薄荷清新茶指纹图谱的检测方法
阅读说明：本技术 薄荷清新茶指纹图谱的检测方法 (Method for detecting fingerprint of mint refreshing tea ) 是由 金俊杰 李国维 刘爱国 于 2021-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了薄荷清新茶指纹图谱的检测方法,它包括步骤1、薄荷清新茶供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图；步骤4,薄荷清新茶指纹图谱仪器导出,导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统,选择不同批次薄荷清新茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成薄荷清新茶的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；将薄荷清新茶指纹图谱和混合标准品图谱进行比对,指认主要成分峰。本发明所提供的薄荷清新茶指纹图谱,能全面,客观地表征薄荷清新茶的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。(The invention discloses a method for detecting fingerprint of mint refreshing tea, which comprises the following steps of 1, preparing a test solution of the mint refreshing tea; step 2, preparation of a mixed reference solution: step 3, respectively and precisely sucking the mixed reference solution and the test solution to be injected into a liquid chromatograph, and recording a chromatogram; step 4, guiding out the fingerprint instrument of the mint fresh tea, guiding the fingerprint instrument into a traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system, and selecting chromatographic peaks existing in the chromatograms of different batches of mint fresh tea as common peaks; generating a comparison fingerprint of the mint fresh tea by using an average value calculation method; calculating the relative retention time and the relative peak area of each common peak; comparing the fingerprint of the mint fresh tea with the fingerprint of the mixed standard substance, and identifying the peak of the main component. The fingerprint spectrum of the mint refreshing tea provided by the invention can comprehensively and objectively represent the quality of the mint refreshing tea. And the detection method has the advantages of simple and stable method, high precision, good reproducibility and the like.)
技术领域
本发明涉及一种中药代用茶的检测方法，具体涉及薄荷清新茶指纹图谱的检测方法。
背景技术
中药代用茶是中医治病调理、强身益寿的特殊中药剂型，在医疗保健事业中发挥了重大作用。中药代用茶可据病情需要辩证组方、随症加减，并按药物的性能特点等选择恰当的使用方法，程序简单，调配方便，针对性强，既保持了中医汤剂辩证论治加减灵活、疗效显著的特色，又克服了传统汤剂煎煮烦琐、携带不便等缺点，与现代生活节奏加快的发展趋势相适应。中药代用茶便于储存，易于携带，可随时多次饮用，且吸收完全，故可备特殊情况或某些急症时用，具有良好的辅助治疗作用。从药物性质来看，中药代用茶所用之药药性平和，无伤胃之虞，且味多甘淡，或为微苦微寒之品，既有除疾调理之功，又无味苦难咽之弊，对小儿患者尤为适宜。中药代用茶用量轻，宜频服，且药性平和，无损胃气，故可长期坚持服用，缓图其效，以和脏腑，尤其适于慢性病的治疗及对机体机能的调整。
从中医的角度，薄荷清新茶以清热泻火、疏肝理气为目的，以清热泻火药材为主，辅以凉血、化浊、补脾益气药物配伍来行气补气。薄荷发汗解热、疏肝理气、利咽止痛、止痒；金银花清热解毒、疏散风热、凉血止痢；菊花散风清热、平肝明目、清热解毒；山楂消食健胃，行气散瘀，化浊降脂；罗汉果清热润肺，利咽开音、滋肾润肺，补脾益气；淡竹叶清热泻火、除烦，利尿；实验表明，日常饮用具有很好的清热泻火，行气散瘀，滋肾润肺等功效。
目前关于薄荷清新茶的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立薄荷清新茶的指纹图谱检测方法，为薄荷清新茶的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种薄荷清新茶的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价薄荷清新茶的质量，对控制薄荷清新茶的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，薄荷清新茶供试品溶液的制备：
分别精密称取不同批次的薄荷清新茶样品，打粉，置于圆底瓶中，加甲醇溶液，回流提取，过滤，滤液置于容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定绿原酸、木犀草苷、槲皮素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；
步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的薄荷清新茶供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择不同批次薄荷清新茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成薄荷清新茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
步骤5，将步骤3中获得的薄荷清新茶指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出薄荷清新茶中1号峰为绿原酸、2号峰为木犀草苷、7号峰为槲皮素。
作为优选方案，以上所述的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，步骤1薄荷清新茶供试品溶液制备方法为：取8批次的薄荷清新茶样品粉末5g置100mL圆底瓶中，加甲醇溶液50mL，超声提取30min，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定绿原酸、木犀草苷、槲皮素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1001mg/mL木犀草苷、0.0529mg/ml槲皮素组成的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：Purospher STAR LP RP-18 endcapped，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：245nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
程序
时间（min）
乙腈体积（%）
1
0
5
2
10
10
3
20
12
4
30
13
5
54
19
6
99
22
7
105
30
8
125
50
作为优选方案，以上所述的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰7个。
指纹图谱检测条件的优化：
1、在样品溶液的制备优化方面
本发明通过对不同提取方法（超声、回流、渗漉等）及不同提取溶剂（甲醇、水、50%乙醇水溶液、70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇）进行实验比较，结果发现超声提取所得的谱图差成分比较全面，提取效率高，分离度良好，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高，所以选用甲醇进行提取。
2、在色谱条件进行优化方面
本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取205nm、225nm、245nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为245nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选245nm为检测波长；
