Fgf21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法
阅读说明：本技术 Fgf21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法 (FGF21 temperature-sensitive slow-release carrier, gene modification method and preparation method thereof ) 是由 张银河 厉丁玮 李佳新 朱秀珍 罗雅雯 金剑锋 于 2021-06-17 设计创作，主要内容包括：本发明涉及的一种FGF21温敏缓释载体,所述FGF21温敏缓释载体包括一FGF21蛋白和一水凝胶,所述FGF21的基因序列的偏嗜密码子替换稀有密码子,以达到在Cys75-Cys93间构建工程二硫键,所述水凝胶为肝素一泊洛沙姆；同时涉及FGF21基因修饰方法以及水凝胶制备方法。(The invention relates to an FGF21 temperature-sensitive slow-release carrier, wherein the FGF21 temperature-sensitive slow-release carrier comprises an FGF21 protein and a hydrogel, a bias codon of a gene sequence of FGF21 replaces a rare codon so as to construct an engineering disulfide bond between Cys75 and Cys93, and the hydrogel is heparin-poloxamer; also relates to an FGF21 gene modification method and a hydrogel preparation method.)
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及一种FGF21温敏缓释载体和载体构建方法以及其制备方法。
背景技术
糖尿病在我国已从少见病变变成流行病，近30年来中国人民糖尿病的患病率从平均0.67％飙升到11.6％，我国作为全世界糖尿病发病人数最高的国家，发病人数已经超过了一亿人之多，严重地危害人民的健康安全。糖尿病十分常见的一个临床并发症是存在持续性的慢性皮肤溃疡，例如糖尿病足。如果溃疡得不到有效的控制，会进一步加重病情的进展，会发生坏疽、截肢甚至死亡的风险，而足溃疡治愈后40％的患者在12个月内会复发。毫不夸张的说糖尿病足是糖尿病患者最常见、最严重、治疗费用最高的并发症，是致残、致死的主要原因之一，也是造成社会沉重负担的重大公共卫生问题。目前，针对于糖尿病足的治疗方法各式各样，包括控制糖尿病患者的血糖水平、使用抗感染的药物、降低糖尿病患者的血脂水平和皮肤移植等传统方法。可是，这些传统治疗方法存在着许多的缺点，比如对患者的护理劳神又费力，而且治疗成本也比较高，给患者带来严重的社会和经济负担，因而得不到令人满意的治疗效果。因此，寻求一种安全、方便和廉价的糖尿病伤口愈合的方法具有十分重要的医学价值。
成纤维细胞生长因子一21(Fibrob l ast growth factor—21,FGF21),是FGF超家族的新成员，是一种多效内分泌因子。根据文献查阅，FGF21在糖尿病创面治疗中发挥重要作用，能够有效地促进创面修复，降低血糖等。尽管FGF21不直接促进增值，但它有通过调节代谢来增加伤口修复的能力，如促进新生血管生成、肉芽组织增生以及胶原沉积等来间接地促进细胞和细胞基质的增殖。同时FGF21具有胰岛素的作用，可以增强机体对胰岛素的敏感性、降低血糖的同时又可以保护胰腺β细胞的功能，并且没有明显的副作用。此外，FGF21是FGF家族中唯一没有促进丝分裂活性的成员，并且不会引起致癌事件，可以安全地用于临床。
但是FGF21在体内外具有半衰期很短，稳定性较差且蛋白表达质量不高等缺点，在很大程度上制约了其在临床上的应用。另一方面，传统的FGF21通过单一聚合物的自组装的聚合物胶束通常面临着载药量低、稳定性差和生物利用度低等问题。
