具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的制备的制备方法，根据putative trypsin(Tsp_00436)基因序列优化后的putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白质的基因序列如SEQ ID NO.2所示。newborn larvae specific DNaseII-11重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该蛋白质的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

1、该基因片段由苏州泓迅生物科技股份有限公司上合成了含有相对应目的基因的表达载体putative trypsin(Tsp-00436)、newbornlarvae-specific DNaseII-11、分别双酶切的步骤如下：

(1)将装有目的基因的表达载体冻干粉的离心管3000rpm/常温离心1min。

(2)用50μL无菌ddH₂O溶解冻干粉，之后用涡旋仪轻轻混匀，掌上离心机瞬离30s。

(3)用NANODROP测浓度。

(4)表达载体质粒pET-28a用限制性内切酶酶切，酶切系统表见表1。反应条件为37℃/10min。

表1 pET-28a表达质粒双酶切体系

2、重组质粒转化表达感受态

(1)取50μL冰浴完毕的BL21(DE3)放入1.5mL无菌离心管中，置于冰盒中融化(切勿用手搓化)，用移液器吸取5μL pET-28a-putative trypsin(Tsp_00436)和pET-28a-newborn larvae specific DNaseII-11表达质粒分别加入其中，在冰上静置30min。

(2)冰浴后，将离心管置于水浴中，在42℃的热冲击下漂浮45S，然后将管转移到冰中进行冰浴2min。

(3)在无菌超净台中，以220rpm的速度向各离心管中加入400-500μL无菌液体LB培养基，在37℃的摇床中培养1h。

(4)先将对应抗性的LB固体平皿置于37℃预热，待平皿内的水蒸气完全挥发后取出备用。

(5)根据实验需求，吸取适量转化之后的感受态细胞，呈散点似的滴加在预热好的平皿中，均匀涂布感受态细胞，放入37℃培养箱。

(6)在37℃恒温培养箱中过夜培养。

3、His标签重组蛋白质的小量诱导表达

(1)用无菌白枪头挑取转化后BL21(DE3)的单个菌落，PCR鉴定正确后，分别接种于10mL含有相应抗性的液体LB培养基，200rpm/37℃恒温培养箱，过夜培养。

(2)次日，在无菌操作台中保菌后，用移液器吸取100μL的菌液接种于10mL含有相对抗性的液体LB培养基中，37℃200rpm条件下培养，当菌液OD_600nm＝0.6-0.8时，可加入IPTG诱导。

(3)加蛋白诱导剂前，在无菌操作台中，吸100μL未诱导全菌，作为阴性对照。之后，加入0.1M IPTG诱导剂，使IPTG终浓度为0.1mM、0.2mM、0.5mM，在不同的温度进行诱导(16℃、32℃、37℃)。

(4)集取16℃低温培养16h、32℃低温培养8h、37℃恒温培养5h的菌液，收集好的菌液置于15mL除酶管中，在4℃离心机4000rpm离心15min，弃掉上清，菌体沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取60μL菌液作为诱导后全菌样品，余下的菌液用小型超声破碎仪破碎，仪器的破碎功率为28w，超声2s，停歇3s，观察菌体清澈即可，破碎后的菌液置于1.5mL EP管中，在4℃离心机中5000rpm离心10min，取60μL上清(诱导后上清)后，弃掉上清，沉淀用1mL磷酸盐缓冲液重悬后，取60μL作为诱导后沉淀。

(5)将不同温度和不同IPTG浓度下的上清、沉淀、全菌，分别加入20μL 1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，在100℃沸水中煮10min后，取出备用。

(6)将制备好的不同温度和不同IPTG浓度的全菌、上清、沉淀的蛋白样品，各取10μL(同一温度不同的IPTG浓度的蛋白样品依次上样，以便后续观察)加样于10％SDS-PAGE蛋白胶电泳中，蛋白电泳槽的设置功率为：电压150V，时间55min。

(7)将切好的蛋白胶放入预先倒入G250-考马斯亮蓝染色液的蛋白染色盒中，在水平摇床上摇晃70min。

(8)将染色完毕的蛋白胶，放入脱色液中，过夜脱色后，用照胶仪观察重组蛋白的表达情况，同时确定转入表达感受态目的基因是否表达、表达量以及表达形式为可溶性存在于上清中还是包涵体存在于沉淀中。

