GDF11在制备提高EPCs移植治疗缺血性疾病效率的药物中的应用
阅读说明：本技术 GDF11在制备提高EPCs移植治疗缺血性疾病效率的药物中的应用 (Application of GDF11 in preparation of medicine for improving efficiency of EPCs transplantation in treatment of ischemic diseases ) 是由 杨宝峰 潘振伟 刘东华 张洋 赵月 黄启贺 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了GDF11在制备提高EPCs移植治疗缺血性疾病效率的药物中的应用。本发明通过实验证明,在EPCs移植治疗缺血性疾病前利用GDF11在体外对EPCs进行处理,可以调节EPCs的溶酶体功能并提高其质量,从而提高其通过移植治疗缺血疾病(心肌梗死)效果。其中,优选的,所述的内皮祖细胞为衰老前期的内皮祖细胞。本发明的提出扩大了EPCs的使用范围,使得衰老前期的EPCs也能够用于移植并获得良好的治疗效果,也为EPCs移植治疗缺血性疾病提供了安全、有效的方法。(The invention discloses an application of GDF11 in preparing a medicament for improving the efficiency of EPCs transplantation for treating ischemic diseases. Experiments prove that the EPCs are treated in vitro by using the GDF11 before the EPCs are transplanted to treat ischemic diseases, so that the lysosome function of the EPCs can be adjusted and the quality of the EPCs can be improved, and the effect of treating the ischemic diseases (myocardial infarction) by transplanting the EPCs is improved. Preferably, the endothelial progenitor cells are endothelial progenitor cells in the pre-senescence stage. The invention enlarges the application range of the EPCs, enables the EPCs in the early stage of aging to be transplanted and obtain good treatment effect, and provides a safe and effective method for treating ischemic diseases by transplanting the EPCs.)
技术领域
本发明涉及一种提高EPCs移植治疗缺血性疾病效率的方法，特别涉及一种在EPCs移植治疗缺血性疾病前利用GDF11在体外进行处理，以此提高其治疗效果的方法。GDF11通过改善EPCs溶酶体功能增强自噬、改善异常的EPCs功能、从而提高其质量，因此这种方法不仅有效而且可靠。本发明属于医药技术领域。
背景技术
作为内皮细胞的前体细胞，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)强大的促进血管生成功能(体内和体外)使其在治疗缺血性疾病方面具有广阔的应用前景[1]。EPCs主要定居在骨髓，除此之外也存在于肝、脾、动脉血管及脂肪组织等多个外周组织[2,3]。骨髓是公认的用来治疗心血管疾病的干/祖细胞来源[4]。EPCs的作用机制：以心肌缺血损伤后EPCs被募集到受损部位为例，通过整合到新生成的血管上转分化成内皮细胞或分泌成血管因子促进新血管生成，除此之外也可以分化为其他细胞，如平滑肌细胞，在心肌缺血损伤后的血管修复和心肌功能恢复中发挥重要作用[5-8]。同时，临床研究表明，EPCs不仅有助于血管内皮的修复过程，与心血管健康也密切相关[9]。然而，EPCs在临床的应用还存在诸多挑战：衰老使骨髓内干、祖细胞分化异常[20]，而且衰老和冠心病等疾病也使体内EPCs数量和功能下降[10-13]，从年长的病人血液中分离的EPCs数量低、质量差[14]，这使得EPCs在临床治疗中的应用达不到预期的治疗效果。
生长分化因子GDF11是从“年轻血液”中分离出来的循环因子，在恢复多个器官的结构和功能方面发挥作用[15-18]，尤其在逆转衰老相关病理改变的功效已成为近年的研究热点[18,19]，但未见其提高衰老EPCs移植效果的报道。
