阅读说明：本技术 一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法及其应用 (A kind of separation method of 25 β--23 β of secondary cyclobutenyl-isobutyl acyloxy mibemycin derivative and its application ) 是由 刘铁 李晓倩 岳昌武 徐文晖 黄艳杰 吕玉红 田鹏 于 2019-07-16 设计创作，主要内容包括：本方案公开了米尔贝霉素衍生物技术领域的一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法,步骤为：一、使用乙酸乙酯抽提链霉菌FJS 31-2的次级代谢产物,得到乙酸乙酯提取物浸膏；二、对乙酸乙酯提取物浸膏进行拌样,然后用硅胶以石油醚湿法装柱,用石油醚－丙酮梯度洗脱,得到不同极性段的组分Fr.1～Fr.6；Fr.4经ODS-A柱层析梯度洗脱,得到3个组分Fr.4-1、Fr.4-2和Fr.4-3；再将组分Fr.4-2通过葡聚糖凝胶Sephadex LH–20柱层析分离,再进一步通过半制备型高效液相色谱仪,以乙腈–水为流动相,收集保留时间为17.990min的组分,回收溶剂得25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物。本方案制备的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物可应用于制备抗黑色素瘤药物。(This programme discloses 25 β of one kind--23 β of secondary cyclobutenyl-isobutyl acyloxy mibemycin derivative separation method of mibemycin derivative technical field, step are as follows: one, using ethyl acetate extracting streptomycete FJS 31-2 secondary metabolite, obtain ethyl acetate extract medicinal extract；Two, ethyl acetate extract medicinal extract is carried out mixing sample, component Fr.1~Fr.6 of opposed polarity section is then obtained with petroleum ether-acetone gradient elution with petroleum ether wet method dress post with silica gel；Fr.4 is eluted through ODS-A column chromatographic grade, obtains 3 components Fr.4-1, Fr.4-2 and Fr.4-3；Component Fr.4-2 is passed through into sephadex Sephadex LH -20 column chromatography for separation again, further pass through semipreparative high performance liquid chromatography instrument, using acetonitrile-water as mobile phase, the component that retention time is 17.990min is collected, recycling design obtains 25 β--23 β of secondary cyclobutenyl-isobutyl acyloxy mibemycin derivative.25 β--23 β of secondary cyclobutenyl-isobutyl acyloxy mibemycin derivative of this programme preparation can be applied to preparation anti-melanin tumor medicine.)

一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分 离方法及其应用

技术领域

本发明属于米尔贝霉素衍生物技术领域，特别涉及一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法及其应用。

背景技术

米尔贝霉素(Milbemycins)是一系列在结构上非常类似的十六元环大环内酯类抗生素，可由几种链霉菌产生，具有强烈的杀虫和杀螨等生物学活性。自1967年发现首个米尔贝霉素类化合物以来，大量结构类似的其他化合物被报道。国际上已有多个米尔贝霉素类药品实现了商业化，被广泛地用作兽医药物或作物保护农药。

米尔贝霉素类化合物中是否具有氢化苯并呋喃结构，可将其简单分为α-型和β-型两类结构，其中以α-型结构的活性远远高于β-型，因此人们对该类化合物的研究主要集中于α -型。另外，由于米尔贝霉素类化合物中具有较强的杀虫、杀螨、驱虫的生物活性，导致当前对米尔贝霉素类化合物的研究应用主要集中在抗病虫的农药或兽药上。针对米尔贝霉素类化合物在抗肿瘤方面的应用鲜有报道。

发明内容

本发明意在提供一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法，以从链霉菌FJS 31-2中提取分离出25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物，并对25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的抗肿瘤应用进行研究。

本方案中的一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法，所述 25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物从链霉菌FJS 31-2的次级代谢产物中分离得到；链霉菌FJS 31-2的保藏号为：CGMCC 4.7321。

链霉菌FJS 31-2的保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2016年6月2日，分类命名:链霉菌Streptomyces sp，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法具体包括以下步骤：