本步骤中小量诱导表达两个蛋白都包涵体表达，最佳诱导温度为诶37℃，tsp_00436的IPTG浓度为0.2mM。诱导表达newborn larvae specific DNaseII-11的IPTG浓度为0.5mM。

4、His标签包涵体重组蛋白质的大量表达与纯化

(1)预先从-20℃冰箱取出带有His标签重组蛋白质的菌液，放入4℃冰箱中，待菌液完全融化后，在无菌超净台中，用接种环挑取适量菌液，在Kana抗性培养板采取交叉划线法快速划线后，将培养皿放于37℃恒温培养箱，培养10h。

(2)次日取出培养皿，用白枪头挑取形态圆润的1-2mm的单菌落，接种于20mL Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床中200rpm，过夜培养。

(3)在无菌操作台中，吸取5mL过夜培养的菌液，加入500mL含有Kana抗性的液体LB培养基中，37℃恒温摇床，200rpm摇3h后，测量菌液的OD值。

(4)若分光光度计的OD值为0.6-0.8之间，证明该菌液以达到生长曲线的峰值，根据该蛋白在小量诱导表达时优化完毕的条件，进行培养。

(5)将摇好的菌液从锥形瓶中分到若干个无菌50mL离心管中，在低温离心机中，4000rpm离心15min，将上清弃到废液缸中，每管再加入5mL PBS将沉淀用涡旋器重悬，集入到两个无菌50mL离心管中，同样条件下再次离心，最后用每管菌液再加入25mL PBS重悬洗涤后，在4℃离心机中4000rpm离心20min后，弃掉上清。

(6)提前半小时将冷却机设置为4℃预冷，启动高压破碎仪，等待气压缓冲完毕后，用75％酒精、ddH2O、His Binding Buffer依次通过破碎管，3遍后，排气、排废液。

(7)根据菌体沉淀量，加入适量的PBS，用涡旋器将菌体沉淀完全重悬，倒入高压破碎管中反复破碎3-4次后，用超高速4℃离心机，12000rpm离心13min，留取沉淀备用。

(8)将沉淀用100μL的ddH₂O混匀，加入10mL含6M-8M尿素Binding Buffer混匀放圆形旋转仪室温过夜感作。

(9)第二天，在4℃离心机中以12000rpm的转速对所感测到的破碎细菌液体离心13min，并保留上清液以备后用。

(10)将空纯化柱，先用6M-8M尿素His Binding Buffer润洗两遍，留有少量的HisBinding Buffer，根据上清液的量，吸取适量的Ni-Agarose Resin，缓缓加入纯化柱中，待Ni-珠子完全下沉到底部时，打开底部开关，排出废液后，在使用适量的His BindingBuffer过柱洗涤填料。

(11)将步骤(9)收集的上清加入处理完毕后的Ni-Agarose Resin填料中，置于水平旋转仪上，在室温中，缓慢感作3h。

(12)将结合完毕后的上清与Ni-Agarose Resin的混合物倒入纯化柱中，待Ni-Agarose Resin完全沉淀后，打开底部开关，调整流速，待Ni-Agarose Resin完全在纯化柱内时，过柱完毕。

(13)第一次摸索His重组蛋白纯化的条件时，先用从低到高浓度的咪唑洗脱：6M-8M尿素bingding buffer、10、20、40、60、80、100、250、500mM，每次3mL依次洗脱并用2mL无菌离心管收集，暂时储存在冰盒内。

(14)将不同梯度的咪唑洗脱下来的蛋白、过柱液、以及最后一遍洗脱后的Ni-Agarose Resin，分别制取样品，进行蛋白凝胶电泳，用蛋白照胶仪观测目的条带后，决定该蛋白的洗杂和洗脱浓度。

本步骤中，Tsp_00436蛋白最佳咪唑的洗脱浓度为250mM。newborn larvaespecific DNaseII-11蛋白的最佳洗脱浓度为500mM。

