一种戈登分枝杆菌l-天冬酰胺酶的制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种戈登分枝杆菌l-天冬酰胺酶的制备方法与应用 (Preparation method and application of mycobacterium gordonii L-asparaginase ) 是由 吕凤霞 池慧兵 陆兆新 张充 别小妹 赵海珍 周立邦 陈美容 焦琳舒 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶的制备方法与应用。本发明公开的L-天冬酰胺酶基因来源于戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae),其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组L-天冬酰胺酶具有良好的催化活力、pH范围广泛、无谷氨酰胺酶活性,有效抑制了油炸食品中丙烯酰胺的生成,可从根源上控制含淀粉类食品高温加工中潜在致癌物质丙烯酰胺的产生,在食品加工领域具有广阔的应用潜能。(The invention relates to a preparation method and application of mycobacterium gordonii L-asparaginase. The L-asparaginase gene disclosed by the invention is derived from mycobacterium gordonii ( Mycobacterium gordonae ) The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO. 1. The recombinant L-asparaginase has good catalytic activity, wide pH range and no glutaminase activity, effectively inhibits the generation of acrylamide in fried food, can radically control the generation of the potential carcinogen acrylamide in high-temperature processing of starch-containing food, and has wide application in the field of food processingPotential energy.)
技术领域
本发明涉及一种戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶的制备方法与应用，属于生物技术领域。
背景技术
丙烯酰胺是一种化学物质，存在于高温烹饪的淀粉类食物中，如油炸、烘焙和超过120℃的烘烤。国际癌症研究机构已将丙烯酰胺列为潜在致癌物质。欧盟毒性、生态毒性和环境科学委员会还确定了其固有的毒性作用。炸薯片、炸薯条、饼干和面包中都有丙烯酰胺的检出，如何减少热加工食品中丙烯酰胺的产生量已成为相关食品加工领域的研究重点。
L-天冬酰胺酶（EC3.5.1.1，L-asparaginase）能够特异性催化L-天冬酰胺水解脱氨基生成L-天冬氨酸和氨，广泛存在于动物、植物和微生物中。在食品焙烤或油炸前加入L-天冬酰胺酶，可将丙烯酰胺的前体物质L-天冬酰胺水解为L-天冬氨酸，因而可有效减少丙烯酰胺的形成且对终产品的感官品质影响较小。
然而目前已报道的L-天冬酰胺酶还存在一些缺陷,如大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶作为白血病治疗药物时往往存在稳定性差和致敏性强的缺点；L-天冬酰胺酶作为食品添加剂使用时则存在催化效率低和热稳定性差等缺点，迄今仍然缺乏特性优良的适合于食品工业和白血病治疗应用的L-天冬酰胺酶产品。
发明内容
本发明的目的在于运用基因工程技术手段，实现了戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶在原核细胞中的高效表达，并将其应用于食品中，有效降低了食品中致癌物丙烯酰胺的含量。
本发明通过基因工程技术构建基因工程菌，获得了一种新型的重组L-天冬酰胺酶，实现了L-天冬酰胺酶的高效表达，从根源上控制含淀粉类食品高温加工中潜在致癌物质丙烯酰胺的产生，在食品加工领域具有潜在的应用价值。
本发明的技术方案如下：
一种戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶在抑制热加工淀粉类食品中丙烯酰胺产生中的应用，所述戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述的应用，所述戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶的制备方法包括以下步骤：
步骤1，构建戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶基因原核表达载体：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列导入表达载体中，然后转化入感受态细胞，涂布于Kana抗性平板，挑取阳性转化子测序；
步骤2，重组戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶的表达：重组菌接种于含有Kana的LB液体培养基中，培养过夜，制成种子液，然后转接到相应含抗生素的LB液体培养基中，37℃ 培养至OD值0.6-0.8之间，加入IPTG，诱导表达；
步骤3，对表达后的菌体破碎、收集酶液并纯化，得到戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶。
进一步的，所述的应用，步骤1中所述表达载体pET-30a、pET-32a或pET-28a中的任意一种。
