具体实施方式

：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为2709(又名地衣芽胞杆菌CICC 10266)，可从中国工业微生物菌种保藏中心获取。

本发明实施例所用培养基如下：

LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，其余为水。

10×SP盐溶液(g/L)：K₂HPO₄ 91.7，KH₂PO₄ 30，(NH4)₂SO₄ 10，柠檬酸钠5，MgSO₄·7H₂O 10，其余为水。

SP I培养基：1×SP 97.6mL，5％酪蛋白水解物400μL，10％酵母汁1mL，50％葡萄糖1mL。(5％酪蛋白水解物：0.5g酸水解酪蛋白溶于10mL ddH₂O；10％酵母汁：1g酵母提取物溶于10mL ddH₂O；50％葡萄糖：5g葡萄糖溶于10mL ddH₂O)。

SP II培养基：SP I培养基99mL，100mM CaCl₂ 500μL，500mM MgCl₂ 500μL，其余为水。

LBS培养基(g/L)：山梨醇91.085，NaCl 10，酵母抽提物5，胰蛋白胨10，其余为水。

种子培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，其余为水；

发酵培养基：玉米粉64g/L，豆饼粉40g/L，磷酸氢二钠4g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，高温淀粉酶0.7g/L，其余为水。

上述培养基的固态培养基均添加2％琼脂。

以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1：野生型ASN编码基因asn的获得

1.野生型ASN编码基因asn来自实验室保存的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)TCCC 111005菌株，利用美国OMEGA公司的Bacterial DNA Kit提取基因组。

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取蜡样芽孢杆菌菌液，接种于LB固体培养基平板，三区划线，37℃恒温培养12h；

(2)转接：从培养菌体的平板上挑取边缘整齐、表面光滑的单菌落接种于5mL液体LB培养基中，220r/min、37℃条件下培养12h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于1.5mL EP管，12000r/min离心2min，弃上清；

(4)加入250μL ddH₂O重悬菌体，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴10min；

(5)加入100μL BTL Buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡；

(6)55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；

(7)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；

(8)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mL EP管；

(9)加入220μL BDL Buffer，振荡混匀，65℃水浴10min；

(10)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀；

(11)转移至吸附柱，静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(12)加入500μL HBC Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(13)加入700μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(14)加入500μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(15)12000rpm，空离2min，55℃金属浴10min，晾干；

(16)加入40μL ddH₂O洗脱基因组。

2.扩增野生型ASN编码基因asn

设计野生型ASN编码基因asn的扩增引物，序列如下：

上游引物P1：

CGCGGATCCTTGAAAAGAATCCTAGTTTTACACA(划线部分为BamHI酶切位点)下游引物P2：

AAGGAAAAAAGCGGCCGCATTATGCATAAACATGTTTTGGAT(划线部分为NotI酶切位点)

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

扩增程序的设置为：

a.预变性:98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃10s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到蜡样芽孢杆菌野生型ASN编码基因asn的条带，约1000bp(见图1)，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，通过酶切、连接构建重组质粒pET22b-asn，送测序公司进行测序，获得野生型asn基因序列(SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：ASN突变体Y55S/I203V和突变体H8R/Y55S/I203V的获得

1.易错PCR：以野生型编码基因asn为模板进行易错PCR，其反应体系如下：

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性:95℃5min；

b.变性：95℃30s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃90s；

e.b-d反应35个循环；

f.延伸:72℃10min。

PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行BamHI和NotI双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pBSA43进行连接，通过转化枯草芽孢杆菌WB600，涂布于含Kan(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。

3.筛选方法：采用奈斯勒试剂进行活性检测。天冬酰胺在L-天冬酰胺酶的作用下水解产生天冬氨酸和游离氨，结束后用三氯乙酸终止反应。生成的游离氨可与奈斯勒试剂络合生成淡红棕色化合物，它的最大光吸收波长是450nm。因此在一定范围内游离氨的生成量与反应液的颜色强度具有一定的比例关系，只要利用奈斯勒试剂进行比色测定出游离氨的生成量就可测定出L-天冬酰胺酶的酶活力。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选。