5、His标签包涵体重组蛋白质的透析和浓缩

(1)观察SDS-PAGE蛋白胶，根据条带的粗细与纯度，确定目的蛋白质的体积，用浓缩仪，1500rpm，30min离心浓缩备用。

(2)先将透析袋的一端，折两小折，在用蛋白透析夹子将一端夹住，将目的蛋白质沿着透析袋的边缘缓缓加入，再将另一端透析袋折两小折，夹紧，进行梯度透析：

a.将夹在透析袋中间的蛋白质在含有6M尿素和0.5M精氨酸的3L PBS中透析过夜。

b.次日，观察透析后的蛋白是否有絮状物，若有絮状物，终止透析，若无絮状物，将夹住的靶蛋白置于含4M尿素和0.5M精氨酸的2L PBS中，透析4h，每1.5h观察透析袋中是否有絮状物。

c.若无絮状物，将夹好的蛋白质放入含有2M尿素、0.5M精氨酸的2L PBS中，透析4h，每隔1.5h观察透析袋内是否有絮状物。

d.若无絮状物，将夹住的蛋白质置于含0.5M精氨酸的3L PBS中，透析4h，每1.5h观察一次透析袋中是否有絮状物。

(3)将透析完毕的目的蛋白，转移至2mL无菌离心管中，放置于冰盒中，用Nanodrop测其浓度后，再根据SDS-PAGE观察目的蛋白的条带，决定是否要浓缩蛋白质。

(4)变性好的目的蛋白质，分装到无菌200μL离心管中，置于-80℃存储，最好是立即使用。

6、His标签包涵体重组蛋白质的Western-blot鉴定

(1)SDS-PAGE跑胶参照步骤三。

(2)根据蛋白胶的大小，裁剪适当大小的PVDF膜，并用甲醇激活1min，将定性滤纸(3层为一个)剪成合适大小，浸泡在转膜液中，赶出滤纸与滤纸间的气泡，转膜时，夹子的黑面水平放在下面，上面依次为吸水网-3层定性滤纸-蛋白胶-PVDF膜-层定性滤纸-吸水网，确保无气泡后，将夹子合上，放入转膜槽内，并且夹子的黑面对转膜槽的黑面，夹子的透明面对转膜槽的红面，检查好正负极，开始转膜，设置的功率为：电流175mA，时间为86min。

(3)转膜后，将PVDF膜放入提前配制完毕的含有封闭液(5％脱脂奶)的塑料盒中，放入37℃培养箱中，摇床上摇动封闭1h。

(4)用含His-tag单克隆抗体(1:5000)的5％脱脂乳封闭，4℃孵育过夜。

(5)PBST洗膜，每次10min，洗4次。

(6)AP山羊抗小鼠IgG 1:5，000PBST稀释，37℃孵育60min。

(7)重复步骤(5)。

(8)配取适量的BCIP/NET显色试剂，进行避光显色2-3min，观察结果并扫描。

合成目的基因putative trypsin(Tsp_00436)重组表达质粒，目的基因为1275bp，用NdeI and XhoI限制性内切酶酶切后鉴定，其双酶切验证结果如图1所示。纯化后的蛋白质经SDS-PAGE和免疫印迹验证，和预期蛋白大小相同，其重组蛋白质大小为55KDa，如图2所示。

合成目的基因newborn larvae specific DNaseII-11重组表达质粒，目的基因为981bp，用NdeI and XhoI限制性内切酶酶切后鉴定，其双酶切验证结果如图3所示。纯化后的蛋白质经SDS-PAGE和免疫印迹验证，和预期蛋白大小相同，其重组蛋白质大小为37KDa，如图4所示。

实施例2

如图5所示，本实施例提供了一种旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸，该时间分辨荧光免疫层析试纸条包括样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素薄膜5(NC膜、层析膜)和吸水纸4和PVC底板1。PVC底板1上的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜5、吸水纸4。其中，硝酸纤维素膜5的一端与结合垫3一端叠压，硝酸纤维薄膜5的另一端与吸水纸4的一端叠压，样品垫2的一端与结合垫3的另一端叠压；结合垫3上包被有荧光微球标记的山羊抗牛IgG抗体，硝酸纤维素薄膜5上靠近结合垫一侧设检测线6，靠近吸水纸4的设有质控线7，