自噬是细胞受到刺激后吞噬自身不需要的无用蛋白、衰老细胞器和病原菌，最终将吞噬物在溶酶体内降解的过程，亦称自噬-溶酶体通路(Autophagy and lysosomalpathway，ALP)[20,21]。自噬作为衰老干细胞中的“哨兵”[22]，防止衰老的细胞器进入细胞正常的生理活动系统，通过提高细胞器质量和稳态、提高胰岛素敏感性、维持干性和促进基因组稳定性来防止衰老[20,21,23]。通过增强自噬达到抗衰老目的的研究已成为目前新型抗衰老策略研究的热点：目前正在研究的新型抗衰老策略中，服用自噬增强剂增强自噬(Autophagy)有望在未来几年中成为抗衰老和延缓与年龄相关疾病的主流疗法之一，将在维持正常健康和延缓老年性神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)方面处于领先地位[24]。而通过调节溶酶体功能促进自噬是预防衰老或延缓衰老进程的可靠而且有效的途径[25]。
溶酶体作为ALP的终末降解站，已成为控制细胞生长、分裂和分化的复杂信号中心，在细胞内信号、代谢和质量控制方面处于核心位置[25]。底物在溶酶体内被降解后生成的脂肪酸和氨基酸可以被再利用，参与合成蛋白质和细胞的能量代谢，实现细胞内物质的再循环，对维持细胞内环境稳定、细胞内蛋白和细胞器质量控制，以及生物体对外界环境压力的适应具有重要意义[20]。然而，溶酶体功能随着年龄的增长而降低，由此导致年龄相关的自噬能力下降[20,26]，细胞内衰老或被损坏的细胞器，以及变性蛋白质进行性积聚[27]，最终使衰老得以继续或发展成衰老相关的疾病[20,26]，比如大多数神经退行性疾病的特点就是错误折叠蛋白在神经细胞内堆积[23]。溶酶体功能异常引起的ECs过早衰老可导致整体内皮功能异常[28]，但也可通过与EPCs溶酶体置换使其功能恢复正常[29]。目前，通过调节溶酶体功能促进自噬以此不断清除细胞内“废物”，而且由新合成物质替代，是保证细胞内环境稳态，预防衰老或延缓衰老进程的可靠而且有效的途径[30,31]。
参考文献：
1.Dauwe D,Pelacho B,Wibowo A,Walravens AS,Verdonck K,Gillijns H,Caluwe E,Pokreisz P,van Gastel N,Carmeliet G,Depypere M,etal.Neovascularization potential of blood outgrowth endothelial cells frompatients with stable ischemic heart failure is preserved.JAm HeartAssoc.2016；5(4):e002288.
2.Deb A.Cell-cell interaction in the heart via wnt/beta-cateninpathway after cardiac injury.Cardiovascular research.2014；102:214-223
3.Hu J,DongA,Fernandez-Ruiz V,Shan J,Kawa M,Martinez-Anso E,Prieto J,Qian C.Blockade of wnt signaling inhibits angiogenesis and tumor growth inhepatocellular carcinoma.Cancerresearch.2009；69:6951-6959
4.Rurali E,Bassetti B,Perrucci GL,Zanobini M,Malafronte C,Achilli F,Gambini E.Bm ageing:Implication for cell therapy with epcs.Mechanisms ofageing and development.2016
5.Tongers J,Roncalli JG,Losordo DW.Role of endothelial progenitorcells during ischemia-induced
vasculogenesis and collateral formation.Microvascular research.2010；79:200-206
6.Asahara T,Masuda H,Takahashi T,Kalka C,Pastore C,Silver M,Kearne M,Magner M,Isner JM.Bone marrow origin of endothelial progenitor cellsresponsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathologicalneovascularization.Circulation research.1999；85:221-228
7.Minhajat R,Nilasari D,Bakri S.The role of endothelial progenitorcell in cardiovascular disease risk factors.Acta medica Indonesiana.2015；47:340-347
8.Rosell A,Arai K,Lok J,He T,Guo S,Navarro M,Montaner J,Katusic ZS,LoEH.Interleukin-1beta augments angiogenic responses ofmurine endothelialprogenitor cells in vitro.Journal of cerebral blood flow and metabolism:official journal of the International Society ofCerebral Blood Flow andMetabolism.2009；29:933-943
