原料中杂质含量低，微量杂质银杏内酯HK化合物、银杏内酯K化合物和银杏内酯A化合物结构明确且含量低，质量可控，可用于药物如注射剂或吸入制剂的原料药，有助于药物的安全性和有效性。

(2)本发明分离并确定了银杏内酯B原料中的一种不常见微量內酯成分银杏内酯HK(1,10-dihydroxyginkgolid1,即1,10-二羟基银杏内酯)，对于银杏内酯后续的深入研究提供了研究基础与技术方案。

(3)本发明方法提高了原料利用度，而且残留的母液继续回收得到高纯度的银杏内酯B化合物，提高了银杏内酯B的收率，减少了生产成本，且采用的试剂安全无毒，可回收重复利用，制备方法适于工业化生产，有较大的应用价值。

具体实施方式

参考下列实施例将更易于理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例使用的试剂除有说明外，均可通过市售。

银杏内酯B、银杏内酯A、银杏内酯K及银杏内酯HK的色谱测定方法采用HPLC-ELSD色谱方法：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇：水＝30：70为流动相，蒸发光散射检测器检测(参考条件：Alltech3000：漂移管温度70℃，空气流速2.0L/min)。

实施例1

取干银杏叶500kg，粉碎，80％乙醇回流提取三次，溶剂用量依次为4 000L、2500L和2500L，每次提取2h,合并提取液，60℃减压(-0.09MPa)浓缩至无乙醇味，加入纯化水1000L，静置，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱(D101)，纯化水(1500L)洗柱去杂，70％乙醇(2000L)洗脱至洗脱液颜色变淡，洗脱液于60℃减压(-0.09Mpa)浓缩，60℃烘干4小时得银杏叶提取物(10.5kg)，HPLC-ELSD(高效液相-蒸发光散射检测器)检测银杏总内酯含量为8.1％。

实施例2

取干银杏叶500kg，粉碎，70％乙醇回流提取三次，溶剂用量依次为4000L、2500L和2500L，每次提取2h,合并提取液，60℃减压(-0.09Mpa)浓缩至无乙醇味，加入纯化水1000L，静置，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱(D101)，纯化水(1500L)洗柱去杂，65％乙醇(2200L)洗脱至洗脱液颜色变淡，洗脱液于60℃减压浓缩，60℃烘干4小时得银杏叶提取物(10.6kg)，HPLC-ELSD检测银杏总内酯含量为7.5％。

实施例3

取干银杏叶500kg，粉碎，80％乙醇回流提取一次，溶剂用量为4000L，然后70％乙醇回流提取一次，溶剂用量为3000L，每次提取2h,合并提取液，60℃减压(-0.09Mpa)浓缩至无乙醇味，加入纯化水1000L，静置，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱(D101)，纯化水(1500L)洗柱，再用25％乙醇洗脱1500L除杂，65％乙醇(2200L)洗脱至洗脱液颜色变淡，洗脱液于60℃减压浓缩，60℃烘干4小时得银杏叶提取物(11.3kg)，HPLC-ELSD检测银杏总内酯含量为8.7％。

实施例4

取按上述实施例1方法自制的银杏叶提取物2.5kg，加水搅拌至完全溶解，加入乙酸甲酯萃取，收集乙酸甲酯萃取液，减压(-0.09Mpa)(60℃)浓缩至无溶剂，称重437.4g。(萃取配料参数表表1)

实施例5

取按上述实施例2方法自制的银杏叶提取物5kg，加水搅拌至完全溶解，加入乙酸甲酯萃取，收集乙酸甲酯萃取液，减压(-0.09Mpa)(60℃)浓缩至无溶剂，称重850.4g。(萃取配料参数表见表1)

实施例6

取按上述实施例4方法自制的银杏叶提取物10kg，加水搅拌至完全溶解，加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，减压(-0.09Mpa)(60℃)浓缩至无溶剂，称重1780.8g。(萃取配料参数表见表1)

