一种新的香豆素二聚体及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种新的香豆素二聚体及其制备方法与应用 (Novel coumarin dimer and preparation method and application thereof ) 是由 陈海峰 张云武 姚新生 田文静 张弦 王光辉 林挺 叶贤胜 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：一种新的香豆素二聚体及其制备方法与应用,涉及医药技术领域,采用桑科榕属植物五指毛桃的干燥根茎,经过粉碎、溶剂提取、大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备液相分离等步骤获得一种新的香豆素二聚体。药理活性显示该化合物对Aβ-(25-35)损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用；Western boltting结果显示该化合物能下调阿尔兹海默症信号通路上相关蛋白Appoptosin和Aβ的表达。该化合物具有一定的神经保护作用和抗阿尔兹海默症活性,对抗阿尔兹海默症药物开发具有重要意义。(A new coumarin dimer and a preparation method and application thereof relate to the technical field of medicine, and the new coumarin dimer is obtained by adopting dried rhizome of Ficus hirta of Moraceae, and carrying out crushing, solvent extraction, macroporous adsorption resin column chromatography, silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 gel column chromatography, preparation liquid phase separation and other steps. The pharmacological activity shows that the compound is used for treating A beta 25‑35 Damaged SH-SY5Y cells have a protective effect; the Western felting result shows that the compound can down regulate the expression of related proteins Apptosin and Abeta on the signal path of the Alzheimer disease. The compound has certain neuroprotective effect and anti-Alzheimer's disease activity, and has important significance in developing anti-Alzheimer's disease drugs.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种新的香豆素二聚体的制备及其作为制备阿尔兹海默症(AD)药物的应用。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病，临床主要表现为记忆功能衰退、认知功能逐渐丧失和日常行为能力减退等(Reitz C,Brayne C,Mayeux R..Nature Reviews Neurology,2011,7(3):137-152；Scheltens P,Blennow K,Breteler MMB,et al.Lancet,2016,388:505-517.)。AD的病理特征主要表现为脑神经细胞外出现淀粉样蛋白(amyloid proteinβ，Aβ)聚集形成的老年斑和细胞内Tau蛋白异常磷酸化而形成的神经纤维缠结(neurofibrillary tangle，NFT)(GoedertM.Science,2015,6248(349):1255555；Reiss A B,Arain H A,Stecker M M,etal.Reviews in the Neuroences,2018.29(6):613-627.)。Appoptosin是最近发现的一个新的可与APP相互作用的促凋亡蛋白，其作为β淀粉样蛋白和Tau蛋白之间的重要因子，在AD的治疗过程中，扮演着十分重要的角色(Zhang H,Zhang Y W,Chen Y M,et al.Journal ofNeuroscience,2012,32(44):15565-15576.)。