样品垫2中有加样孔，结合垫3中包被有时间分辨荧光微球标记的1mg/mL的小鼠IgG和50μg/ml的putative trypsin(Tsp_00436)重组抗原的混合物，硝酸纤维素薄膜5的检测线6有newborn larvae specific DNaseII-11重组抗原，质控线7上包被有山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgG的包被浓度为2mg/mL。

本发明为了提高绵羊旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸条检测时的准确性，摸索了以下条件：

优化时间分辨荧微球免疫层析试纸条的前提条件：其他条件不变，每次只改变其中一个变量。反应条件为：阳性样本和阴性样本的加样量均为75μL(血清与稀释液的比例为1:2)，其反应时间均为15min。其包被参数为0.75μL/cm喷洒参数在NC膜上进行抗原或者抗体的包被，形成检测线(T)和质控线(C)。

1、包被抗原的确定

将newborn larvae specific DNaseII-11重组抗原1.0mg/ml，2.0mg/ml，3.0mg/ml工作浓度进行包被，C线山羊抗小鼠IgG以2.0mg/ml浓度包被。放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱烘干16h。搭配荧光垫和样品垫，制备小样。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳的包被抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表1，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。当newborn larvaespecific DNaseII-11重组抗原浓度为2.0mg/ml时，是最适包被量。

表1包被抗原浓度的检测结果

2、标记抗原浓度的确定

以相同标记方法，用处理好的荧光微球分别标记不同量的putative trypsin(Tsp_00436)抗原，标记量分别为：25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。以同以4倍的稀释浓度对其稀释制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的标记抗原浓度。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表2，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。当标记抗原putativetrypsin(Tsp_00436)浓度为50μg/ml时，是最适的结合垫标记浓度。

表2标记抗原浓度的检测结果

3、荧光标记溶液稀释比例的确定

将标记好的荧光微球分别作2倍、4倍、8倍，3种稀释度稀释。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最佳的荧光标记溶液稀释比例。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表3，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。当荧光标记溶液稀释比例为4倍时，为最佳的荧光标记溶液最适稀释比例。

表3荧光标记溶液稀释比例的检测结果

4、荧光工作液的确定

按确定的荧光标记溶液稀释比例，选取合适的荧光微球悬浮液，其分为三组：第一组为：0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、0.05％BSA、0.05％Tween20，调至pH＝7.9；第二组为：0.02MTris-HCl、0.4％BSA，调至pH＝7.5；第三组为：0.1MTris-HCl、0.1％BSA(5mL)、10％S9、10％Tween20、10％PEG12000、3g海藻糖。制备小样，搭配包被片材和样品垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的荧光工作液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表4，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组荧光工作液时，为最佳的荧光工作液。

表4荧光工作液检测结果

5、样品垫处理液的确定

为了是使样品中的抗体能更好的与结合垫中荧光微球标记的抗原结合，配制了三种样品垫处理液，分为三组。第一组为：1％BSA、0.1％Triton-100的、0.02mol/L的pH7.4的磷酸盐缓冲液；第二组为：0.1M Na₂B₄O₇·10H₂O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN3，调至pH＝9.3；第三组为：0.5M硼酸缓冲液、1％TritonX-100、1％PVP、2％NaCl，调至pH＝9.0。制备小样，搭配包被片材和荧光垫，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品垫处理液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表5，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。发现使用第二组样品垫处理液时，为最佳的样品垫处理液。

表5样品垫处理液检测结果

6、反应时间的确定

用移液器吸取75μL样本加入到150μL样本缓冲液内，充分混匀30s^-1min，用移液器吸取75μL混合后的样本，滴加到检测卡的加样孔内，待反应10min，15min，20min后分别进行读数。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，已确定最佳反应时间。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表6，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。层析试纸条最佳反应时间为15min。

表6反应时间的检测结果

7、样品缓冲液的确定

为了确保抗原抗体充分反应，摸索了三种样品稀释液，分成三组，分别为：第一组：pH＝7.8的0.02MTris-HCl、0.9％NaCl、0.1％BSA、0.5％Tween-20、0.1％NaN₃；第二组：pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN₃；第三组：pH＝7.8的PBS缓冲液。在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样品稀释液。选择的条件为：当滴加阳性样本时，T/C值最大；当滴加阴性样本时，T/C值最小。