进一步的，所述的应用，步骤1中所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞或枯草芽孢杆菌感受态细胞。
一种抑制热加工淀粉类食品中丙烯酰胺产生的添加剂，包括如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列所编码的戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶。
有益效果
1．本发明实现了戈登分枝杆菌来源的L-天冬酰胺酶基因在原核细胞中的表达，构建了新型高产L-天冬酰胺酶的基因工程菌株。
2．将重组L-天冬酰胺酶GmAsnase应用于油炸食品中，有效的抑制了油炸食品中丙烯酰胺的生成。
附图说明
图1 为重组L-天冬酰胺酶表达纯化蛋白电泳示意图；
M：蛋白marker 26610；1：戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶纯化后蛋白；
图2为重组L-天冬酰胺酶pH稳定性示意图；
图3 为经L-天冬酰胺酶处理前后油炸薯片丙烯酰胺液质检测图谱；
A：未经酶处理的薯片油炸后的丙烯酰胺提取物稀释后液质检测图谱；B：经酶处理的薯片油炸后的丙烯酰胺提取物稀释后液质检测图谱。
具体实施方式
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实施例 1
本实施例中针对戈登分枝杆菌L-天冬酰胺酶基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）进行重组L-天冬酰胺酶基因在大肠杆菌中的表达及纯化，具体步骤如下：
（1）表达载体构建：将质粒pET30a(+)-GmAsnase转化入感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于Kana抗性平板，挑取阳性转化子测序；
（2）重组L-天冬酰胺酶的表达：重组菌接种于含有50 μg/mL Kana的LB液体培养基中，37°C，180 rpm培养过夜，制成种子液，然后以1%的接种量转接到相应含抗生素的100 mLLB液体培养基中，37℃ 至OD值0.6-0.8之间，加入100μL的IPTG（100mg/mL），16℃过夜诱导表达；
（3）重组L-天冬酰胺酶的纯化：低温离心收集菌体，缓冲液悬浮菌体超声破碎，再次离心取上清得粗酶液。
由于在质粒构建时目标蛋白融合了组氨酸标签，可以采用Ni2+-NTA亲和柱纯化重组L-天冬酰胺酶。方法如下：
上样：样品终浓度调节至5 mM咪唑以增强吸附性，过膜处理；上样之前Ni2+-NTA亲和柱用10个柱体积5 mM咪唑缓冲液平衡；样品循环上样吸附3次；上样后先用5 mM咪唑缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白，再用50 mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白；
洗脱：杂蛋白洗脱后，用10倍介质体积150 mM咪唑缓冲液洗脱，收集流出液即得到纯化样品，透析除去咪唑，即得到纯化后蛋白。将纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳验证，如图1所示，在35kDa下方有单一蛋白条带，与理论值32.4kDa相符合。
实施例 2：重组L-天冬酰胺酶pH稳定性的研究
将酶液分别加入pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的50 mM缓冲液中，测定重组L-天冬酰胺酶的活力，以最高酶活为相对酶活100％。其中pH 4.0-6.0使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH7.0-9.0使用磷酸盐缓冲液，pH10.0使用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH10.0-11.0使用碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液，pH12.0使用碳酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。将100μL酶加入不同pH的400μL缓冲液中，4℃放置24 h，取100μL测酶活，计算处理前后的相对酶活，如图2所示，将酶液分别置于不同pH的缓冲液中，4℃放置24 h后，在pH6.0-11.0范围内仍保留80%以上的活性。
实施例3：L-天冬酰胺酶在食品中的应用
L-天冬酰胺酶在食品中的应用已经得到了现有很多实例的支持，本实施例以热加工淀粉类食品中的油炸薯片为例进行了应用试验，具体如下：
1、试验过程
（1）薯片制作：将土豆洗净削皮切成2 mm片状，用超纯水冲洗干净以土豆表面吸附的淀粉颗粒。将薯片浸泡于40 IU/mL的粗酶液中37℃ 浸泡0.5 h。放于烘箱中烘干，油炸后冷却至室温；
（2）样品中丙烯酰胺的分离纯化：捣碎样品并均质后称取10g于离心管中，加入50mL正己烷脱脂，涡旋震荡1min，以5000×g离心10min后弃去正己烷，脱脂三次，然后添加25mL乙腈、25mL超纯水、5gNaCl和20g硫酸镁，水浴超声处理30min，-70℃放置30min以上。样品以10000×g离心10min后收集乙腈层旋转蒸发，再以1mL超纯水复溶。过0.22 μm滤膜后液质测定其丙烯酰胺含量；
（3）丙烯酰胺的液质检测
色谱柱 Kinetex ® F5 100 Å(2.1×100 mm, 2.6 µm)；HPLC参数：流动相甲醇：水=10：90（V/V，等度洗脱）；流速0.25 mL/min；柱温40 ℃；进样量1 µL。MS参数：电喷雾电离源正离子模式（ESI+）；多重反应监测（MRM）；离子化电压5.5 kV；离子源温度550 °C；去簇电压70V；碰撞电压19V；检测离子：m/z 72.1，m/z 54.9。
2、L-天冬酰胺酶抑制油炸薯片中丙烯酰胺产生的效果
经重组L-天冬酰胺酶处理后，从液质检测峰面积可以看出油炸薯片中提取的丙烯酰胺的浓度，相较于处理前可降低65.09%（如图3所示），该酶可有效抑制油炸食品中丙烯酰胺的产生。