阅读说明：本技术 一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法 (Freezing enrichment separation method for main stream smoke components in artificial saliva ) 是由 梁德民 费婷 毕艳玖 王亮 安彤 吴达 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及烟气成分的检测技术领域,具体涉及一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法。所述方法包括以下步骤：1)采集含有烟气成分的人工唾液；2)向所述步骤1)含有烟气成分的人工唾液中加入脂肪酸甲酯混标溶液、水和极性有机溶剂后得混合溶液；3)将步骤2)的混合溶液冷冻后析出有机相；4)采用气相色谱-质谱联用法对所述步骤3)中的有机相分离及检测。本发明与固相萃取方法相比,冷冻富集方法分析唾液中的主流烟气成分更完整。与传统液液萃取方法,冷冻富集方法避免了大量溶剂的使用导致烟气成分在浓缩过程中损失,且更有效地提取出唾液中的烟气成分。(The invention relates to the technical field of smoke component detection, in particular to a freezing enrichment separation method of mainstream smoke components in artificial saliva. The method comprises the following steps: 1) collecting artificial saliva containing smoke components; 2) adding a fatty acid methyl ester mixed standard solution, water and a polar organic solvent into the artificial saliva containing the smoke components in the step 1) to obtain a mixed solution; 3) freezing the mixed solution obtained in the step 2) to separate out an organic phase; 4) and (3) separating and detecting the organic phase in the step 3) by adopting a gas chromatography-mass spectrometry combined method. Compared with the solid phase extraction method, the method for analyzing the main stream smoke components in the saliva by the freezing enrichment method is more complete. Compared with the traditional liquid-liquid extraction method, the freezing enrichment method avoids the loss of smoke components in the concentration process caused by the use of a large amount of solvents, and more effectively extracts the smoke components in the saliva.)

一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法

技术领域

本发明涉及烟气成分的检测技术领域，具体涉及一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法。

背景技术

卷烟是使用最广泛的烟草制品，感官品质是其重要的商品属性。随着卷烟“降焦减害”工作的推行，卷烟在焦油量不断降低的同时，香气不足的问题凸显出来，感官香吃味受到很大影响，所以，中式烤烟香味补偿技术已成为烟草行业的重要研究内容和方向。目前烟气分析一般采用固定条件吸烟机抽吸卷烟再捕集烟气的方法，与吸烟者真实吸烟方式有较大不同，且吸烟机产生的主流烟气与吸烟者口腔中感受到的烟气成分差异较大，口腔仅保留很少部分的烟气成分，组成比例也发生很大变化。实际上，卷烟抽吸是主流烟气中的多种微量化学成分被口腔唾液选择性溶解吸收的过程，那些被吸收的烟气成分才是刺激抽吸者产生感官感受的物质。因而吸烟者唾液中的主流烟气成分与感官品质关系更为直接、重要和科学，而目前因为分离手段限制、唾液复杂性等因素，国内外关于唾液中主流烟气成分的研究较少。

人工唾液是一个含有大量水(99.4％)、微量无机盐与生物酶的弱酸性缓冲体系。本发明应用人工唾液作为烟气吸收液，避免因人的个体差异而导致捕集卷烟主流烟气成分及含量的差异性。由于唾液是一个含有大量水的体系，而主流烟气中的成分在唾液中的含量是极低的，使用常规液液萃取方式，需要大量的溶剂，且很难从唾液中提取出烟气的相关成分，并且需要经过转移、浓缩，操作复杂，导致浓度较低的烟气成分的损失以至于无法检出。因此建立一种人工唾液中主流烟气的简便有效的富集分离方法是十分必要的。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法。通过在唾液中加入一定量低凝固点的有机溶剂，经冷冻使水溶液结冰，其中的烟气化合物随着水变成冰的过程，溶解度降低，从而转移到液态的有机相中，达到富集目的。本发明具有操作简单，分离效果好的优点。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法，所述方法包括以下步骤：