结果见表7，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。第二组样品缓冲液为最佳的样品稀释液。

表7样品缓冲液的检测结果

8、样品稀释比例的确定

样本与样品缓冲液，分别按照下表8的比例，进行混合，混合后的样本，滴加至检测卡加样孔中，在荧光免疫分析仪读取T、C值，计算出T/C，以确定最适的样本稀释比例。

表8样本与样品缓冲液稀释比例

结果见表9，其中N代表阴性血清样本；P代表阳性血清样本。最适的稀释比例为1:2(样品体积:样品缓冲液)

表9样品稀释液的检测结果

本实施例中，用于早期诊断的旋毛虫病时间分辨荧光免疫层析试纸条中，newbornlarvae specific DNaseII-11重组抗原浓度为2.0mg/ml，标记抗原putative trypsin(Tsp_00436)浓度为50μg/ml，荧光标记溶液稀释比例为4倍，荧光微球悬浮液为：0.02MTris-HCl、0.4％BSA，调至pH＝7.5；样品垫处理液为0.1M Na₂B₄O₇·10H₂O、1％PVP、0.2％Casein-Na、1％Triton-X100、1％Tetronic 1307、0.2％NaN₃，调至pH＝9.3；层析试纸条最佳反应时间为15min。样品缓冲液为pH＝7.8的0.05MTris-HCl、0.9％NaCl、1.5％BSA、0.01％Tween-20、0.1％NaN₃；样品稀释比例，样品体积:样品缓冲液体积为1:2。

实施例3、时间分辨荧光微球层析试纸条特异性

如图6所示，对绵羊旋毛虫阳性血清、绵羊仰口线虫阳性血清、绵羊食道口线虫阳性血清、绵羊毛尾线虫阳性血清样本进行检测，除绵羊旋毛虫的阳性血清外，在荧光免疫分析仪下，其他非绵羊旋毛虫病原体的血清在T线均没有检测到信号，只有C线有出现一条带，即为阴性。

实施例4、时间分辨荧光微球层析试纸条灵敏度

阳性血清倍比稀释后，分别将稀释好的样本滴加到样品垫中，15min后在荧光免疫层析下观测T线的荧光强度。结果显示当阳性血清稀释比例为1:1600时，可以清晰的看见T、C线，当阳性血清稀释比例为1:3200时，T线的亮度很微弱，但C线依旧亮度明显，证明检测结果有效。结果如图7。

如图8所示，利用实施例2制备的检测试纸条检测旋毛虫病不同时期血清及阴性血清检测结果图。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> 用于检测早期旋毛虫病的特异性抗原及应用

<130> GG21928942A

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ile Arg Arg Leu Phe Gln Tyr Thr Ser Met Thr Phe Ala Trp Ile

1 5 10 15

Leu Leu Phe Leu Ser Ala Ala Ser Pro Ser Leu Gly Glu Phe Glu Cys

20 25 30

Gly Val Pro His Phe Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser Gly Arg Ile Val

35 40 45

Gly Gly Thr Asp Val Arg Pro His Ser His Pro Trp Gln Ile Gln Leu

50 55 60

Leu Lys Ser Glu Thr Gly Gly Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Leu

65 70 75 80

Val His Phe Gly Glu Pro Ser Asn Gly Thr Arg Phe Val Leu Thr Ala

85 90 95

Ala His Cys Ile Thr Thr Ser Asn Met Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Phe

100 105 110

Thr Val Val Thr Gly Ala His Asn Ile Lys Met His Glu Lys Glu Lys

115 120 125

Lys Arg Ile Pro Ile Thr Ser Tyr Tyr Val Gln His Trp Asn Pro Val

130 135 140

Met Thr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Ala Glu Thr Val Tyr

145 150 155 160

Tyr Asn Lys Tyr Thr Arg Pro Val Cys Leu Pro Glu Pro Asn Glu Glu

165 170 175

Leu Thr Pro Gly Asp Ile Cys Val Val Thr Gly Trp Gly Asp Thr Thr

180 185 190

Glu Asn Gly Thr Thr Ser Asn Thr Leu Lys Gln Val Asp Val Lys Ile

195 200 205

Met Lys Lys Gly Thr Cys Ala Asn Val Arg Ser Glu Val Ile Thr Phe

210 215 220

Cys Ala Gly Ala Met Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser

225 230 235 240

Gly Gly Pro Leu Ile Cys Lys Lys Asn Gly Lys Ser Val Gln Phe Gly

245 250 255

Val Val Ser Tyr Gly Thr Gly Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Pro Gly Val

