发明内容

本发明所述的药物巴西苏木素具有良好的抑菌效果，但是对于鸡源耐药大肠杆菌的研究还比较少。

巴西苏木素和多黏菌素各自单独使用，治疗鸡源大肠杆菌，效果不佳。

本发明发现了巴西苏木素，在增效多黏菌素类抗生素抗鸡源大肠杆菌的新用途巴西苏木素联合多黏菌素使用时，可以显著增强多黏菌素的抗菌活性，逆转鸡源耐药大肠杆菌对多黏菌素的耐药性。其中巴西苏木素和多黏菌素的重量比例为 32-64∶1使效果显著。

为此，本发明提供一种巴西苏木素的应用，所述应用在于巴西苏木素在多黏菌素类抗生素抗鸡源大肠杆菌中具有协同增效作用。其中，其中巴西苏木素和多黏菌素的重量比例为32-64∶1。

所述巴西苏木素的应用在于，巴西苏木素具有增加多黏菌素类抗生素抗鸡源大肠杆菌的作用。其中巴西苏木素和多黏菌素的重量比例为32-64∶1时，两者具有协同作用。

本发明提供一种组合，其中包括巴西苏木素和多黏菌素。

本发明所述的组合中所述的多黏菌素为多黏菌素B和多黏菌素E。

本发明所述组合中，巴西苏木素和多黏菌素的重量比例为32-64∶1。

所述组合，包括巴西苏木素和多黏菌素混合在一起制成药物组合物，使用时同时应用，或者巴西苏木素和多黏菌素分别制成药物组合物，使用时联合使用。

所述巴西苏木素和多黏菌素混合在一起制成的药物组合物中，还可以包括其他成份。

所述巴西苏木素和多黏菌素分别制成药物组合物，使用时联合使用，还可以包括联合使用其他成份。

所述药物组合物，为药物制剂形式，选自口服制剂和非口服制剂，其中非口服制剂包括注射剂。

本发明通过试验发现，将巴西苏木素和多黏菌素按照32-64∶1的重量比例组成得到复方药物具有最佳的治疗效果，具有消除鸡源大肠杆菌耐药性的作用，并且该组合可以通过消除大肠杆菌的生物被膜从而有效抑制鸡源大肠杆菌的耐药性。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面通过具体实验数据进一步说明本发明的有益效果。以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果。标准菌株ATCC25922。

实验1：巴西苏木素和多黏菌素对鸡源大肠杆菌耐药性的作用效果观察

(1)实验物品

①实验菌株

本发明所用菌株为实验室分离的鸡源耐药大肠杆菌E.coliR-4和购自中国工业微生物菌种保藏中心。

②试验药物巴西苏木素CAS 474-07-7成都瑞芬思生物科技有限公司生产，含量：>98％。多黏菌素B 19000U/mg上海生工生物工程股份有限公司。

多黏菌素E 19000U/mg上海生工生物工程股份有限公司。

③药物配制巴西苏木素用无菌水溶解配制成5mg/mL的母液，4℃冰箱储存。多黏菌素：以少量的无菌水(100μL)溶解药物，再用水稀释配制终浓度为5120μg/mL药物储备液，用0.22μm滤膜过滤后分装到无菌2mL离心管中，-80℃保存

④培养基

LB肉汤培养基：青岛海博生物技术有限公司，按照使用说明书配置。

MH肉汤培养基：青岛海博生物技术有限公司按照说明书配置。

⑤仪器电动移液枪AUTOCLAVABLE：德国Eppendorf；

电子天平(ME203)梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

立式自动压力蒸汽灭菌器(GI80DS)：致微(厦门)仪器有限公司；

便携式细菌浊度计：上海昕瑞仪器仪表有限公司；

双人单面垂直超净工作台：苏州净化设备有限公司

⑥菌液制备

在经划线的麦康凯琼脂培养基上挑去单菌落，接种至5ml的LB肉汤培养基上，于37℃180rpm摇床中震荡培养，将细菌处于生长期后期，取该菌液至MH肉汤培养基中，使得菌液浓度至10⁵CFU/mL。在此菌悬液中加入一定剂量的多黏菌素，使其为所需浓度，备用。