1)采集含有烟气成分的人工唾液；

2)向所述步骤1)含有烟气成分的人工唾液中加入脂肪酸甲酯混标溶液、水和极性有机溶剂后得混合溶液；

3)将步骤2)的混合溶液冷冻后析出有机相；

4)采用气相色谱-质谱联用法对所述步骤3)中的有机相分离及检测。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤1)中采集含有烟气成分的人工唾液的方法包括通过吸烟单元进行卷烟抽吸，在卷烟夹持器和抽吸单元之间设置含有人工唾液的烟气捕集装置，所述烟气捕集装置吸收烟气获得含有烟气成分的人工唾液。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤2)中含有烟气成分的人工唾液、脂肪酸甲酯混标溶液、极性有机溶剂、水的体积比为40～60：1：10～30：40～60。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤2)中脂肪酸甲酯混标溶液选自戊酸甲酯、庚酸甲酯、壬酸甲酯、十一酸甲酯、十三酸甲酯中多种的混合溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤2)中极性有机溶剂包括正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷中的一种或多种的组合。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤2)中极性有机溶剂的凝固点为-120～-90℃。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤2)还包括对混合溶液涡旋，然后静置。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤3)中的冷冻温度小于-10℃，冷冻时间≥0.5h。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤4)中气相色谱-质谱联用法中气相色谱的条件包括如下特征的一项或多项：

A1)DB-FFAP毛细管柱，60m×320μm×0.25μm；

A2)进样量：1～2μL，不分流进样；

A3)进样口温度：240～260℃；

A4)载气：氦气，载气流速1.6～2.0mL/min；

A5)程序升温：初始温度40～45℃，保持4～8min，然后以4～6℃/min升温到220～230℃，保持8～10min。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤4)中气相色谱-质谱联用法中质谱的条件为：四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：8min；扫描范围：33～350amu。

附图说明

图1是使用人工唾液进行主流烟气中成分捕集的装置示意图。其中1为抽吸单元、2为剑桥滤片、3为安全瓶、4为捕集瓶a，5为捕集瓶b、6为人工唾液、7为卷烟夹持器。

图2是使用冷冻富集分离方法所得到的唾液主流烟气成分的气相色谱/质谱图。

图3是加入1mL去离子水与加入5mL去离子水得到的唾液主流烟气成分气相色谱/质谱对比图。

图4是使用冷冻富集分离方法且以正己烷作为萃取剂得到的唾液主流烟气成分的气相色谱/质谱图。

具体实施方式

下面详细说明根据本发明的基于化学标志物的卷烟包装密封性的评价方法。

本发明第一方面提供一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法，所述方法包括以下步骤：

1)采集含有烟气成分的人工唾液；

2)向所述步骤1)含有烟气成分的人工唾液中加入脂肪酸甲酯混标溶液、水和极性有机溶剂后得混合溶液；

3)将步骤2)的混合溶液冷冻后析出有机相；

4)采用气相色谱-质谱联用法对所述步骤3)中的有机相分离及检测。

本发明所提供的人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法中，所述步骤1)是采集含有烟气成分的人工唾液，其方法包括通过吸烟单元进行卷烟抽吸，在卷烟夹持器和抽吸单元之间设置含有人工唾液(按ISO TR10271规定配制)的烟气捕集装置，所述烟气捕集装置吸收烟气获得含有烟气成分的人工唾液。更具体地，采用图1的装置，通过抽吸单元抽吸烟气，每次抽吸20支卷烟，主流烟气进入盛放有人工唾液的烟气捕集装置中，所述烟气捕集装置例如可以是捕集瓶，两个捕集瓶的设置是为了让主流烟气成分能够充分被人工唾液吸收，并设置一个安全瓶，安全瓶的设置是防止倒吸发生。得到含有烟气成分的人工唾液的捕集液备后续分析用。

本发明所提供的人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法中，所述步骤2)中向所述步骤1)含有烟气成分的人工唾液中加入脂肪酸甲酯混标溶液、水和极性有机溶剂后得混合溶液。所述步骤2)为样品前处理，所述步骤2)中含有烟气成分的人工唾液、脂肪酸甲酯混标溶液、极性有机溶剂、水的体积比为40～60：1：10～30：40～60。作为一种优选的实施方式，所述含有烟气成分的人工唾液、脂肪酸甲酯混标溶液、极性有机溶剂、水的体积比为45～55：1：15～25：50～55，在上述范围内，各组分得以很好的混合。进一步对混合好的上述溶液涡旋，然后静置。