9.Witkowski S,Lockard MM,Jenkins NT,Obisesan TO,Spangenburg EE,Hagberg JM.Relationship between circulating progenitor cells,vascularfunction and oxidative stress with long-term training and short-termdetraining in older men.Clinical science(London,England:1979).2010；118:303-311
10.Lahteenvuo J,Rosenzweig A.Effects of aging onangiogenesis.Circulation research.2012；110:1252-1264
11.Roncalli JG,Tongers J,Renault MA,Losordo DW.Endothelial progenitorcells in regenerative medicine and cancer:A decade of research.TrendsBiotechnol.2008；26:276-283
12.Kawamoto A,Gwon HC,Iwaguro H,Yamaguchi JI,Uchida S,Masuda H,SilverM,Ma H,Kearney M,Isner JM,Asahara T.Therapeutic potential of ex vivo expandedendothelial progenitor cells for myocardial ischemia.Circulation.2001；103:634-637
13.Zampetaki A,Kirton JP,Xu Q.Vascular repair by endothelialprogenitor cells.Cardiovascular research.2008；78:413-421
14.Peng X,Luo Z,Kang Q,Deng D,Wang Q,Peng H,Wang S,Wei Z.Foxq1mediates the crosstalk between tgf-beta and wnt signaling pathways in theprogression ofcolorectal cancer.Cancer biology&therapy.2015；16:1099-1109
15.Loffredo FS,Steinhauser ML,Jay SM,Gannon J,Pancoast JR,YalamanchiP,Sinha M,Dall'Osso C,Khong D,Shadrach JL,Miller CM,Singer BS,Stewart A,Psychogios N,Gerszten RE,Hartigan AJ,Kim MJ,Serwold T,Wagers AJ,Lee RT.Growthdifferentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-relatedcardiac hypertrophy.Cell.2013；153:828-839
16.Hall SS.Young blood.Science(New York,N.Y.).2014；345:1234-1237
17.Katsimpardi L,Litterman NK,Schein PA,Miller CM,Loffredo FS,Wojtkiewicz GR,Chen JW,Lee RT,Wagers AJ,Rubin LL.Vascular and neurogenicrejuvenation ofthe aging mouse brain by young systemic factors.Science(NewYork,N.Y.).2014；344:630-634
18.Castellano JM,Kirby ED,Wyss-Coray T.Blood-borne revitalization ofthe agedbrain.JAMAneurology.2015；72:1191-1194
19.Camici GG,Savarese G,Akhmedov A,Luscher TF.Molecular mechanism ofendothelial and vascular aging:Implications for cardiovasculardisease.European heartjournal.2015；36:3392-3403