五指毛桃(Ficus hirta)为桑科榕属植物，目前从该植物中分离得到的化合物主要为黄酮类、香豆素类、木质素类、三萜和甾体类等，而关于香豆素二聚体的报道几乎没有；另外该植物的抗阿尔兹海默症的活性报道主要集中在其粗提物方面，而关于香豆素二聚体的抗阿尔兹海默症活性研究未见报道。从五指毛桃中发现具有抗阿尔兹海默症的化合物，并将其开发为抗阿尔兹海默症候选药物具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供新的香豆素二聚体(ficudimer A)。
本发明的第二目的在于提供新的香豆素二聚体(ficudimer A)的制备方法。
本发明的第三目的在于提供新的香豆素二聚体(ficudimer A)可作为在制备抗阿尔兹海默症候选药物中的应用。
所述新的香豆素二聚体，将其命名为ficudimer A，其化学结构如下所示：
所述新的香豆素二聚体的制备方法包括以下步骤：
1)将五指毛桃的根茎粉碎，加入8～15倍量的溶剂回流提取若干次，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液；
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，然后经大孔吸附树脂柱层析，随后选用溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到含香豆素二聚体的浓缩液；
3)将步骤2)得到的浓缩液进行硅胶柱层析分离，选用有机溶剂进行洗脱，得到5～10个馏分；
4)将步骤3)所得的含香豆素二聚体的馏分经过ODS柱层析，用甲醇-水进行梯度洗脱，得到5～10个馏分；
5)将步骤4)所得的含香豆素二聚体的馏分经HPLC高效液相色谱法制备分离得到所述化合物。
在步骤1)中，所述溶剂可采用水和乙醇的混合物，混合后的乙醇浓度可为10％～95％；所述回流提取的次数可为2～4次，每次提取的时间可为1～3h；所述提取温度可为提取溶剂的沸点温度。
在步骤2)中，所述溶剂可采用乙醇-水，混合流动相的体积比可为0︰100，30︰70，40︰60，60︰40，95︰5。
在步骤3)中，所述有机溶剂可为环己烷-乙酸乙酯、石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇的混合物，其中混合流动相的体积比为100︰0，95︰5，9︰1，8︰2，7︰3，6︰4，1︰1。
在步骤4)中，所述甲醇-水体积比可为5︰95，1︰9，2︰8，3︰7，4︰6，1︰1，6︰4，7︰3，8︰2，9︰1，100︰0。
在步骤5)中，所述HPLC高效液相色谱法可采用绿百草半制备ODS色谱柱(5μm，250×20mm，40％ACN/H2O，4.0mL/min)。
所述一种新的香豆素二聚体对神经细胞SH-SY5Y具有保护作用，同时能影响阿尔兹海默症信号通路上相关蛋白的表达，可作为在制备抗阿尔兹海默症候选药物中的应用。所述新的香豆素二聚体可作为药物，其药物的组成可以是单体或者其衍生物。
本发明所述一种新的香豆素二聚体采用桑科榕属植物五指毛桃的干燥根茎，经过粉碎、溶剂提取、大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备液相分离等步骤获得一种新的香豆素二聚体。药理活性显示新的香豆素二聚体对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用；Western boltting结果显示新的香豆素二聚体能下调阿尔兹海默症信号通路上相关蛋白Appoptosin和Aβ的表达。新的香豆素二聚体具有一定的神经保护作用和抗阿尔兹海默症活性，对抗阿尔兹海默症药物开发具有重要意义。
附图说明
图1为化合物在20μΜ浓度下对SH-SY5Y细胞增殖的影响。
图2为化合物在20μΜ浓度下对N2a695细胞中Appoptosin和Aβ表达的影响。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：本发明所述新的香豆素二聚体的制备及结构鉴定
1、化合物的制备：
1)将五指毛桃的根茎粉碎，加入8倍量的10％乙醇溶剂回流提取4次，每次提取时间为1h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液。
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，经大孔吸附树脂柱层析，随后选用乙醇-水(0︰100，30︰70，95︰5)进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到含香豆素二聚体的浓缩液。
3)将含香豆素二聚体的浓缩液通过硅胶柱层析法进行分离，二氯甲烷-甲醇(100︰0，95︰5，9︰1，8︰2，7︰3)混合溶剂进行洗脱，得到5个馏分。