所述脂肪酸甲酯混标为烟气内标试剂，所述步骤2)中脂肪酸甲酯混标溶液选自戊酸甲酯、庚酸甲酯、壬酸甲酯、十一酸甲酯、十三酸甲酯中多种的混合溶液。作为一种优选的实施例，所述脂肪酸甲酯混标溶液选自戊酸甲酯、庚酸甲酯、壬酸甲酯、十一酸甲酯、十三酸甲酯的混合溶液。采用上述成分的内标试剂，可以有效的避免进样误差。

所述步骤2)中极性有机溶剂选自低凝固点的有机溶剂，所述极性有机溶剂的凝固点为-120～-90℃，在一些实施方式中，所述极性有机溶剂的凝固点可以为-120～-110℃，-110～-100℃，或-100～-90℃。具体地，所述极性有机溶剂选自但不限于正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷中的一种或多种的组合。作为一种优选的实施例，所述极性有机溶剂选自二氯甲烷。二氯甲烷作为萃取剂，与正己烷相比，检测到的主流烟气中的物质明显增多。

本发明所提供的人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法中，所述步骤3是将步骤2)的混合溶液冷冻后析出有机相；具体地，将混合溶液放入离心管中，并将此离心管直立放入冰箱，低温下冷冻后取出，吸取有机相。所述冷冻温度小于-10℃，冷冻时间≥0.5h，在一些优选的实施方式中，所述冷冻温度小于-15℃，冷冻时间≥1h。通过在人工唾液中加入一定量低凝固点的有机溶剂，经冷冻使水溶液结冰，其中的烟气化合物随着水变成冰的过程，溶解度降低，从而转移到液态的有机相中，达到富集目的。

本发明所提供的人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法中，所述步骤4)中采用气相色谱-质谱联用法对所述步骤3)中的有机相分离及检测。气相色谱-质谱联用法中气相色谱的条件的条件：所述色谱柱为DB-FFAP毛细管柱，60m×320μm×0.25μm；进样量为1～10μL，不分流进样，在一些实施方式中，进样量可以是1～2μL，2～3μL，3～4μL，4～5μL，5～6μL，6～7μL，7～8μL，8～9μL，或9～10μL，在一些优选的实施例中，所述进样量为1μL；进样口温度：200～260℃，具体地，进样温度可以是200～210℃，210～220℃，220～230℃，230～240℃，240～250℃，250～260℃，在一些优选的实施例中，进样口温度为250℃；载气：氦气，载气流速1.6～2.0mL/min，在一些优选的实施例中，载气流速为1.9mL/min；程序升温：初始温度40～45℃，保持2～10min，然后以3～8℃/min升温到220～230℃，保持8～20min，在一些优选的实施方式中，所述程序升温为初始温度40℃，保持6min，然后以5℃/min升温到230℃，保持10min。所述步骤4)中气相色谱-质谱联用法中质谱的条件为：四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：8min；扫描范围：33～350amu。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供的一种人工唾液中主流烟气成分的冷冻富集分离方法，唾液基质体系较为复杂，与固相萃取方法相比，冷冻富集方法分析唾液中的主流烟气成分更完整。与传统液液萃取方法，冷冻富集方法避免了大量溶剂的使用导致烟气成分在浓缩过程中损失，且更有效地提取出唾液中的烟气成分。

(2)本发明所建立的冷冻富集分离方法操作简单、分离度好，快速，重复性较好，响应值高，检测结果准确可靠，能够满足人工唾液中主流烟气成分的分析。

(3)本发明所建立的冷冻富集分离方法推广性好，可应用于吸烟者唾液中烟气成分的富集。

以下结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以***其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以***其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。

仪器与试剂：转盘式吸烟机、Agilent 7890B/5977B气质联用仪、人工唾液(按ISOTR10271规定配制)、内标试剂(脂肪酸甲酯混标包括戊酸甲酯、庚酸甲酯、壬酸甲酯、十一酸甲酯、十三酸甲酯的混合溶液)。