(2)MIC的测定和判定

①参照CLSI规定的操作方法，使用二倍微量肉汤稀释法分别测定黏菌素和巴西苏木素对受试菌株的最小抑菌浓度(MICs)进行测定。取所需的使用96孔板、一次性培养皿、无菌培养基、无菌水等置于超净工作台中提前紫外杀菌 30min，杀菌后进行多黏菌素B和多黏菌素E母液的配制(现用现配)，用无菌水稀释多黏菌素的母液配制成(512μg/mL至0.06μg/mL浓度范围)。

②将无菌的MH液体培养基分装于96孔板的每个孔中，每孔50μL，将配置好的不同浓度抗生素每孔50μL加入，进行2倍稀释(从256～0.03μg/mL浓度范围)，最终使每个孔中含有不同浓度的多黏菌素，体积为100μL，每孔再补充100μL配制好的菌液(菌液量终浓度相当于5×10⁵CFU/mL)，将加好的96孔板微震荡混匀后，置于恒温培养箱(37℃)中静止培养18-24小时。

③观察微量肉汤稀释法测试多黏菌素对所使用菌株的的最小抑菌浓度：以每一行的孔中，肉眼可见的浑浊对应多黏菌素的2倍浓度来确认对改菌的最小抑菌浓度，若出现跳孔现象，则说明操作不当或污染问题，结果无效，所有的试验重复3 次。结果如表1和表2所示。

通过观察96孔板中培养物的透明度，根据表1可知，多黏菌素对E.coli R-4 的MIC值都为8μg/mL，对标准菌株的MIC值为0.25μg/mL。巴西苏木素对E.coli R-4的MIC值为256μg/mL，对标准菌株的MIC为512μg/mL

表1多黏菌素对受试菌株的最小抑菌浓度测试结果

表2巴西苏木素对受试菌株的最小抑菌浓度测试结果

实验2：棋盘法测定巴西苏木素联合多黏菌素FIC测定

(1)试验药物：多黏菌素E、巴西苏木素

(2)实验方法：

①从MH固体培养基上挑取单个菌落，置于含有2μg/mL的MH的液体培养基中，放入恒温培养箱，培养至对数生长期，用无菌的培养基对菌液进行稀释至菌液量 (1×10⁶/mLCFU/mL)作为备用菌液。

③取出无菌96孔板，第1列加入100μL A药，第2-10列加入50μL MH肉汤， 11列加入100μL MH肉汤和100μL菌液，12列加入200μL肉汤，从1列取出50μL在2～10列从左往右倍比稀释，从左每一行中的中药单体进行2倍稀释，第10孔弃掉50μL，加入1-6排在外面离心管中浓度梯度递减的的B 药，完成后每孔加入100μL不同的菌液，至每孔总体积为200μL。第7排为 100μL A药单药组加100μL菌液。第8排为100μL B药单药组加100μL菌液。由于巴西苏木素易氧化，故避光迅速溶解用96孔板测定，并和正常测定组比较效果差别，每种药物的试验重复三遍。

③棋盘法结果判读标准

分级抑菌浓度指数FIC值可以用来作为各类联合用药敏感菌试验的结果评价和疗效判断依据基础，其计算公式简述如下：

FIC指数用来判断两种抗菌药物的协同效应标准(Fractional inhibitoryconcentrations index，FICI)。

其中FICI≤0.5为协同作用；0.5≤FICI≤1为相加作用；1＜FICI≤2为无关作用；FICI＞2为拮抗作用。

实验2结果：

如表3，选择对应的96孔板无细菌生长孔统计药物用量，根据FIC计算公式，重复试验后得到没食子酸烷基酯盐与链霉素联合作用的FIC均值，见表3可知，巴西苏木素和多黏菌素联合使用时，受试菌株E.coli R-4的FIC值为0.31,，FIC 小于0.5，具有协同作用。标准菌株ATCC25922的FIC值为0.26，FIC小于0.5。菌株E.coli R-4的FIC＝64÷256+1÷8＝0.375