发明内容
本发明的一目的在于提供一种FGF21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法，所述FGF21温敏缓释载体得以通过调节代谢增加糖尿病足的创面伤口修复能力。
本发明的另一目的在于提供一种FGF21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法，其中所述FGF21的基因序列被特异性诱变修改，以在偏码的氨基酸序列中引入额外的二硫化物以提高稳定性。
本发明的另一目的在于提供一种FGF21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法，其中所述FGF21的基因序列的偏嗜密码子替换稀有密码子，以达到在Cys75-Cys93间构建工程二硫键。
本发明的另一目的在于提供一种FGF21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法，其中FGF21的氨基酸序列取代降低O-联糖基化的水平来改善蛋白质质量。
本发明的另一目的在于提供一种FGF21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法，其中所述FGF21温敏缓释载体中的一水凝胶是一种具有三维结构的亲水聚合物，所述水凝胶用于装载和递送一生长因子到损伤区域。
本发明的另一目的在于提供一种FGF21温敏缓释载体和基因修饰方法以及其制备方法，其中所述水凝胶为一肝素一泊洛沙姆，所述FGF21蛋白与所述肝素一泊洛沙姆结合形成一温敏性所述温敏缓释载体，以达到缓释作用。
为实现上述目的，本发明的一种FGF21温敏缓释载体包括一FGF21蛋白和一水凝胶。
在一个优选实施例中，所述FGF21的基因序列的偏嗜密码子替换稀有密码子，以达到在Cys75-Cys93间构建工程二硫键。
在一个优选实施例中，所述水凝胶为肝素一泊洛沙姆。
一种基因修饰方包括：
(a)基于结构建模评估的距离和方向限制，我们想要通过位点特异性诱变修改FGF21基因序列，以引入额外的二硫键；
(b)在Cys75-Cys93处构建工程二硫键，在不改变Cys的前提下，将三联密码子中的G和C改为A和T,以最佳偏嗜性密码子替换稀有密码子，在Cys75-Cys93间构建二硫键；
(b)将FGF21重组基因全长构建至CMV启动子的表达载体上，载体上携带His标签，我们以pcDNF3.1为载体；
(c)蛋白质提纯；以及
(d)FGF21蛋白浓度与纯度的检测。
在一个优选实施例中，所述步骤(c)进一步包括：(c.1)原核大肠杆菌表达和蛋白质提纯；所述步骤(c)进一步包括：(c.2)真核HEK293t细胞瞬时表达与蛋白质提纯。
在一个优选实施例中，所述步骤(b)进一步包括设计PCR引物：5'端引物包含克隆所需的酶切位点，以及包含起始密码子ATG的上游匹配序列，长度约26-30bp；3'端引物包含下游序列但不含终止密码子，引物在末端需加上HRV 3C Protease切割序列。
在一个优选实施例中，所述步骤还可以包括(e)FGF21稳定转染细胞株的建立。
在一个优选实施例中，找到对0-联糖基化的水平造成较大影响的三段氨基酸序列，在基因内引入EcoRI酶切位点和起始密码子ATG，用核酸内切酶切除相应的三段基因序列和信号肽基因，并用连接酶连接所述步骤所述步骤(f)FGF21蛋白的冻干保存。
找到对0-联糖基化的水平造成较大影响的三段氨基酸序列，在基因内引入EcoRI酶切位点和起始密码子ATG，用核酸内切酶切除相应的三段基因序列和信号肽基因，并用连接酶连接
一种水凝胶的制备方法包括：
(A)制备HP粉末；
(B)将冻干的HP粉末和新型FGF21冻干粉分别溶解在新鲜盐水(4C)中，得到170mg/mI的原始水凝胶溶液和所需的新型FGF21溶液；以及
(C)再将HP粉末和新型FGF21冻干粉两者混合，在4℃冰箱中保存过夜，制得溶液即为所述FGF21温敏缓释载体。
在一个优选实施例中，所述步骤(A)进一步包括：
(A.1)先用泊洛沙姆407与1.3mM氯甲酸4—硝基苯酯和二氨基乙烯反应，得到单胺封端的泊洛沙姆；