实施例1

1、样品前处理

用图1所示装置进行卷烟抽吸，收集捕集瓶中的人工唾液，将收集样品均匀混合后取5mL，加入烟气内标试剂(脂肪酸甲酯混标)溶液100μL及5mL去离子水，最后加入2mL二氯甲烷，涡旋分散2min后，倒置放入冰箱，于-40℃下冷冻0.5h后取出，迅速吸取有机相，进行气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析。

2、气相色谱-质谱联用法条件

GC条件：色谱柱为：DB-FFAP毛细管柱，60m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；载气：He，1.9mL/min；进样量：1.0μL。程序升温：初始温度40℃，保持6min，然后以5℃/min升温到230℃，保持10min。

MS条件：四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：8min；扫描范围：33～350amu。

3、数据结果

所得到的质谱图见图2。人工唾液样品中GC/MS烟气香味成分定性结果见表1。

表1人工唾液样品中GC/MS检测到的典型烟气香味成分

通过分析图2的质谱图，人工唾液捕集到的主流烟气成分与传统剑桥滤片捕集的烟气成分相比，种类数量有所减少，存在一定差异，但人工唾液捕集到的香味成分却是更直接反映与感官效应的烟气成分，通过研究人工唾液捕集到的烟气成分，对于探索卷烟感官品质更为直接与科学。

实施例2

1、样品前处理

用图1所示装置收集吸收瓶中的人工唾液，将收集样品均匀混合后取5mL，加入烟气内标试剂(脂肪酸甲酯混标)溶液100μL及1mL去离子水，最后加入2mL二氯甲烷，涡旋分散2min后，倒置放入冰箱，于-40℃下冷冻0.5h后取出，迅速吸取有机相，进行气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析。

2、气相色谱-质谱联用法条件

GC条件：色谱柱为：DB-FFAP毛细管柱，60m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；载气：He，1.9mL/min；进样量：1.0μL。程序升温：初始温度40℃，保持6min，然后以5℃/min升温到230℃，保持10min。

MS条件：四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：8min；扫描范围：33～350amu。

3.数据结果

所得到的化合物定性结果和表1的结果一致。由图3可知，加入1mL的去离子水与实施例1中加入5mL去离子水相比，质谱峰响应值明显降低，因此本发明选择加入5mL的去离子水更为合适。

实施例3

1、样品前处理

用图1所示装置收集吸收瓶中的人工唾液，将收集样品均匀混合后取5mL，加入烟气内标试剂(脂肪酸甲酯混标)溶液100μL及1mL去离子水，最后加入2mL正己烷，涡旋分散2min后，于-40℃下冷冻0.5h后取出，迅速吸取有机相，进行气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析。

2、气相色谱-质谱联用法条件

GC条件：色谱柱为：DB-FFAP毛细管柱，60m×320μm×0.25μm；进样口温度：250℃；载气：He，1.9mL/min；进样量：1.0μL。程序升温：初始温度40℃，保持6min，然后以5℃/min升温到230℃，保持10min。

MS条件：四级杆温度：150℃；离子源温度：230℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：8min；扫描范围：33～350amu。

3.数据结果

正己烷作为萃取剂时定性结果见表2，由表2可知，当加入是正己烷萃取溶剂的时候，与二氯甲烷作为萃取剂相比，检测到的主流烟气中的物质减少，且由图4可以看出质谱峰的响应值偏低，因而本发明选择二氯甲烷为有机萃取剂效果较正己烷好。

表2正己烷萃取人工唾液样品检测到的烟气香味成分

化合物编号	化合物名称	保留时间
			1	环戊酮	12.068
3	2-环戊烯酮	17.565
			4	2-甲基环戊烯酮	17.889
5	3-甲基环戊烯酮	22.112
			6	2,3-二甲基环戊烯酮	22.560
7	三醋酸甘油酯	34.059

本发明所建立的冷冻富集分离方法使用的实验耗材及有机溶剂量少，实验成本低且绿色环保；萃取得到的人工唾液中的烟气成分完整，能够真实代表人工唾液中主要的烟气化学成分，为进一步分析吸烟者真实唾液中的主流烟气成分提供了快捷、高效、可靠的前处理的方法。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。