20.Yanagawa M,Tsukuba T,Nishioku T,Okamoto Y,Okamoto K,Takii R,TeradaY,Nakayama KI,Kadowaki T,Yamamoto K.Cathepsin e deficiency induces a novelform of lysosomal storage disorder showing the accumulation of lysosomalmembrane sialoglycoproteins and the elevation of lysosomal ph inmacrophages.The Journal ofbiological chemistry.2007；282:1851-1862
21.Revuelta M,Matheu A.Autophagy in stem cell aging.Aging cell.2017；16:912-915
22.Zenner HL,Collinson LM,Michaux G,Cutler DF.High-pressure freezingprovides insights into weibel-palade body biogenesis.Journal of cellscience.2007；120:2117-2125
23.van Dijk KD,Persichetti E,Chiasserini D,Eusebi P,Beccari T,Calabresi P,Berendse HW,Parnetti L,van de Berg WD.Changes in endolysosomalenzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with parkinson'sdisease.Movement disorders:officialjournal ofthe Movement DisorderSociety.2013；28:747-754
24.Rigato M,Avogaro A,Fadini GP.Levels of circulating progenitorcells,cardiovascular outcomes and death:A meta-analysis of prospectiveobservational studies.Circulation research.2016；118:1930-1939
25.Tsukuba T,Yanagawa M,Kadowaki T,Takii R,Okamoto Y,Sakai E,OkamotoK,Yamamoto K.Cathepsin e deficiency impairs autophagic proteolysis inmacrophages.PloS one.2013；8:e82415
26.He C,Wei Y,Sun K,Li B,Dong X,Zou Z,Liu Y,Kinch LN,Khan S,Sinha S,Xavier RJ,Grishin NV,Xiao G,Eskelinen EL,Scherer PE,Whistler JL,LevineB.Beclin 2functions in autophagy,degradation of g protein-coupled receptors,and metabolism.Cell.2013；154:1085-1099
27.Reines B,Cheng LI,Matzinger P.Unexpected regeneration in middle-aged mice.Rejuvenation research.2009；12:45-52
28.Verma I,Syngle A,Krishan P.Predictors of endothelial dysfunctionand atherosclerosis in rheumatoid arthritis in indian population.Indian heartjournal.2017；69:200-206
29.Lenting PJ,Casari C,Christophe OD,Denis CV.Von willebrand factor:The old,the new and the unknown.Journal of thrombosis and haemostasis:JTH.2012；10:2428-2437
30.Liu X,Rothe K,Yen R,Fruhstorfer C,Maetzig T,Chen M,Forrest DL,Humphries RK,Jiang X.A novel ahi-1-bcr-abl-dnm2 complex regulates leukemicproperties of primitive cml cells through enhanced cellular endocytosis andros-mediated autophagy.Leukemia.2017
31.Levine B,Kroemer G.Autophagy in aging,disease and death:The trueidentity ofa cell death impostor.Cell death and differentiation.2009；16:1-2
发明内容