(A.2)在2—(N—吗啉)磺酸缓冲液中在25℃下将该中间体与肝素盐偶联1天；以及
(A.3)将反应温敏缓释载体透析3天并冻干，得到所述肝素一泊洛沙姆冻干粉末。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是根据本发明的一较佳实施例的FGF21与肝素泊洛沙姆(HP)的相互作用示意图。
图2是根据本发明的一较佳实施例的夹心冷法制作水凝胶流程图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，当部件被称为“固定于”或“设置于”另一个部件，它可以直接或者间接位于该另一个部件上。当一个部件被称为“连接于”另一个部件，它可以是直接或者间接连接至该另一个部件上。术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置为基于附图所示的方位或位置，仅是为了便于描述，不能理解为对本技术方案的限制。术语“第一”、“第二”仅用于便于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明技术特征的数量。“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
目前，FGF21对糖尿病足创面的修复发挥着显著的作用。故本项目组选择FGF21进行深入研究。细胞增殖和细胞基质形成对于皮肤伤口愈合过程是必需的，尽管FGF21不直接促进增殖，但它有通过调节代谢来增加伤口修复的能力，如促进新生血管生成、肉芽组织增生以及胶原沉积等来间接地促进细胞和细胞基质的增殖。同时FGF21具有类胰岛素的作用，可以增强机体对胰岛素的敏感性、降低血糖的同时又可以保护胰腺β细胞的功能，并且没有明显的副作用，如当用FGF21来降低血糖的时候不会引起水肿和低血糖。此外，FGF21是FGF家族中唯一没有促有丝分裂活性的成员，并且它不会引起致癌事件，可以安全地用于临床。
然而由于FGF21在体内外具有半衰期很短，稳定性较差且蛋白表达质量不高等缺点，在很大程度上制约了其在临床上的应用。
如图1到图2所示，本发明涉及一种FGF21温敏缓释载体，所述FGF2110的基因被优化修饰，通过点特异性诱变修改所述FGF2110基因序列，以在偏码的氨基酸序列中引入额外的工程二硫键即二硫化物稳定工程策略，以提高稳定性，同时通过去除特定氨基酸序列取代来降低0-联糖基化的水平来改善蛋白质质量。
本发明设计一种所述FGF2110基因修饰方法，所述方便包括：
(a)所述FGF2110重组蛋白的设计。基于结构建模评估的距离和方向限制，我们想要通过位点特异性诱变修改所述FGF2110基因序列，以引入额外的二硫键。通过文献查阅，其中Cys75—Cys93(75位的半胱氨酸和93位的半胱氨酸)处的工程二硫键稳定所述FGF2110C端结构域，能显著提高所述FGF2110的稳定性。所述FGF2110蛋白质表达质量与0—连接的糖基化水平密切相关。因此为了解决蛋白质质量问题，我们想对所述FGF2110进行进一步的改造，通过删减相关基因序列来去除相应的氨基酸序列以达到降低0—联糖基化的水平的目的。
(b)蛋白重组基因序列修饰。我们从GeneBank下载所述FGF2110蛋白氨基酸序列及碱基序列，应用基因工程技术，对原始所述FGF2110基因进行优化修饰。为在Cys75-Cys93处构建工程二硫键，我们在不改变Cys的前提下，将三联密码子中的G和C改为A和T,以最佳偏嗜性密码子替换稀有密码子，在Cys75-Cys93间构建二硫键。为提高所述FGF2110蛋白质表达质量，再次对所述FGF2110基因进行优化修饰，我们通过肽图鉴定并结合相关文献研究成果，找到对0一联糖基化的水平造成较大影响的三段氨基酸序列，接着在基因内直接引入EcoRI酶切位点和起始密码子ATG,使用相关核酸内切酶切除相应的三段基因序列和信号肽基因，并用相关连接酶连接，得到优化后的所述FGF2110基因。
