阅读说明：本技术 一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基及方法 (Culture medium and method for producing protease by fermenting euglena ) 是由 邱君志 严忠 陈慧 赵娟 薛青霖 谢勇啸 杨芳 陈宇熹 睢珺文 李丽 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基及方法,培养基中的原料按重量分数计：木糖0.3-2.4 wt.%、胰蛋白胨0.2-1.6 wt.%、硫酸锰0.034-0.27 wt.%、维生素B<Sub>1</Sub>0.0005-0.004 wt.%,初始pH值为7.4-8.6。发酵方法：将佩奇虫壳菌接种于PDB液体培养基中制成种子液；取10 mL种子培养液接种于发酵生产蛋白酶的培养基中,于150 r/min、25℃条件下培养。本发明的发酵方法发酵周期短；条件温和,易于控制；提供的用于佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基,具有蛋白酶产率高,蛋白酶活力高等优点。(The invention discloses a culture medium and a method for producing protease by fermentation of eupatorium cucumerinum, wherein raw materials in the culture medium comprise, by weight, 0.3-2.4 wt% of xylose, 0.2-1.6 wt% of tryptone, 0.034-0.27 wt% of manganese sulfate, 0.0005-0.004 wt% of vitamin B 1 0.0005, and the initial pH value is 7.4-8.6.)

一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基及方法

技术领域

本发明属于真菌的发酵培养领域，具体涉及一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基及方法。

背景技术

蛋白酶是通过分解肽键功能达到水解蛋白质的一类功能性酶。根据蛋白酶的作用模式和活性部位可将其分为8大类：天冬氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶及其他未知蛋白酶。

蛋白酶在真菌的生存和生命活动过程中具有重要作用，同时也是虫生真菌侵染寄主的重要毒力因子之一。在不同的病原性真菌中，蛋白酶作用也不同。宿主的黏附、定植和播散以及逃避宿主的免疫应答过程中有蛋白酶参与其中。

佩奇虫壳菌(Torrubiella petchii)属于虫草科(Cordycipitaceae)、虫壳属(Torrubiella)，其寄主为介壳虫或粉虱。迄今，中国对于佩奇虫壳菌的蛋白酶的功能性研究不多，我们采用佩奇虫壳菌，可以拓宽产蛋白酶的菌株资源。因此研究佩奇虫壳菌蛋白酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基及方法，发酵周期短；条件温和，易于控制；培养基具有蛋白酶产率高，蛋白酶活力高等优点。

本发明采取的技术方案如下：

一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的培养基，原料按重量分数计：木糖 0.3-2.4 wt.%、胰蛋白胨 0.2-1.6 wt.%、硫酸锰 0.034-0.27 wt.%、维生素B₁ 0.0005-0.004 wt.%，初始pH值为7.4-8.6。优选的，木糖6 g/L、胰蛋白胨16 g/L、硫酸锰2.7 g/L、维生素B₁ 0.01 g/L，初始 pH 值为7.8。

一种佩奇虫壳菌发酵生产蛋白酶的方法：将佩奇虫壳菌接种于PDB液体培养基中制成种子液；取10 mL种子培养液接种于发酵生产蛋白酶的培养基中，于150 r/min、25℃条件下培养。

本发明的有益效果在于：（1）方法：发酵周期短（只需要3天）；条件温和，易于控制；（2）培养基：具有蛋白酶产率高（提前2天达到最高酶活），蛋白酶活力高等优点。

附图说明

图1是不同碳源对佩奇虫壳菌蛋白酶活性的影响；

图2是不同氮源对佩奇虫壳菌产蛋白酶的影响；

图3是不同金属离子对佩奇虫壳菌蛋白酶活性的影响；

图4是不同pH对佩奇虫壳菌蛋白酶活性的影响；

图5是不同维生素对佩奇虫壳菌蛋白酶活性的影响；

图6是酪氨酸标准曲线。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1：单因素实验确定培养基最优成分

1）种子培养基配制：牛肉膏 10g，蛋白胨 5g，Na₂HPO₄ 4g，KH₂PO4 0.3g，CaCl₂ 1g，自然pH，121℃灭菌20 min。

2）发酵种子的制作：将佩奇虫壳菌接种于PDA固体平板培养基上，于25℃下培养1w，即活化；将活化后的菌株用灭菌后的小刀将菌块接种至种子培养基，25℃，转速150 r/min 下培养1 w，即为发酵液。

3）酶液的制备

取步骤2）的种子液10 mL接种于基础培养基中培养6 h，取发酵液在 4℃下，10000 r/min 离心 10 min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长 680 nm 处测定吸光值。

4）试剂的配制

佩奇虫壳菌：保存在***生物农药与化学生物学重点实验室。

福林试剂（Folin）：原液购自于北京索莱宝福林酚试剂，使用时加2倍水稀释，于4℃保存，以备后用。

0.4mol/L碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠（Na₂CO₃）42.4 g，用蒸馏水溶解定容至1000mL，常温储存，以备后用。