本发明的目的在于提供GDF11在制备提高EPCs移植治疗缺血性疾病效率的药物中的应用。本发明利用GDF11调节EPCs溶酶体功能提高其质量从而提高其移植治疗缺血疾病(心肌梗死)的效果。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
首先，本发明分离了中年小鼠(7～8M)骨髓来源的内皮祖细胞(Bone Marrowderived Endothelial Progenitor Cells from MiddleAge mice,BMEPCs-MA)，然后在体外对BMEPCs-MA的功能进行了分析，并将其移植至心肌梗死小鼠体内，以此明确了中年小鼠来源的EPCs修复受损心肌功能能力显著降低；最后，在体外利用GDF11处理BMEPCs-MA后再将其移植入缺血性疾病(小鼠心肌梗死)模型中，结果证明此种方法可以显著提高受损心肌心功能。而且研究发现，GDF11是通过自噬-溶酶体通路增强EPCs自噬力从而提高了EPCs移植治疗缺血疾病(心肌梗死)的效果，本发明为GDF11的使用安全性提供了有力证据。
在上述研究的基础上，本发明提出了生长分化因子GDF11在制备提高内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植治疗缺血性疾病效率的药物中的应用。
其中，优选的，所述的缺血性疾病包括心肌梗死。
其中，优选的，所述的内皮祖细胞为衰老前期的内皮祖细胞。
其中，优选的，所述的内皮祖细胞为衰老前期的骨髓来源的内皮祖细胞(BoneMarrow derived Endothelial Progenitor Cells，BMEPCs)。
其中，优选的，所述的药物通过与内皮祖细胞共同孵育来达到提高内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病效率的目的。
其中，优选的，所述的药物与内皮祖细胞共同孵育的时间为48h。
其中，优选的，所述的药物与内皮祖细胞共同孵育时，其中生长分化因子GDF11的浓度为50-100ng/ml。
其中，优选的，所述的药物与内皮祖细胞共同孵育时，其中生长分化因子GDF11的浓度为80ng/ml。
其中，优选的，所述的药物是通过自噬-溶酶体通路增强内皮祖细胞的自噬力从而提高了内皮祖细胞移植治疗缺血疾病的效果。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
第一、本发明的研究对象是中年鼠(7～9月退役种鼠)，处于衰老的早期阶段，本发明扩大了GDF11的应用群体范围，使得衰老前期的EPCs也能够用于移植并获得良好的治疗效果，也为EPCs移植治疗缺血性疾病提供了安全、有效的方法。
第二、本发明发现GDF11在衰老早期通过促进溶酶体功能使自噬流顺畅逆转异常的EPCs功能，为GDF11应用的安全性提供有力证据。
第三、本发明发现GDF11处理后EPCs修复受损心肌心功能力显著提高，提高了EPCs移植治疗缺血性疾病的效果。
附图说明
图1为本发明整体设计示意图；
图2为GDF11对EPCs-MA功能影响的实验设计图；
图3为GDF11对EPCs-MA迁移功能的影响；
其中：(A)图为迁移小室法检测EPCs迁移能力(结晶紫染色)(200×)；(B)图为显示EPCs-Y及EPCs-MA在GDF11处理前后迁移能力变化的柱形图；(C)图为显示EPCs-MA在不同浓度的GDF11处理48hrs后迁移能力变化的柱形图(*P<0.05，**P<0.01)；
图4为GDF11对EPCs-MA修复缺氧损伤后心肌组织功能的影响；
其中：(A)图为EPCs移植治疗心肌梗死后14天的心脏M-型超声心动图；(B)柱形图显示心肌梗死后小鼠在BMEPCs移植前后左室射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)n＝5～7/组(*P<0.05，**P<0.01，t检验)；
图5为GDF11对EPCs-MA修复缺氧损伤后心肌组织功能的影响；
其中：(A)图为患有心肌梗死小鼠心脏在4％福尔马林固定后从心底向心尖横切心肌组织环，石蜡包埋红框内的梗死周边区进行组织学切片；(B)上方为梗死区切片的马桑染色(40×)，纤维组织被染成蓝色，测量蓝色区域占心室环的比率(梗死面积比)；下方为柱形图显示梗死心肌面积所占的比率(*P<0.05，**P<0.01)。
图6为GDF11对EPCs-MA自噬通量相关蛋白表达的影响；
其中：(A)上方图为Western-Blot检测p62和LC3表达，下方图为EPCs的抗-p62的免疫细胞化学染色(DAB显色)；(B)左侧柱形图显示LC3I/II转换比率，右侧图显示表示p62蛋白表达量的蛋白条带的平均灰度值(*P<0.05，**P<0.01)。
图7为GDF11对EPCs-MA溶酶体pH值的影响；
其中：(A)图为在50nm溶酶体红色荧光探针中孵育30分钟后，荧光探针在EPCs中被检测为红色荧光信号，标尺长度为50微米；(B)柱形图显示EPCs中能够聚集酸性细胞器的细胞百分比(*P<0.05，**P<0.01)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