实施例7

取按上述实施例1方法自制的银杏叶提取物15kg，加水搅拌至完全溶解，加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，减压(-0.09Mpa)(60℃)浓缩至无溶剂，称重2730g。(萃取配料参数表见表1)

实施例8

取按上述实施例2方法自制的银杏叶提取物20kg，加水搅拌至完全溶解，加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，减压(-0.09Mpa)(60℃)浓缩至无溶剂，称重3620g。(萃取配料参数表见表1)

表1、银杏叶提取物溶剂萃取配料参数表

实施例9

取按上述实施例4方法制备的萃取物1kg，加入30％甲醇(1.5L)，加热至完全溶解，冷藏静置12h，抽滤，滤饼用少量30％甲醇洗涤1次，烘干得结晶A，称重16.8g。加入60％乙醇(0.588L)回流至完全溶解，静置8h析晶，抽滤，滤饼用少量60％乙醇洗涤1次，滤饼烘干，称重8.8g，按此方法重复结晶3次，最终得到结晶Ⅰ4.02g，将上述多次结晶后母液合并，减压浓缩至无溶剂，烘干，称重10.3g，加入30％甲醇(0.155L)回流至完全溶解，静置8h，抽滤，滤饼用少量30％甲醇洗涤1次，滤饼烘干得结晶B，称重5.02g，按此方法重复结晶3次，最终得到结晶Ⅱ0.51g。(制备工艺参数见表2和3)

实施例10

取按上述实施例5方法制备的萃取物1.5kg，操作步骤同实施例9，结晶A和结晶Ⅰ制备工艺参数见表2，结晶B和结晶Ⅱ制备工艺参数见表3。

实施例11

取按上述实施例6方法制备的萃取物2kg，操作步骤同实施例9，结晶A和结晶Ⅰ制备工艺参数见表2，结晶B和结晶Ⅱ制备工艺参数见表3。

实施例12

取按上述实施例7方法制备的萃取物3kg，操作步骤同实施例9，结晶A和结晶Ⅰ制备工艺参数见表2，结晶B和结晶Ⅱ制备工艺参数见表3。

实施例13

取按上述实施例8方法制备的萃取物5kg，操作步骤同实施例9，结晶A和结晶Ⅰ制备工艺参数见表2，结晶B和结晶Ⅱ制备工艺参数见表3。

表2、结晶A和结晶Ⅰ的制备工艺参数表

表3、结晶B和结晶Ⅱ的制备工艺参数表

实施例14

将实施例9制备的结晶Ⅰ3.92g与结晶Ⅱ0.41g合并，用乙醇(450ml)完全回流溶解后，减压浓缩至无溶剂，即得银杏内酯B原料(GB-1)4.3g。

实施例15

将实施例10制备的结晶Ⅰ6.05g与结晶Ⅱ0.78g合并，用乙醇(700ml)完全回流溶解后，减压浓缩至无溶剂，即得银杏内酯B原料(GB-2)6.75g。

实施例16

将实施例11制备的结晶Ⅰ7.83g与结晶Ⅱ1.35g合并，用乙醇(950ml)完全回流溶解后，减压浓缩至无溶剂，即得银杏内酯B原料(GB-3)9.1g。

实施例17

将实施例12制备的结晶Ⅰ14.4g与结晶Ⅱ1.68g合并，用乙醇(1600ml)完全回流溶解后，减压浓缩至无溶剂，即得银杏内酯B原料(GB-4)15.9g。

实施例18

将实施例13制备的结晶Ⅰ23.6g与结晶Ⅱ3.7g合并，用乙醇(2800ml)完全回流溶解后，减压浓缩至无溶剂，即得银杏内酯原料(GB-5)27.1g。

对实施例14-18制备得到的银杏内酯B原料精制品进行银杏内酯B含量和其它微量银杏内酯含量的HPLC检测分析，检测结果见表4。表4、银杏内酯B精制品和其它微量内酯成分含量检测结果