本发明对流速（1mL/min、0.9mL/min、0.8mL/min、0.6mL/min）进行筛选，因薄荷清新茶中的成分在1mL/min的流速下峰形较好且分离效果较好，最终选择在流速为1.0mL/min梯度条件。
本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，乙腈和0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1%磷酸水为流动相时，薄荷清新茶中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.1%磷酸水为流动相。
在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0~10min 乙腈体积5%~10%；10~20min 乙腈体积10%~12%；20~130min 乙腈体积12%~13%；30~54min 乙腈体积13%~19%；54~99min 乙腈体积19%~22%；99~105min 乙腈体积22%~30%；105~125min 乙腈体积30%~50%；时可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。
本发明所述的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，薄荷清新茶的药味组成和配比为：薄荷4~8份、金银花2~4份、菊花2~4份、山楂5~10份、罗汉果5~10份、淡竹叶2~4份。
作为优选方案，以上所述的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，其特征在于，薄荷清新茶的药味组成和配比为：薄荷4份、 金银花2份、 菊花2份、 山楂5份、 罗汉果5份、 淡竹叶2份。
有益效果：
1、本发明根据薄荷清新茶中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明。
2、本发明提供的薄荷清新茶指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价薄荷清新茶的质量，为保证薄荷清新茶疗效具有重要意义。
3、用本发明所提供的方法所建立的薄荷清新茶指纹图谱，能有效地表征薄荷清新茶的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定薄荷清新茶质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
4、本发明提供的薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为本发明混合对照品的色谱图。
图2为本发明的薄荷清新茶样品的对照指纹图谱。
图3为本发明薄荷清新茶样品的8批次供试品指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例用到的仪器与试剂如下：
实验器材
1.1仪器
日本岛津公司全波段扫描（200-800nm）高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），BP121S电子分析天平（SARTORIUS）。
1.2药品与试剂
薄荷清新茶样品来自江苏海昇药业有限公司；绿原酸对照品（批号110753-201314）购自中国食品药品生物制品鉴定所；木犀草苷对照品（批号111720-201609）购自中国药品生物制品检定所；槲皮素对照品100081-201610（批号）购自中国药品生物制品检定所；甲醇（分析纯）；磷酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）。
实施例1 一种薄荷清新茶指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，薄荷清新茶供试品溶液的制备：
取8批次的薄荷清新茶样品20g（薄荷4g、 金银花2g、 菊花2g、 山楂5g、 罗汉果5g、淡竹叶2g）打粉后置1000mL圆底瓶中，加甲醇溶液400mL，超声提取30min，过滤，取滤液置于500mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
取精密称定绿原酸、木犀草苷、槲皮素对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1001mg/mL木犀草苷、0.0529mg/ml槲皮素组成的混合对照品溶液。
步骤3，分别精密吸取8批薄荷清新茶供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：Purospher STAR LP RP-18 endcapped，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：245nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
程序
时间（min）
乙腈体积（%）
1
0
5
2
10
10
3
20
12
4
30
13
5
54
19
6
99
22
7
105
30
8
125
50
步骤4，将步骤3中获得的8批薄荷清新茶供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择8批次薄荷清新茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次薄荷清新茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品薄荷清新茶中有7个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。绿原酸保留时间为20.464min，木犀草苷保留时间为53.76min；槲皮素保留时间为105.092min。
步骤5，步骤3中获得的薄荷清新茶指纹图谱和混合标准品图谱（图1）进行比对，指认主要成分，对比出薄荷清新茶中1、2、7号色谱峰分别为：绿原酸（保留时间20.464min）、木犀草苷（保留时间53.76min）、槲皮素（保留时间105.092min）。
同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算获得江苏海昇药业厂家的8批薄荷清新茶中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的薄荷清新茶中药建立的指纹图谱能够很好的检测江苏海昇药业多批次薄荷清新茶的质量，结果如表1。
表1各批次样品与共有模式间的相似度
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
R
S1
1
0.905
0.926
0.935
0.908
0.944
0.927
0.911
0.935
S2
0.905
1
0.957
0.903
0.921
0.902
0.905
0.906
0.922
S3
0.926
0.957
1
0.941
0.963
0.944
0.911
0.975
0.923
S4
0.935
0.903
0.941
1
0.922
0.989
0.999
0.901
0.917
S5
0.908
0.921
0.963
0.922
1
0.942
0.939
0.925
0.966
S6
0.944
0.902
0.944
0.989
0.942
1
0.92
0.949
0.948
S7
0.927
0.905
0.911
0.999
0.939
0.92
1
0.907
0.911
S8
0.911
0.906
0.975
0.901
0.925
0.949
0.907
1
0.952
R
0.935
0.922
0.923
0.917
0.945
0.948
0.911
0.952
1
实施例2指纹图谱检测的方法学研究
1、方法学考察
1.1精密度考察
取薄荷清新茶样品20g（薄荷4g、 金银花2g、 菊花2g、 山楂5g、 罗汉果5g、淡竹叶2g），按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中7个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.2%，共有峰峰面积RSD均小于2.4%，说明仪器精密度较好。
1.2稳定性考察
取薄荷清新茶样品20g（薄荷4g、 金银花2g、 菊花2g、 山楂5g、 罗汉果5g、淡竹叶2g），按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录色谱图，对色谱图中7个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.7%，共有峰峰面积RSD均小于2.1%，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
1.3重复性考察
取薄荷清新茶样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中7个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.0%，共有峰峰面积RSD均小于2.9%，说明该方法重复性良好。
以上实验结果表明，本发明提供的薄荷清新茶指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价薄荷清新茶的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
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