步骤一、使用乙酸乙酯抽提链霉菌FJS 31-2的次级代谢产物，得到乙酸乙酯提取物浸膏；

步骤二、采用80～100目的硅胶对乙酸乙酯提取物浸膏进行拌样，然后用200～300目的硅胶以石油醚湿法装柱，用石油醚－丙酮梯度洗脱，得到不同极性段的组分Fr.1～Fr.6；Fr.4 经ODS-A柱层析(甲醇-水70:30～90:10)梯度洗脱，得到3个组分Fr.4-1、Fr.4-2和Fr.4-3；再将组分Fr.4-2通过葡聚糖凝胶Sephadex LH–20柱层析(氯仿-甲醇1:1)分离，再进一步通过半制备型高效液相色谱仪，以乙腈–水(72:28,v/v)为流动相，收集保留时间为 17.990min的组分，回收溶剂得白色无定形粉末化合物：25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物。

本方案的有益效果：本方法操作简单，微量成分不易流失且可控性和重现性好。

活性测试证明，本发明分离得到的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物具有很好的抗黑色素瘤效果。因此，本发明提供了一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物在制备抗黑色素瘤的药物或组合物中的应用。

进一步，所述25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的结构式为：

附图说明

图1为本发明中25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的¹H–NMR核磁谱图；

图2为本发明中25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的¹³C–NMR核磁谱图；

图3为本发明中25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的13C-NMR和DEPT135及DEPT90对比谱图；

图4为本发明中25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的质谱图；

图5为本发明中25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的高分辨率质谱图；

图6为黑色素瘤癌细胞株初筛图；

图7为25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物对黑色素瘤的半数抑制浓度 (IC50)图；

图8为25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物作用于黑色素瘤癌细胞后的效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

分离提取

一种25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的分离方法，包括以下步骤：

步骤一、使用乙酸乙酯抽提保藏号为：CGMCC 4.7321的链霉菌FJS 31-2的次级代谢产物，得到乙酸乙酯提取物浸膏；

步骤二、采用80～100目的硅胶对乙酸乙酯提取物浸膏进行拌样，然后用200～300目的硅胶以石油醚湿法装柱，用石油醚－丙酮(1:0,15:1,10:1,8:1,5:1,3:1)梯度洗脱，得到不同极性段的组分Fr.1～Fr.6；Fr.4经ODS-A柱层析以甲醇-水(70:30,80:20,90:10)梯度洗脱，得到3个组分Fr.4-1、Fr.4-2和Fr.4-3；再将组分Fr.4-2通过葡聚糖凝胶SephadexLH–20柱层析(氯仿-甲醇1:1)分离，再进一步通过半制备型高效液相色谱仪，以乙腈–水(72:28,v/v)为流动相，收集保留时间为17.990min的组分，回收溶剂得白色无定形粉末化合物：25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物。以TLC检测254nm紫外下可见且10％硫酸乙醇显色剂显色后呈桃红色，以氯仿-丙酮10:1或石油醚-丙酮3:1为展开剂展开后，Rf值为0.5。

结构鉴定：

25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的结构式如下：

白色无定形粉末，ESI-MS(positive)给出m/z 693[M+Na]⁺，提示化合物的分子量为670。 HR-ESI-MS图谱给出m/z 693.3623[M+Na]⁺(计算值为693.3609)，确定化合物分子式为 C₃₈H₅₄O₁₀，计算不饱和度为12。

¹H-NMR(CDCl₃,500MHz)谱中，可以看到5组双重峰甲基氢信号，其中4组为与饱和碳相连的甲基氢δ0.69(3H,d,J＝6.6Hz),δ1.00(3H,d,J＝6.7Hz),δ1.00(3H,d,J＝6.7Hz), δ1.197(3H,d,J＝6.9Hz),δ1.20(3H,d,J＝6.9Hz)；1组为与末端烯碳相连的甲基δ1.66(3H,d,J＝6.7Hz)；3组连接不饱和碳的单峰甲基氢信号δ1.53(3H,s),δ1.59(3H,s),δ1.87(3H,br s)；1组与氧相连的亚甲基氢信号δ4.68(2H,m)。