4)将步骤3)所得的第四个馏分经过ODS柱层析，用甲醇-水(2︰8，3︰7，4︰6，6︰4，1︰1)进行梯度洗脱，得到5个馏分。
5)将步骤4)所得的第四个馏分经HPLC高效液相色谱法制备分离得到香豆素二聚体。所述HPLC高效液相色谱法采用绿百草半制备ODS色谱柱(5μm，250×20mm，40％ACN/H2O，4.0mL/min)。
2、化合物的结构鉴定：
化合物的1H NMR和13C NMR数据见表1。
表1.化合物ficudimer A的1H NMR和13C NMR数据(DMSO-d6)
1H NMR(600MHz)；13C NMR(150MHz)
实施例2：本发明所述新的香豆素二聚体的制备
1)将五指毛桃的根茎粉碎，加入10倍量的60％乙醇溶剂回流提取2次，每次提取时间为3h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液。
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，经大孔吸附树脂柱层析，随后选用乙醇-水(0︰100，60︰40，95︰5)进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到含香豆素二聚体的浓缩液。
3)将含香豆素二聚体的浓缩液通过硅胶柱层析法，环己烷-乙酸乙酯(100︰0，9︰1，8︰2，7︰3，6︰4，1︰1)混合溶剂进行洗脱，得到6个馏分。
4)将步骤3)所得的第三个馏分经过ODS柱层析，用甲醇-水(2︰8，4︰6，1︰1，6︰4，7︰3)进行梯度洗脱，得到5个馏分。
5)将步骤4)所得的第五个馏分经HPLC高效液相色谱法制备分离得到香豆素二聚体。所述HPLC高效液相色谱法采用绿百草半制备ODS色谱柱(5μm，250×20mm，40％ACN/H2O，4.0mL/min)。
实施例3：本发明所述新的香豆素二聚体的制备
化合物的制备：
1)将五指毛桃的根茎粉碎，加入15倍量的95％乙醇溶剂回流提取3次，每次提取时间为2h，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩液。
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，经大孔吸附树脂柱层析，随后选用乙醇-水(0︰100，40︰60，95︰5)进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到含香豆素二聚体的浓缩液。
3)将含香豆素二聚体的浓缩液通过硅胶柱层析法，石油醚-乙酸乙酯(100︰0，95︰5，8︰2，7︰3，6︰4，1︰1，4︰6，3︰7，2︰8，0︰100)洗脱，得到10个馏分。
4)将步骤3)所得的第四个馏分经过ODS柱层析，用甲醇-水(5︰95，1︰9，2︰8，3︰7，4︰6，1︰1，6︰4，7︰3，8︰2，9︰1)进行梯度洗脱，得到10个馏分。
5)将步骤4)所得的第七个馏分经HPLC高效液相色谱法制备分离得到香豆素二聚体。所述HPLC高效液相色谱法可采用绿百草半制备ODS色谱柱(5μm，250×20mm，40％ACN/H2O，4.0mL/min)。
实施例4：本发明所述新的香豆素二聚体的神经保护活性和抗阿尔兹海默症作用
1.化合物的神经保护活性
1.1利用MTT法检测化合物对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
(1)细胞复苏：将冻存的人神经瘤细胞(SH-SY5Y)于37℃水浴中迅速解冻，然后置于离心机中1000rpm离心2min。离心结束后，将细胞上清液弃去后，加入新鲜DMEM培养基(90％DMEM，10％FBS和1％双抗)重悬细胞，然后接种于10cm培养皿中，将细胞混合均匀后，放于37℃，含5％CO2且湿度恒定的细胞培养箱中培养，培养24h后更换培养基。
(2)传代：当细胞密度长至70％左右时吸掉培养基，用灭菌的PBS清洗细胞2次后，加入适量胰酶消化液消化细胞，待细胞变圆后，加入培养基终止消化。用移液枪枪头反复吹打细胞，待细胞完全脱落后转移至离心管中离心(1000rpm，2min)。离心结束后，弃去细胞上清液，加入新鲜的培养基将细胞重悬均匀后，按照1︰3的比例接种于新的培养皿中，于细胞培养箱中继续培养。
(2)铺板：细胞传至2～3代后，收集对数期的细胞，将细胞调整至合适密度后，加入到96孔细胞培养板中，每孔100μL，设置3个复孔。将细胞置于细胞培养箱中培养。
(3)加药和Aβ25-35：待细胞贴壁稳定后，吸去旧的培养基。空白对照组每孔加入200μL新鲜培养基；给药组每孔加入100μL含化合物的培养基；模型组每孔加入100μL培养基。培养2h后，模型组加入100μL Aβ25-35使终浓度为20μM，给药组加入化合物和100μL Aβ25-35使药物终浓度为20μM，Aβ25-35终浓度为20μM。然后，将细胞置于细胞培养箱中培养。
(4)加MTT：培养24h后，吸去96孔中的培养基，每孔加入MTT与培养基的混合液75μL(比例为1︰4)，置于细胞培养箱中继续培养4h。