4.突变体文库的筛选：在96深孔板中每个孔中加入400μL含Kan(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96深孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96深孔板转移至摇床培养，160rpm，37℃培养48h。然后采用低温离心机(4℃)，4000rpm离心10min。将含有0.5mL反应液(25mML-天冬酰胺，50mMTris-HCl,pH 9.0)的96深孔板置于50℃水浴锅中预热，取100μL发酵上清加入96深孔板中，50℃反应10min后，加入100μL1.5M的三氯乙酸终止反应，将96深孔板在8000g离心5min，然后加入100μL奈斯勒试剂，室温放置3min，进行显色。取200μL上清于96孔板1中，用酶标仪在450nm处检测吸光度。

氯化铵标准曲线的绘制：分别吸取0、40、60、80、100、120、140、160、180和200μL的氯化铵标准溶液(10mM)于离心管中，再分别加入200、180、160、140、120、100、80、60、40和0μL的反应液(25mM L-天冬酰胺，50mM Tris-HCl,pH 9.0)，最后再在每个离心管中分别加入400μL的Tris-HCl缓冲液和100μL的TCA溶液。混匀后加入100μL奈斯勒试剂，室温放置3min，进行显色。取出200μL上清于96孔板中在450nm条件下以空白值为参比测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以其对应的氨/铵离子含量(μmol/L)为横坐标，即可以绘出标准曲线。

酶活定义：在一定条件下(如无特别说明，条件为50℃，pH9.0),每分钟内产生1μmol氨所需的酶量为1个酶活单位。

注：三氯乙酸(TCA)溶液(1.5M)：取12.3g三氯乙酸晶体溶于去离子水中，定容至50mL。放置在玻璃瓶中在室温下避光保存。

奈斯勒试剂：称取碘化汞钾7.0776g、氢氧化钾14.0275g，分别加去离子水溶解，静置到室温时混合在一起并定容到100mL。放置在塑料瓶中在室温下避光保存。

氯化铵标准溶液(10mM)：用分析天平称取0.0535g已干燥的氯化铵溶解于去离子水中，定容至100mL。

5.选取酶活力提高的突变体。根据板1的情况，计算每个突变体的酶活，选取相较于野生型酶活力提高的突变体，将含有该突变体的重组菌接入平板，并送出菌样进行测序。

经过上述步骤的易错PCR，选取出酶活力提高的突变体，测序后得到其中一个突变体含有两个氨基酸突变，即Y55S/I203V(TAT→TCT/ATT→GTT)，从而获得ASN突变体Y55S/I203V(SEQ ID NO.3)，及其编码基因asnm1(SEQ ID NO.4)，活力为野生型活力的1.6倍左右；测序后得到另一个突变体含有三个氨基酸突变，即H8R/Y55S/I203V(CAC→CGC/TAT→TCT/ATT→GTT)，从而获得ASN突变体H8R/Y55S/I203V(SEQ ID NO.5)，及其编码基因asnm2(SEQ ID NO.6)，活力为野生型活力的2倍左右。

实施例3：L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌重组菌株的构建

1.表达质粒pBSA43-asnm1和pBSA43-asnm2的提取

从上述筛选获得突变体Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V的菌株中提取质粒，即获得重组表达质粒pBSA43-asnm1和pBSA43-asnm2。

2.表达质粒pBSA43-asnm1和pBSA43-asnm2转化枯草芽孢杆菌WB600

(1)枯草芽孢杆菌WB600菌种活化，在无抗LB平板上三区划线，培养12h；

(2)挑取单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm培养12h；

(3)按2％的接种量，取100μL种子液接种于含有5mL SPI培养基的试管中，37℃，220rpm，培养3-4h至OD₆₀₀＝1.2；

(4)快速取200μL接种于2mL SPII培养基，37℃，100rpm，培养1.5h；

(5)加入20μL的10mM EGTA，37℃，100rpm，培养10min；

(6)分别加入1-2μL重组质粒pBSA43-asnm1和pBSA43-asnm2，37℃，100rpm，培养30min后，转速调至220rpm，继续培养1-2h；