(b)所述FGF2110表达载体的构建。将所述FGF2110重组基因全长构建至CMV启动子的表达载体上，载体上携带His标签，我们以pcDNF3.1为载体。设计PCR引物：5'端引物包含克隆所需的酶切位点，以及包含起始密码子ATG的上游匹配序列，长度约26-30bp；3'端引物包含下游序列但不含终止密码子，引物在末端需加上HRV 3C Protease切割序列。通过PCR扩增的方法，扩增FGF21重组基因，并纯化回收。鉴定上步回收所得的产物浓度，将1微克的产物进行酶切。酶切后再连接至pcDNA3。
(c)蛋白质提纯。所述步骤(c)进一步包括：(c.1)原核大肠杆菌表达和蛋白质提纯；所述步骤(c)进一步包括：(c.2)真核HEK293t细胞瞬时表达与蛋白质提纯。
(d)FGF21蛋白浓度与纯度的检测。
进一步地描述，上述步骤还可以包括(e)所述FGF2110稳定转染细胞株的建立；所述步骤(f)所述FGF2110蛋白的冻干保存。所述步骤(e)和所述步骤(f)根据所述FGF2110温敏缓释载体的制备和使用进行选取操作。
进一步地描述，所述步骤(b)进一步包括步骤(b.1)找到对0-联糖基化的水平造成较大影响的三段氨基酸序列，在基因内引入EcoRI酶切位点和起始密码子ATG，用核酸内切酶切除相应的三段基因序列和信号肽基因，并用连接酶连接。
如2图所示本发明的另一技术特征在于，所述FGF2110温敏缓释载体除改造所述FGF2110蛋白外，还需要使用理想的载体。水凝胶是一种具有三维结构的亲水性聚合物，其具有液体流动性和固体稳定性的特征能装载和递送生长因子(GFs)到损伤区域。对于传统敷料来说，其目的是覆盖皮肤缺陷，以保护它们免受二次伤害。而与传统敷料相比，水凝胶具有减轻疼痛、促进伤口愈合、改善伤口微环境和抑制细菌生长等许多的优点。因此，水凝胶可用于治疗擦伤、划痕和压疮等各种皮肤伤口相关疾病。
本发明的所述FGF2110温敏缓释载体包括一肝素-泊洛沙姆20,所述肝素-泊洛沙姆20是一种温度敏感的水凝胶胶束材料，其中，所述肝素-泊洛沙姆20常被用于修饰GFs以实现其组合活性的桥梁。简而言之，所述肝素-泊洛沙姆20是带负电荷的线性多糖，可以容易地与含有丰富正电荷的赖氨酸和精氨酸残基的GFs结构域结合。这样的肝素一GFs结合不仅有助于GFs的稳定，而且还增强GFs与细胞表面受体的结合亲和力，从而引发更多的细胞内信号传导途径。因此，以所述肝素-泊洛沙姆20为基础的水凝胶，将不同的生长因子和细胞因子通过所述肝素-泊洛沙姆20结合区结合以形成(多)功能复合物是最为有效的方式。且所述肝素-泊洛沙姆20可通过适当的配方提高溶解度和稳定性。所述肝素-泊洛沙姆20因其温敏性，在4℃环境下呈液态，这时候将其敷于患处，因其良好的流动性，可以完美覆盖伤口表面；在敷好后，所述肝素-泊洛沙姆20迅速达到体温37C，这时候所述肝素-泊洛沙姆20变为固态，紧紧覆盖在伤口表面，既可以隔绝细菌感染的可能性，又可以减少药物的流失。同时所述肝素-泊洛沙姆20可增强周围神经再生，而所述肝素-泊洛沙姆20结合的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)促进脊髓损伤后的再生和功能恢复。因此所述FGF2110以达到缓慢释放药物的目的，以此来延长药物的半衰期和提高药物的生物利用度，同时能够提高药物的稳性。
如2图所示，本发明同时涉及一种FGF21温敏缓释载体的制备方法，所述步骤包括：
(A)制备所述肝素-泊洛沙姆20粉末；
(B)将冻干的所述肝素-泊洛沙姆20和所述FGF2110冻干粉分别溶解在新鲜盐水(4C)中，得到170mg/mI的原始水凝胶溶液和所述FGF2110溶液；以及
(C)再将所述肝素-泊洛沙姆20粉末和新型FGF21冻干粉两者混合，在4℃冰箱中保存过夜，最后得到澄清溶液即为所述FGF21温敏缓释载体。
进一步地描述，所述步骤(A)进一步包括：
(A.1)先用泊洛沙姆40730与1.3mM氯甲酸4—硝基苯酯和二氨基乙烯40反应，得到单胺封端的泊洛沙姆；
(A.2)在2—(N—吗啉)磺酸缓冲液50中在25℃下将该中间体与肝素盐偶联1天；以及
(A.3)将反应温敏缓释载体透析3天并冻干，得到所述肝素-泊洛沙姆20冻干粉末。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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