260 265 270

Tyr Ala Lys Val Pro Ser Tyr Val Thr Trp Leu Asn Lys Ala Ala Lys

275 280 285

Glu Leu Glu Asn Ser Pro Glu Gly Thr Val Lys Trp Ala Ser Lys Glu

290 295 300

Asp Ser Pro Val Asp Leu Ser Thr Thr Ser Arg Pro Thr Asn Pro Tyr

305 310 315 320

Thr Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Tyr

325 330 335

Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro Thr Ser Pro Ser Ser Gly Ser Arg Pro

340 345 350

Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Gln Asp Gln His Leu His Leu Val Asp Gln

355 360 365

Asp Pro His Ile His Leu Val Asp Gln Asp Gln His Ile His Ile Leu

370 375 380

Asp Gln Asp Leu Leu Leu Lys Ser Gln Tyr Phe His His Thr Lys Asn

385 390 395 400

Ile Arg Gln Gln Phe Lys Asn Thr Leu Ile Val Tyr Gln Ala Glu Arg

405 410 415

Lys Glu Arg Ser Asn Thr Gln Ser His Arg Met Glu Leu Leu Gln Gln

420 425 430

His Ile Ile Thr Phe Leu Ser Lys Asn Ile Met Ile Asn Ser Leu Leu

435 440 445

<210> 2

<211> 1263

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tttgaatgcg gtgtgccaca ttttaaaccc tacatatgga aatctggtcg aattgttggt 60

ggaactgacg tacgaccaca ctcacatcca tggcagattc aattgttaaa gtcagaaacg 120

ggaggctaca gcagcttgtg cggtggtagt cttgttcatt tcggtgaacc ctcaaatggt 180

actcgattcg tacttaccgc cgcgcactgc ataactacta gcaatatgta tccaagaacg 240

tcaagattta cagttgtgac cggtgcccac aacatcaaaa tgcatgaaaa agaaaaaaag 300

cgcataccaa ttacttccta ttatgttcag cactggaacc ctgtgatgac aacaaacgac 360

attgcgttgc ttcgcctggc agaaactgtt tattataata aatatactag gcctgtctgt 420

ttgccagaac caaatgaaga attgactcct ggagatattt gcgttgtcac cggatggggt 480

gatacgactg aaaatggaac tacttctaat actttgaagc aagttgatgt caaaattatg 540

aagaaaggaa cttgtgcaaa tgtgagaagt gaagttatta ctttttgcgc tggagctatg 600

gagggtggta aagacagttg tcaaggtgat tctggtggcc cactgatatg caagaaaaat 660

gggaaaagtg ttcaattcgg tgtcgttagt tatggtactg gatgcgccag aaaaggttat 720

cccggagtgt atgccaaagt tccatcatat gtcacatggt taaataaagc tgcaaaagaa 780

cttgaaaatt ctcctgaagg aactgtaaaa tgggcttcaa aagaagattc gccagtcgat 840

ttatctacta catcaagacc aactaaccca tatactgggt caagaccgac atctccatct 900

agtggatcaa gacccacata tccatctagt ggatcaagac caacatctcc atctagtgga 960

tcaagaccca catatccatc tagtgatcaa gaccaacatc tccatctagt ggatcaagac 1020

ccacatatcc atctagtgga tcaagaccaa catatccata tactggatca agacctactc 1080

ctcaaaagcc agtatttcca tcataccaaa aatatccgcc agcagttcaa aaatacattg 1140

atagtttacc aagcggaacg caaggaacgc tcgaatacac agtcacacag aatggagtta 1200

ctacaacaac atattatcac ttttctaagt aaaaatatta tgattaattc actactgctc 1260

tga 1263

<210> 3

<211> 340

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Met Leu Thr Ile Ile Thr Val Ile Leu Ile Ser Leu Gly Ser Ser