(7)将菌液转移至已灭菌的1.5mL EP管中，5000rpm离心5min，弃上清，留50μL培养液重悬菌体，菌液涂布于含Kan的平板；

(8)挑转化子，提质粒、酶切验证(如图2、图3中1泳道所示)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-asnm1和WB600/pBSA43-asnm2。

实施例4：L-天冬酰胺酶解淀粉芽孢杆菌重组菌株的构建

(1)制备解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.11218感受态

①菌种活化，在无抗LB固体培养基上三区划线，37℃培养24h；

②挑单菌落接种于LBS培养基，37℃，220rpm，培养12h；

③以2％的接种量，将种子液接种于100mLLBS培养基中，37℃，220rpm，培养2-3h至OD₆₀₀＝0.4-0.6；

④用低温离心机(4℃),5000rpm，离心10min，弃上清；

⑤菌体用30mL洗涤缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)重悬，用低温离心机(4℃),5000rpm，离心10min，弃上清；

⑥重复步骤⑤，共洗涤3次；

⑦用10mL缓冲液重悬菌体(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，14％PEG6000)；

⑧分装感受态，每管100μL，-80℃保存备用。

(2)电转解淀粉芽孢杆菌

①75％酒精清洗电转杯；

②分别将10ng重组质粒pBSA43-asnm1和pBSA43-asnm2和100μL感受态混匀后转移至电转杯中，冰浴2min；

③2100-2500V，电击4-6ms后，立即加入1mL复苏液(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，220rpm复苏3h，涂布于含Kan抗性的平板；

④挑转化子，提质粒，酶切验证(如图2、图3中2泳道所示)，得到解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCCNo.11218/pBSA43-asnm1和CGMCCNo.11218/pBSA43-asnm2。

实施例5：L-天冬酰胺酶地衣芽孢杆菌重组菌株的构建

分别向预冷的1mL电转杯中加入60μL 2709感受态细胞和1μL(50ng/μL)pBSA43-asnm1和pBSA43-asnm2，混匀并冰浴5min，设置参数(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇)，混匀后吸取至1.5mLEP管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μL复苏物涂布在具有Kan抗性的LB平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证(如图2、图3中3泳道所示)，得到地衣芽孢杆菌重组菌株2709/pBSA43-asnm1和2709/pBSA43-asnm2。

实施例6：酶活力提高的L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达及制备

1.将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-asnm1和WB600/pBSA43-asnm2分别接种于含卡纳霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；

2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到酶活力提高的Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V粗酶液；

3.将收集到的发酵液上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。利用0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)溶解，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分上样至纤维素离子交换层析柱，用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0.1～1mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadexg25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，取纯化后酶液进行SDS-PAGE分析，结果如图4泳道1、2所示，获得大小约为35.3kDa的单一条带。纯化后的酶液，经冷冻干燥制得高活力Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V酶粉。

实施例7：酶活力提高的L-天冬酰胺酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达及制备

1.平板三区划线活化重组菌株CGMCCNo.11218/pBSA43-asnm1和CGMCCNo.11218/pBSA43-asnm2；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性种子培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、220r/min发酵培养48h。

4.12000rpm，离心10min，收集发酵上清，即得到ASN突变体Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V的粗酶液；

5.收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，并经过真空冷冻干燥制得高活力Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V酶粉。

实施例8：酶活力提高的L-天冬酰胺酶在地衣芽孢杆菌中的表达及制备

1.平板三区划线活化重组菌株2709/pBSA43-asnm1和2709/pBSA43-asnm2；

2.挑取单菌落接种于50mL含Kan的抗性种子培养基中，37℃，220r/min振荡培养12h；

3.以2％的接种量转接于含有卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃，220r/min发酵培养48h。

4.12000rpm，离心10min，收集发酵上清，即得到ASN突变体Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V的粗酶液；