¹³C-NMR(CDCl₃,125MHz)图谱中共有38个碳信号，结合DEPT90和135谱，可以看到其中包括：8个季碳信号，其中2个酯羰基碳信号(δ178.0,173.7)，以及4个烯碳信号(δ 139.6,137.9,137.5,133.2)，2个连氧的碳信号(δ100.3,80.3)；17个次甲基碳信号，其中6 个烯碳信号(δ142.9,125.0,123.5,120.5,120.4,118.2)，7个连氧的碳信号(δ80.3,79.3,76.1,75.5,68.6,68.3,67.8),4个与脂肪链相连的碳信号(δ45.8,37.8,36.1,34.4)；5个亚甲基碳信号，5个连脂肪碳链的亚甲基碳信号(δ48.6,36.3,36.2,34.7)，1个连氧的亚甲基碳信号(δ 68.5)；8个甲基碳信号(δ22.4,20.0,19.3,19.1,15.7,13.3,13.1,10.9)。

将该化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR核磁数据与化合物VM48130进行对比(Haxell etal. 1992；Baker et al.1996)，发现化学位移值及偶合常数值基本一致，故可将化合物鉴定为 VM48130。

详细数据如下表所示：

25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物的¹H和¹³C–NMR数据(500(¹H)and 125(¹³C)MHz,Chloroform–d)

C₃₈H₅₄O₁₀，白色无定形粉末。positive ESI-MS m/z 693[M+Na]⁺；¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ_H:5.76(m,1H),5.75(dd,J＝14.4,11.2Hz,1H),5.45(dq,J＝6.7,1.2Hz,1H),5.42(m,1H),5.31(m,1H),5.30(m,1H),4.97(m,1H),4.93(dd,J＝10.6,9.5Hz,1H),4.68(m,2H),4.29 (d,J＝6.0Hz,1H),3.95(d,J＝6.2Hz,1H),3.89(s,1H),3.61(m,1H),3.58(d,J＝10.4Hz,1H), 3.27(q,J＝2.5Hz,1H),3.21(d,J＝9.6Hz,1H),2.61(heptet,J＝6.9Hz,1H),2.42(m,1H),2.32 (br d,J＝7.9Hz,1H),2.25(m,2H),2.20(m,1H),1.90(m,1H),1.87(brs,3H),1.85(m,1H), 1.82(m,1H),1.80(m,2H),1.66(d,J＝6.7Hz,3H),1.59(s,3H),1.53(s,3H),1.20(d,J＝6.9Hz, 3H),1.19(d,J＝6.9Hz,3H),1.19(d,J＝8.6Hz,1H),1.00(d,J＝6.7Hz,3H),0.90(q,J＝12.4 Hz,1H),0.69(d,J＝6.6Hz,3H).The ¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)δ_C:178.0(s,C-35),173.7(s, C-1),142.9(d,C-11),139.6(s,C-8),137.9(s,C-4),137.5(s,C-14),133.2(s,C-31),125.0(d, C-32),123.5(d,C-10),120.5(d,C-15),120.4(d,C-9),118.2(d,C-3),100.3(s,C-21),80.3(s, C-7),80.3(d,C-25),79.3(d,C-6),76.1(d,C-23),75.5(d,C-22),68.6(d,C-19),68.5(t,C-27), 68.3(d,C-17),67.8(d,C-5),48.6(t,C-13),45.8(d,C-2),37.8(d,C-24),36.3(t,C-18),36.2(t, C-20),36.1(d,C-12),34.7(t,C-16),34.4(d,C-36),22.4(q,C-28),20.0(q,C-26),19.3(q,C-37), 19.1(q,C-38),15.7(q,C-29),13.3(q,C-33),13.1(q,C-30),10.9(q,C-34)。