1 5 10 15

Trp Ala Gln Gly Val Ala Thr Cys Lys Ala Asp Asp Asn Thr Asp Leu

20 25 30

Asn Trp Tyr Phe Val Tyr Lys Pro Pro Asn Ala Leu Gln Thr Lys Ile

35 40 45

Met Gln Ser Gly Gln Asn Pro Ala Trp Ala Arg Ser Ala Gln Ser Ile

50 55 60

Glu Ser Asn Asn Gly His Ser Ile Val Arg Thr Met Ala His Phe Val

65 70 75 80

Ala Glu Asn Gln Asn Ile Lys Val Leu Ala Tyr Ser Asp Asp Pro Pro

85 90 95

Asn Leu Pro Pro Arg Asn Glu Lys Ser Lys Ala Lys Gly Val Leu Leu

100 105 110

Ile Asp Asn Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Trp Phe Val His Thr Val

115 120 125

Pro Lys Phe Leu Ser His Leu Gly Gly Tyr Ser Trp Pro Gln Thr Glu

130 135 140

Thr Ala Lys Gly His Ile Phe Leu Cys Leu Ser Ile Asn Glu Glu Ser

145 150 155 160

Leu Asn Ala Val Ala Lys Ala Ile Arg Tyr Gln Glu Pro Tyr Ile Tyr

165 170 175

Ala Ser Asn Leu Pro Pro Glu Leu Leu Asn Gln His Asn Glu Leu Ser

180 185 190

Asn Leu Ala Thr Gly Val Glu Ile Arg Ile Thr Pro Phe Leu Glu His

195 200 205

Thr Lys Leu Thr Thr Arg Asn Asn Gly Met Asn Val Gly Ala Phe Gly

210 215 220

Lys His Thr Lys Ser Tyr Ala Asp Met Tyr Glu Arg Val Leu Arg Lys

225 230 235 240

Lys Leu Ser Ala Arg Ile Lys Ile Trp Ala Pro Ser Asp Val Arg Ser

245 250 255

Lys Ser Ile Cys Lys Gly Gln Tyr His Leu Arg Lys Ile Ala Ser Pro

260 265 270

Ile Gln Leu Asp Gly Asp Gln Val His Arg Glu Ala Asp Ser Ala Lys

275 280 285

Trp Ala Leu Val Glu Gly Lys Asn Thr Val Cys Leu Thr Thr Asn Asp

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Tyr Lys Thr Thr Glu Lys Arg Ile Pro Gly Ala Ala Val Cys Val Glu

305 310 315 320

Asn Ala Asn Val Tyr Asn Ala Phe Asn Thr Ala Ala Val Asn Val Ala

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340

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aaacctccaa atgctttaca aacaaaaatt atgcagtcgg gacaaaatcc agcttgggca 120

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ccaccaagaa atgaaaaaag caaagccaaa ggagtacttt taattgataa ttcaggagct 300

aatgcagctg cgtggtttgt gcacacagtg cccaaatttt tatcacatct tggtggttat 360

tcttggccac aaacagaaac agcaaaagga cacatatttt tatgtttatc aatcaatgaa 420

gaatctttaa atgctgtagc taaagcaatt cgataccaag aaccatacat atatgcgagt 480

aatttacctc ctgaactttt gaatcaacat aatgaacttt cgaatttggc gacaggagtt 540

gagattcgca taacaccttt tctggagcat acaaaattaa caacaagaaa taatggcatg 600

aatgttggag cttttggaaa acacacaaaa tcatatgcag atatgtatga aagagttctg 660

agaaaaaaac tttctgcaag aatcaaaata tgggcacctt ctgatgtaag atcgaagtca 720

atttgtaagg gacaatacca tcttcgaaaa attgcttctc caatacagct tgatggtgat 780

caagtgcatc gtgaagctga cagtgcaaaa tgggcattag tggaaggaaa gaacacagta 840

tgtcttacaa caaatgatta taagactact gaaaaacgga ttccgggagc tgctgtttgt 900

gttgaaaatg ctaatgttta taacgctttc aatacagcag cagttaatgt tgcagcatgt 960

aatatgtaa 969