5.然后收集发酵上清，采用实施例6的方法，使用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，获得洗脱后的酶液，并经过真空冷冻干燥制得高活力Y55S/I203V和H8R/Y55S/I203V酶粉。

实施例9：L-天冬酰胺酶活力测定

1.L-天冬酰胺酶酶活测定原理

奈斯勒试剂能够与以游离态形式存在的氨或铵离子发生反应，生成淡红棕色络合物，该络合物的吸光度与氨氮含量成正比，于波长450nm处测量吸光度即可定量氨氮量L-天冬酰胺酶。酶活的定义。

一个酶活性单位(U)定义为在一定条件下(如无特别说明，条件为50℃，pH9.0),每分钟内产生1μmol氨所需的酶量为1个酶活单位。

1.计算公式

酶活力U＝(A₁-A₀)×n×V₁/(K×V₂×T)

U：酶活力，U/ml；

A₁:实验组OD₄₅₀，酶+底物反应10min后，450nm处测得的OD；

A₀:空白组OD₄₅₀，灭活酶液+底物反应10min后，450nm处测得的OD；

n:酶液的稀释倍数；

K:氯化铵标准曲线的斜率值；

V1:反应体积，ml；

V2:酶液体积，ml；

T:反应时间，min；

2.本发明采用的L-天冬酰胺酶酶活测定方法与步骤

500μL反应液(25mM L-天冬酰胺，50mM Tris-HCl，pH 9.0)于50℃，pH9.0下保温1min，吸取100μL酶液加入其中，50℃反应10min后向反应体系中加入100μL TCA(1.5M)溶液来终止反应。8000g离心5min，然后加入100μL奈斯勒试剂，室温放置3min，进行显色。取200μL上清采用酶标仪在450nm检测OD值。样品均含有3组平行实验。

空白对照：100℃处理酶液10min使酶失活，使用热失活的酶液作为对照，反应体系及方法同上。

氯化铵标准曲线的绘制：分别吸取0、40、60、80、100、120、140、160、180和200μL的氯化铵标准溶液(10mM)于离心管中，再分别加入200、180、160、140、120、100、80、60、40和0μL的反应液(25mM L-天冬酰胺，50mM Tris-HCl,pH9.0)，最后再在每个离心管中分别加入400μL的Tris-HCl缓冲液和100μL的TCA溶液。8000g离心5min，然后加入100μL奈斯勒试剂，室温放置3min，进行显色。取200μL上清采用酶标仪在450nm检测OD值。样品均含有3组平行实验。以吸光度为纵坐标，以其对应的氨/铵离子含量(μmol/L)为横坐标，即可以绘出标准曲线。

注：三氯乙酸(TCA)溶液(1.5M)：取12.3g三氯乙酸晶体溶于去离子水中，定容至50mL。放置在玻璃瓶中在室温下避光保存。

奈斯勒试剂：称取碘化汞钾7.0776g、氢氧化钾14.0275g，分别加去离子水溶解，静置到室温时混合在一起并定容到100mL。放置在塑料瓶中在室温下避光保存。

氯化铵标准溶液(10mM)：用分析天平称取0.053g已干燥的氯化铵溶解于去离子水中，定容至100mL。

4.酶活测定结果如下表(以实施例6、7和8制备的Y55S/I203V粗酶液和H8R/Y55S/I203V粗酶液以及同样方法制备的野生型ASN粗酶液为测定对象)：

注：野生型ASN粗酶液的制备中，首先采用实施例3、4、5同样的方法构建野生酶重组菌株，之后采用实施例6、7、8同样的发酵方法制备野生酶粗酶液。

实施例10：酶学性质测定

以实施例6所采用枯草芽孢杆菌表达系统纯化后的酶活测定样品，及实施例9酶活测定方法，测定野生型ASN和突变体Y55S/I203V及突变体H8R/Y55S/I203V的酶学性质，结果如下，详见附图5-8：

(1)比活：野生型的比活为67.06U/mg，ASN突变体Y55S/I203V的比活为109.57U/mg，ASN突变体H8R/Y55S/I203V的比活为139.32U/mg。