(一)GDF11提高了中年小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(Bone Marrow derivedEndothelial Progenitor Cells from MiddleAge mice,BMEPCs-MA)的迁移功能，并且对缺血引起的小鼠心功能损伤的治疗作用显著增强
图2为GDF11对EPCs-MA功能影响的实验设计图，图为原代培养BMEPCs-MAD8时进行GDF11处理，处理48hrs后收集细胞进行体外体内功能分析。对于体内功能分析，我们在小鼠心肌梗死1hr内经尾静脉注射移植BMEPCs-MA，14D后检测其心功能，并对梗死周边区心肌组织进行马桑染色，检测组织内纤维成分及梗死面积测定，以此评价GDF11处理过的BMEPCs-MA是否在改善心肌梗死小鼠心功能方面起作用。
以下的所有结果中，未经GDF11处理的BMEPCs-MA为阴性对照，年轻小鼠(4W)来源的BMEPCs(BMEPCs-Y)为阳性对照。
1.BMEPCs-MA进行了GDF11处理之后，利用Transwell小室法检测GDF11对BMEPCs-MA迁移能力的影响。
EPCs是成体后主要居住在骨髓、由多个细胞亚群组成的细胞。在组织因血管损伤或堵塞发生缺氧时，被动员入血，然后迁移归巢到损伤部位，对机体和器官损伤后的血管进行修复。此过程与EPCs的迁移能力密切相关。在研究中我们发现BMEPCs-MA在体外的迁移功能减弱，GDF11使EPCs-MA功能恢复至接近BMEPCs-Y水平(如图3A,B所示)。同时，我们也发现GDF11的作用不是随着浓度的增加而增加(如图3C所示)。
2.GDF11使BMEPCs-MA对梗死后心肌的功能恢复起促进作用
心肌缺血损伤后EPCs被募集到受损部位，通过整合到新生成的血管上转分化成内皮细胞或分泌成血管因子促进新血管生成，除此之外也可以分化为其他细胞，如平滑肌细胞，在心肌缺血损伤后的血管修复和心肌功能恢复中发挥重要作用。我们利用GDF11处理过的BMEPCs-MA移植治疗心肌梗死小鼠，通过观察其对因缺氧损伤引起的心功能下降是否有改善作用，并检测其是否使心肌梗死面积减小。
(1)GDF11使BMEPCs-MA对梗死后心肌功能恢复起到积极促进作用
经小鼠尾静脉将BMEPCs-MA移植至心肌梗死(Myocardial infaction,MI)小鼠后，反应左心室收缩时的射血功能左室射血分数(EF)和反应心肌的收缩功能的左室短轴缩短率(FS)，与移植BMEPCs-Y的小鼠相比均显著降低，而移植了GDF11处理过的BMEPCs-MA的小鼠心脏EF和FS两项指标均显著提高(如图4所示)，提示心脏功能显著改善。
(2)GDF11使BMEPCs-MA对梗死后心肌组织纤维化程度减弱
心肌纤维化是心肌梗死后心肌的一种自我修复过程，心肌组织中以胶原纤维为主的细胞外基质在MI区域过度沉积，胶原容积比例异常增加。它会造成心室重塑，以此导致心功能下降，甚至诱发心力衰竭、或心源性猝死。因此，改善MI患者预后的关键就是预防和逆转心肌纤维化。
因此，我们利用石蜡包埋技术，将梗死周边区的心肌组织制成组织切片后进行了马桑染色，显示心肌组织中的纤维组织成分，以此明确BMEPCs-MA是否在减少MI后心肌组织纤维化方面功能降低，以及GDF11是否可以通过促进BMEPCs-MA功能减少MI后心肌组织纤维化，减小梗死面积。
我们发现，BMEPCs-MA移植后的MI小鼠心肌组织纤维化程度与MI后不做任何治疗干预的小鼠心肌组织相似，与移植BMEPCs-Y的MI小鼠心肌组织相比，心肌纤维化程度显著增高，而且梗死面积较大。而在GDF11处理后的BMEPCs-MA在移植到MI小鼠后，显著降低MI后的心肌组织纤维化和心肌梗死面积(如图5所示)。
(二)GDF11对BMEPCs-MA内自噬-溶酶体通路的影响
1.BMEPCs-MA自噬力下降，GDF11使其恢复至BMEPCs-Y水平
“自噬通量(Autophagic flux)”常常被用来阐释自噬体合成、转运自噬底物到溶酶体、自噬底物在溶酶体内降解的动态过程、标记自噬力(Autophagic activity)强弱。LC3和P62的表达是监测自噬通量是否通畅的经典标记，LC3-I向LC3-II转化是自噬体合成的重要步骤，P62通过与LC3-II直接结合被选择性地并入自噬体而被自噬有效地降解。我们利用Western-Blot和免疫细胞化学技术检测了自噬相关蛋白的表达水平。
我们发现与EPCs-Y相比，EPCs-MA的LC3I/LC3II比值升高(LC3I转换程度低)，p62蛋白在细胞质中沉积，提示自噬体流不畅，GDF11处理使LC3I/LC3II比值降低(LC3I转换程度高)，p62蛋白在细胞质中沉积减少(如图6所示)。
2.EPCs-MA溶酶体pH升高，GDF11使其恢复至EPCs-Y水平
溶酶体作为ALP的终末降解站，已成为控制细胞生长、分裂和分化的复杂信号中心，在细胞内信号、代谢和质量控制方面处于核心位置。溶酶体功能随着年龄的增长而降低是导致年龄相关的自噬能力下降的主要因素之一。因此，我们接下来利用溶酶体红色荧光探针检测了监测溶酶体功能状态的溶酶体腔内的pH值。
我们发现EPCs-MA与EPCs-Y相比聚集酸性细胞器明显减少，溶酶体pH升高，GDF11处理能够显著提高酸性细胞器的聚集，降低溶酶体腔内的pH值(如图7所示)。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种氯前列醇钠注射液及其制备方法