25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物抗黑色素瘤测试

实验步骤：

(1)细胞复苏：取出-80℃冻存的黑色素瘤(B16)癌细胞株，迅速放入37℃水浴中解冻；将细胞悬液转移至含2mL的培养基的15mL离心管中，800rpm，离心3min。取1mL 培养基重新悬浮沉淀的细胞，并转移至含3mL培养基的细胞培养瓶中吹散均匀，置于37℃的CO₂培养箱培养。

(2)细胞传代：弃去培养瓶中的培养基，PBS液清洗2次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化倒置显微镜下观察细胞形态，收缩变圆时用3mL培养基终止消化。轻轻吹散细胞培养瓶内的贴壁细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管，800rpm，离心3min。取1mL培养基重新悬浮沉淀的细胞，并转移至含3mL培养基的细胞培养瓶中吹散均匀，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)细胞给药：取出传代的细胞，弃掉培养瓶内的培养基，PBS清洗2次，加入1mL0.25％胰蛋白酶消化，当细胞收缩变圆时，3mL培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使细胞培养瓶内的贴壁细胞充分脱落，收集细胞悬液转移至15mL离心管，800rpm，离心3min。细胞沉淀用培养基调整细胞浓度为5×10⁴个/mL，取100μL细胞悬液，分别加入96孔板培养孔，置于37℃CO₂培养箱培养24h。待细胞生长至培养孔的80％时，依次将该药物孔稀释成2μM、4 μM、8μM、16μM、32μM、64μM、128μM、256μM等8个浓度作为测试浓度，每个药物组平行6个复孔，37℃、5％CO₂培养箱作用24h后结束培养。上述培养基是在1640基础培养基的基础上添加10％血清和1％双抗配制而成。

(4)吸光度测定：弃去96孔板内的液体，PBS清洗每个孔板至无化合物残留，加入90μL 培养基和10μL cck8试剂，37℃继续孵育4h后终止培养，酶标仪于490nm处测定OD值。

(5)实验分析：

根据各组OD₄₉₀值的平均值和标准差，按以下公式能够计算处细胞生长抑制率：

采用SPSS18.0及GraphPadPrism6.0统计软件来计算IC₅₀。

IC₅₀(half maximal inhibitory concentration)是指药物的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序，如细胞死亡一半时的浓度或剂量，IC₅₀值可以用来衡量药物诱导死亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。

25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物对黑色素瘤癌细胞的半抑制浓度图如图7 所示。

不同浓度的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物对黑色素瘤癌细胞抑制率如下表

本实验采取了不同浓度的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物对黑色素瘤细胞株通过上述步骤进行实验，实验后黑色素瘤癌细胞如图8所示，图8中九宫格自上而下，第一排从左到右表示使用的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物浓度分别为：0μM、2μM、4μM；第二排从左到右表示使用的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物浓度分别为：8μM、16μM、32μM；第三排从左到右表示使用的25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物浓度分别为：64μM、128μM和256μM。图8 中白色部分中的50μM为标尺，表示细胞放大200倍后的效果图。

从图8中可以看出，当药物浓度在2μM、4μM、8μM时，观察到细胞形态及数量上与对照组并无明显差异；但当药物浓度在16μM时，细胞不仅在数量上有所减少，而且形态发生变化，部分细胞崩解；当药物浓度增大至32μM时，细胞崩解,细胞数量急剧减少；当药物浓度增大至64μM时，大部分细胞漂浮，绝大数细胞死亡。

25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物作用于黑色素瘤癌细胞后，黑色素瘤癌细胞的效应图如附图8所示。

从作用效果可以明显看出，25β-仲丁烯基-23β-异丁酰氧基米尔贝霉素衍生物对黑色素瘤癌细胞具有显著的抑制作用；其可广泛用于制备抗黑色素瘤的药物中。