标准菌株ATCC25922的FIC＝4÷512+0.06÷0.25＝0.248

表3巴西苏木素联合多黏菌素对不同分离菌株的最小抑菌浓度

实验3：时间杀菌曲线实验

①将过夜培养的E.coli R-4、ATCC25922的菌液调整至5×l0⁷ CFUs/mL，备用。取无菌试管3组(1组：阳性对照组、2组：单独抗生素组、3组：抗生素和药物联用组)，每组标记为0、1、3、5、8h、12h所有试管内均加入l mL高压灭菌的LB液体培养基，每管内均加入10μL调整后的菌液，使每个试管内的菌液终浓度为5×10⁵CFUs/mL。

②对不同组进行不同处理后立即混匀，取出10μL的将阳性对照组菌液进行涂板，并用生理盐水进行10倍稀释至合适的浓度，作为0h的菌落数。之后各个时间点分别取10μL的菌液于LB琼脂板上，用高压灭菌并干燥后的玻璃珠在平板上均匀摇动，直至风干后取出，将各个时间段涂布的平板置于37℃恒温培养箱中，培养22～24h后，计算所长出的细菌个数，每个组设置3个平行对照，并重复三次，得出结果后，绘制时间-杀菌曲线。

③结果判读：

同一稀释度下3个重复的允许差值：

④实验结果：

由杀菌曲线结果可知，菌株R-4在空白对照组在1～7h内呈现对数生长趋势，7～12h到达生长平稳期。与空白对照组相比，在单独添加巴西苏木素64μg/mL和多黏菌素1μg/mL作用后，细菌在1～7h内的生长趋势略低于空白对照组，但是在7h后的这段时间细菌出现了复增长现象，滴板计数得，在1～12h期间，添加巴西苏木素的菌落数与空白组相比略降低约0.3×log CFU/mL，而添加多黏菌素单药的组别菌落数在1～6h内菌株的生长受到短暂的抑制，6h后又开始重新生长，12h时与空白对照结果基本一致。

在药物联合组来看，64μg/mL的巴西苏木素+1μg/mL多黏菌素的联合用药后，细菌量的生长受到抑制，并有小幅度的降低现象，与空白对照组相比，12h时菌液量降低了5.3×logCFU/mL左右,虽然没有完全将细菌杀死，但是可以看到，联合组的细菌生长一直受到抑制。

实验4巴西苏木素联合多黏菌素对鸡源大肠杆菌生物被膜的影响

(1)实验菌株受试菌株E.coli R-4、标准菌株ATCC25922

(2)药品：巴西苏木素、多黏菌素

(3)实验方法：扫描电镜测定对大肠杆菌菌体结构的影响

①将受试菌株E.coli R-4、标准质控菌株ATCC25922在LB平板上挑取单克隆后，各置于5mL的LB液体基中恒温过夜培养，随后，根据药物分组，加入LB液体培养基各5mL，调节至药物终浓度为(1组：多黏菌素单用组1μg/mL、2组：巴西苏木素单用组64μg/mL、3组：联合用药组：64μg/mL巴西苏木素+1μg/mL 多黏菌素4组：空白对照组)，摇床震荡培养至细菌的的生长对数期。

②各取出1mL菌液用1×PBS缓冲液4600r/min，5min离心，用移液枪吸取PBS 溶液缓慢反复漂洗三次，漂洗后，取10μL液体置于载玻片上，在超净台中自然风干后，加入5％的戊二醛进行固定，室温反应4h后，放入4℃冰箱静置12h 待用；

③用不同梯度的无水乙醇进行脱水：30％乙醇脱水15min、50％乙醇脱水15min、90％乙醇脱水15min、100％乙醇脱水20min。用滤纸吸取多余水分，自然风干。

④将处理完的样品喷金用扫描电镜进行观察。

(4)实验结果：

由扫描电镜图片我们可以观察到，与空白对照组(图A)进行比较，受试菌株E.coli R-4在单独使用1μg/mL多黏菌素时(图B)，药物对大肠杆菌的形态几乎没有任何改变和影响，在64μg/mL的巴西苏木素的存在下(图C)，受试菌株菌体的外壁有轻微结构的变化与受损，当64μg/mL的巴西苏木素联合1μg/mL多黏菌素使用时(图D)，细菌的细胞外壁开始崩解破裂，内容物外泄，形状不规则，说明单独使用药物对细菌的菌体结构影响不大，联合使用药物以后，两者通过改变细菌的菌体结构从而来抑制了细菌耐药性的产生。