(5)OD值的测量：培养4h后，弃去96孔板中的MTT，然后每孔加入100μL DMSO，置于水平摇床上低速振荡10-20min，最后用酶标仪(490nm)测定吸光值(OD)。
1.2实验结果
MTT实验结果(参见图1)显示，化合物在20μM浓度下能促进SH-SY5Y细胞的增殖。
2、Western blotting检测化合物对阿尔兹海默症信号通路上相关蛋白表达的影响
2.1实验方法
①实验细胞：N2a细胞(小鼠神经瘤母细胞系)，N2a695细胞(人β-淀粉样蛋白前体蛋白APP695转染的小鼠神经瘤母细胞系)。
②实验操作：
(1)细胞培养：将冻存的N2a和N2a695细胞复苏后，置于DMEM培养基中，其中培养N2a695细胞的培养皿中加入200μg/mL的G418，放于37℃，含5％CO2且湿度恒定的细胞培养箱中培养，培养24h后更换培养基。继续培养至细胞密度为70％左右时进行传代，传至2-3代后得到形态和生长状态稳定良好的细胞。
(2)铺板加药：将培养好的细胞按每孔1×106的密度加入到含2mL培养基的6孔板中，混合均匀后置于细胞培养箱中培养。待细胞贴壁稳定后，换上2mL新鲜的培养基，其中N2a695细胞中加入终浓度为20μM的化合物和同体积的DMSO作为对照，N2a细胞中也加入同体积的DMSO作为对照。然后将培养基混匀后置于细胞培养箱中培养10h。
(3)细胞裂解：将培养好的细胞吸去培养基，用预冷的1×PBS溶液清洗细胞两遍，然后将6孔板置于冰盒上，向6孔板中加入适量的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。轻微摇晃6孔板至裂解液均匀分布于细胞表面，裂解2min后用细胞刮刀将细胞刮下，然后将其转至预冷的1.5mL EP管中，放于冰盒上继续裂解30min，每隔10min将细胞于涡旋振荡仪中振荡2s。最后将裂解好的细胞放在预冷的4℃离心机中，12000rpm离心10min，取离心上清液备用。
(4)蛋白浓度的测定：取离心上清液，利用BCA法测定蛋白样品的浓度。
(5)蛋白凝胶电泳：取相同质量的蛋白样品，加入1/4体积的5×SDS loadingbuffer(含5％β-巯基乙醇)，于100℃恒温金属浴中5min，置于离心机中离心去沉淀。将等量的蛋白样品加入到制备好的电泳凝胶板的梳孔中，每孔总蛋白量控制在20～60μg，体积不超过30μL。两端加入1μL蛋白maker，于80V电压下电泳。当样品进入分离胶后，可调高电压至120V继续电泳至溴酚蓝条带距离凝胶底部1～2cm处停止电泳。
(6)转膜：将凝胶从胶板上取下后暂放于预冷的电转液中，然后取相同大小的PVDF膜(预先使用甲醇处理1min)及滤纸浸入电转移液中。将电转夹黑色面朝下，依次铺上海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵。除去电转夹中气泡，按照膜朝正极的顺序装到电转槽中，于冰盒中进行电转移。此时电压控制在90V，电流控制在300mA以下，电转60～90min。
(7)封闭：把电转移后的PVDF膜放于含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液中，于水平摇床上，室温封闭1h。
(8)一抗反应：把PVDF膜从封闭液中取出后，裁剪所需的蛋白条带，将其用适量的TBST缓冲液清洗2次后，放于抗体孵育盒中，向其中加入对应的一抗，所有一抗均用5％BSA1:1000进行稀释(anti-Appoptosin和anti-Aβ)。然后将PVDF膜于4℃摇床振荡过夜。
(9)二抗反应：回收一抗后，将PVDF膜用TBTS缓冲液于水平摇床上清洗3次，每次10min，然后加入二抗(1:5000)，室温下孵育1h。
(10)ECL化学发光检测：吸掉二抗后，将PVDF膜用TBTS缓冲液于水平摇床上清洗4次，每次8min。将PVDF膜置于塑料膜中并取ECL化学发光液的A液与B液按1︰1(V/V)混合均匀后备用。在暗室中，将适量的ECL化学发光混合液均匀涂于PVD膜的表面，暗室中曝光，根据信号强弱调整曝光时间。最后依次将胶片进行显影和定影。
2.2实验结果
化合物在20μM浓度下能下调Aβ和Appoptosin蛋白的表达(参见图2)。
本发明所述新的香豆素二聚体采用桑科榕属植物五指毛桃的干燥根茎，经过粉碎、溶剂提取、大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、制备液相分离等步骤获得一种新的香豆素二聚体。药理活性显示该化合物对Aβ25-35损伤的SH-SY5Y细胞具有保护作用；Western boltting结果显示该化合物能下调阿尔兹海默症信号通路上相关蛋白Appoptosin和Aβ的表达。以上结果提示该化合物具有一定的神经保护作用和抗阿尔兹海默症活性，对抗阿尔兹海默症药物开发具有重要意义。
上述实施例仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。