(2)最适反应温度：均在50℃。

(3)温度稳定性：在pH 9.0条件下，分别于30、40和50℃水浴保温40min。在30和40℃保温40min后，ASN突变体Y55S/I203V和ASN突变体H8R/Y55S/I203V及野生型的残余活力均保持在90％以上；在50℃保温40min后，野生型的残余活力为37.8％，ASN突变体Y55S/I203V的残余活力为34.6％，ASN突变体H8R/Y55S/I203V的残余活力为41.6％。

(4)最适pH：均在9.0。

(5)pH稳定性：在4℃下，分别于pH 6.0、7.0、8.0的缓冲液中保温5d，野生型和ASN突变体Y55S/I203V及ASN突变体H8R/Y55S/I203V在pH 6.0、7.0、8.0条件下均保持较好的稳定性，ASN突变体Y55S/I203V的残余活力分别为98.6％、109.7％和114.3％，ASN突变体H8R/Y55S/I203V的残余活力分别为97.4％、106.3％、108.6％，而野生型的残余活力分别为100.96％、112.02％和112.42％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种天冬酰胺酶突变体及其基因、工程菌和制备方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 324

<212> PRT

<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TCCC 111005

<400> 1

Met Lys Arg Ile Leu Val Leu His Thr Gly Gly Thr Ile Ala Met Glu

1 5 10 15

Glu Asp Lys Glu Thr Gly Val Val Gln Pro Gly Glu Lys Asn Pro Leu

20 25 30

Leu Lys Phe Ile Pro Asp Leu Glu Gly Asp Val Asp Leu Ile Val Glu

35 40 45

Asp Val Phe His Leu Pro Tyr Pro His Met Thr Pro Ser Glu Met Leu

50 55 60

Gln Leu Gln Val Ile Ile Asp Glu Arg Val Lys Gln Asp Asn Ile His

65 70 75 80

Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu Thr Ala Tyr

85 90 95

Phe Leu Asp Leu Thr Val Gln Ala Thr Ile Pro Ile Val Val Thr Gly

100 105 110

Ala Met Arg Ser Ser Asn Glu Leu Gly Ala Asp Gly Leu Tyr Asn Phe

115 120 125

Leu Ser Ala Val Lys Val Ala Ser Ser Ser Glu Ala Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Leu Asn Asp Glu Ile His Cys Ala Thr Asn Val Thr

145 150 155 160

Lys Thr His Thr Ser Asn Val Ala Thr Phe Gln Ser Pro Gln Tyr Gly

165 170 175

Pro Ile Gly Met Val Thr Lys Arg Gly Val Val Phe His His Ala Leu

180 185 190

Val His His Glu Thr Tyr Ser Val Asn Lys Ile Ser Lys Asn Val Val

195 200 205

Val Leu Lys Ala Tyr Ala Gly Met Asp Asp Thr Leu Leu Ala Ala Ile

210 215 220

Glu Asn Leu Pro Val Asp Gly Ile Val Ile Glu Ala Leu Gly Gln Gly

225 230 235 240

Asn Leu Pro Pro Arg Thr Leu Pro Ser Leu Glu Arg Leu Ile Asn Lys

245 250 255

Gly Ile Pro Val Val Leu Val Ser Arg Cys Phe Asn Gly Ile Val Gln

260 265 270

Asp Val Tyr Ser Tyr Glu Gly Gly Gly Lys Gln Leu Lys Asp Met Gly

275 280 285

Ile Val Phe Thr Tyr Gly Leu Asn Ala Gln Lys Ala Arg Ile Lys Leu

290 295 300

Leu Val Ala Leu Glu Asn Thr Thr Ser His Glu Thr Ile Gln Asn Met

305 310 315 320

Phe Met His Asn

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）TCCC 111005

<400> 2

ttgaaaagaa tcctagtttt acacacaggt ggaacaattg caatggagga agataaagaa 60

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<210> 3

<211> 324

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<213> 人工序列

<400> 3

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