0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液：称取三氯乙酸6.54 g，用蒸馏水溶解后定容至100mL，室温保存。

pH 7.2 磷酸缓冲溶液：称取NaH₂PO₄·2H₂O 31.2 g，定容至1000 mL（A液）。称取Na₂HPO₄·12H₂O 71.63 g，定容至1000 mL（B液）。取A液28 mL和B液 72 mL，用蒸馏水稀释1倍，即成0.1 mol/L pH磷酸缓冲盐溶液。

2% 酪蛋白溶液：准确称取干酪素 2 g，加入0.1 mol/L NaOH 溶液 10 mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH 7.2 磷酸缓冲液定容至100 mL，冰箱内保存。

5）蛋白酶的酶活测定

在 1 mL 粗酶液（可适当稀释）中添加 1 mL 2%(w/v)酪蛋白溶液(不同pH值缓冲液配置)，37℃反应10 min后再加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，目的是终止反应继续进行，将混合液置于37℃水浴继续保温10 min，使残余蛋白质沉淀完全后离心，取1 mL上清液加入0.4mol/L的Na₂CO₃溶液5 mL和已稀释的福林试剂1 mL，将试管摇匀后，于37℃保温发色20 min后在680 nm处测定OD值，计算蛋白酶活力。同时另作一对照管，即取酶液1 mL先加入2 mL0.4 mol/L的三氯乙酸溶液，然后再加入2%酪蛋白溶液1 mL，37℃水浴10 min，放置10 min后过滤。取3只试管，编号，分别加入样品滤液、对照滤液和水各1 mL，然后各加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，混匀后再各加入福林试剂1 mL，立即混匀在37℃水浴20 min；以加水的一管作为空白，在A 680 nm 处测定对照及样品的光吸收值。由上述条件规定，1 mL酶液每分钟水解酪蛋白产生 1 µg 酪氨酸为 1 个酶活力单位(U)。

6）标准曲线的制作

按表1 配制各种不同的酪氨酸溶液。

表1 酪氨酸标准曲线

取6支试管，编号，按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1 mL，加入0.4 mol/L碳酸钠5 mL，再各加入已稀释的福林试剂1 mL。用混匀器充分混匀后，置37℃恒温水浴反应20 min。以1号管作参比，分别测定吸光度值。以酪氨酸浓度为横坐标，净吸光度值为纵坐标，绘制成标准曲线。

绘制成酪氨酸标准曲线：y = 0.005x，R² = 0.9907。从R²接近于1可知，该标准曲线可信(图6)。

7）蛋白酶单因素筛选结果

在基础发酵培养基中分别更换不同单因素的营养条件（不同碳源、氮源、维生素、金属离子等），接种相同的佩奇虫壳菌菌液，测定其蛋白酶活性，实验结果如图1-图5所示，木糖、胰蛋白胨、锰离子、维生素B₁ 和pH 8最适合该菌产蛋白酶，酶活分别约为32、38、120、27.5和33 U/mL。

实施例2：正交实验确定最优发酵条件

正交实验确定最佳培养基

1）从单因素实验确定培养基的基础上，改变各成分的溶度，配置不同的培养基，五因素四水平配制配方见表2，将相同量的接种量(10 mL)菌种接种于250 mL，装有100 mL培养液，在25℃，转速150 r/min下培养。然后测定酶活，选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘，实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例 1 的方法相同，正交实验结果如表3所示。

表2 正交试验设计方案

表3 正交试验结果

注 :Ij 是各因素水平为1时所有酶活力之和，Ⅱj 是各因素水平2时所有酶活力之和，Ⅲj为各因素水平是3时所有酶活力之和，Ⅳj是各因素水平4时所有酶活力之和，R为极差，平均酶活力是3次重复的平均值。

从5因素4水平的16个组合中显示最优组合为A₂B₄C₄D₂E₂，即最优产蛋白酶的培养基组成为木糖6 g/L、胰蛋白胨16 g/L、锰离子2.7 g/L和维生素B₁ 0.01 g/L以及pH 7.8，且结果与验证试验相符合。根据极差R可知，木糖、胰蛋白胨、锰离子和维生素B₁对的变化与佩奇虫壳菌产蛋白酶息息相关，其中胰蛋白胨含量的改变对产酶影响在5个因素非常显著，维生素B₁的变化对产酶影响最小。正交实验中的组合8(即A₂B₄C₃D₂E₁)酶活可达到148.667 U/mL；正交结果分析在此优化培养基(A₂B₄C₄D₂E₂)上酶活达到最大，验证试验表明其酶活为150.681 U/ml，较优化前高4.8倍。

该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。