荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法
阅读说明：本技术 荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法 (Method for detecting fingerprint spectrum of light lotus leaf tea ) 是由 金俊杰 李国维 刘爱国 于 2021-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法,它包括步骤1、荷叶清轻茶供试品溶液的制备；步骤2、混合对照品溶液的制备：步骤3、分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪,记录色谱图；步骤4,荷叶清轻茶指纹图谱仪器导出,导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统,选择不同批次荷叶清轻茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成荷叶清轻茶的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积；将荷叶清轻茶指纹图谱和混合标准品图谱进行比对,指认主要成分峰。本发明所提供的荷叶清轻茶指纹图谱,能全面,客观地表征荷叶清轻茶的质量。且检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。(The invention discloses a method for detecting a fingerprint of light lotus leaf tea, which comprises the following steps of 1, preparing a test solution of the light lotus leaf tea; step 2, preparation of a mixed reference solution: step 3, respectively and precisely sucking the mixed reference solution and the test solution to be injected into a liquid chromatograph, and recording a chromatogram; step 4, guiding out a fingerprint instrument of the light lotus leaf clear tea, guiding the fingerprint instrument into a traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system, and selecting chromatographic peaks existing in chromatograms of different batches of light lotus leaf clear tea as common peaks; generating a comparison fingerprint of the light lotus leaf tea by using an average value calculation method; calculating the relative retention time and the relative peak area of each common peak; and comparing the fingerprint spectrum of the light lotus leaf tea with the spectrum of the mixed standard substance, and identifying the peak of the main component. The fingerprint spectrum of the light lotus leaf tea provided by the invention can comprehensively and objectively represent the quality of the light lotus leaf tea. And the detection method has the advantages of simple and stable method, high precision, good reproducibility and the like.)
技术领域
本发明涉及一种中药代用茶的检测方法，具体涉及荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，生活方式的改变，肥胖人群明显增加。肥胖是以体内脂肪积聚过多为主要特征的一种全球广泛流行的独立性慢性疾病。它不仅影响人的外在形象美，而且肥胖与许多慢性疾病如：糖尿病、高血压、心脑血管等密切相关。荷叶清轻茶将药食同源药材的独特口感和食疗功能浓缩于茶包之中，让饮食作息不规律的人，也能够通过给自己泡上一杯功能代用茶，润肠清脂，生活健康。
从中医的角度，荷叶清轻茶以清热和清脂为目的，采取的方法则为去水和发汗，以清热泻火药材为主，辅以化湿、行气消积药物配伍来润肠清脂。荷叶具有清热解暑、升发清阳、凉血止血之功效，具有调脂减肥、抗氧化抗衰老、抑菌作用；决明子清肝明目，润肠通便；山楂能健脾、化湿、消暑，有温中行气，消食之功；桑叶疏散风热，清肺润燥，平肝明目，凉血止血；莱菔子消食除胀，降气化痰；火麻仁用于血虚津亏，肠燥便秘，有润肠通便之效；日常饮用具有清热泻火，润肠通便，降火气，补肝益肾，消肿利尿，养肝明目等功效。
目前，关于荷叶清轻茶的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立荷叶清轻茶的指纹图谱检测方法，为荷叶清轻茶的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种荷叶清轻茶的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价荷叶清轻茶的质量，对控制荷叶清轻茶的质量和保证临床疗效具有重要意义。
技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，其包括以下步骤：
步骤1，荷叶清轻茶供试品溶液的制备：
分别精密称取不同批次的荷叶清轻茶样品，打粉，置于圆底瓶中，加甲醇溶液，回流提取，过滤，滤液置于容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
精密称定绿原酸、大黄酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；
步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
步骤4，将步骤3中获得的荷叶清轻茶供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择不同批次荷叶清轻茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成荷叶清轻茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；
步骤5，将步骤3中获得的荷叶清轻茶指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出荷叶清轻茶中1号峰为绿原酸、13号峰为大黄酚。
作为优选方案，以上所述的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，步骤1荷叶清轻茶供试品溶液制备方法为：取8批次的荷叶清轻茶样品粉末5～50g置100～1000mL圆底瓶中，加甲醇溶液50～500mL，超声提取30～60min，过滤，滤液置于100～500mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。
作为优选方案，以上所述的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定绿原酸、大黄酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1048mg/mL大黄酚组成的混合对照品溶液。
作为优选方案，以上所述的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：Purospher STAR LP RP-18endcapped，流动相：乙腈和0.1％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：245nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
程序
时间(min)
乙腈体积(％)
1
0
5
2
10
5
3
18
13
4
118
23
5
125
35
6
190
100
作为优选方案，以上所述的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰13个。
所述的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，荷叶清轻茶的药味组成和配比为：荷叶8～16份、决明子7～14份、山楂7～14份、桑叶4～87份、莱菔子5～10份火麻仁4～8份、桑椹5～10份。
作为优选方案，以上所述的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，荷叶清轻茶的药味组成和配比为：荷叶8份、决明子7份、山楂7份、桑叶4份、莱菔子5份、火麻仁4份、桑椹5份。
指纹图谱检测条件的优化：
1、在样品溶液的制备优化方面
本发明通过对不同提取方法(超声、回流、渗漉等)及不同提取溶剂(甲醇、水、50％乙醇水溶液、95％乙醇、无水乙醇)进行实验比较，结果发现超声提取所得的谱图差成分比较全面，提取效率高，分离度良好，故采用超声提取的方法；对提取溶剂的考察中发现甲醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高，所以选用甲醇进行提取。
2、在色谱条件进行优化方面
本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取205nm、225nm、245nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为245nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选245nm为检测波长。
本发明对流速(1mL/min、0.9mL/min、0.8mL/min、0.6mL/min)进行筛选，因荷叶清轻茶中的成分在1mL/min的流速下峰形较好且分离效果较好，最终选择在流速为1.0mL/min梯度条件。
本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1％甲酸，乙腈和0.05％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1％磷酸水为流动相时，荷叶清轻茶中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.1％磷酸水为流动相。
在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0～10min乙腈体积5％～5％；10～18min乙腈体积5％～13％；18～118min乙腈体积13％～23％；118～125min乙腈体积23％～35％；125～190min乙腈体积35％～100％时可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。
有益效果：
1、本发明根据荷叶清轻茶中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明。
2、本发明提供的荷叶清轻茶指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价荷叶清轻茶的质量，为保证荷叶清轻茶疗效具有重要意义。
3、用本发明所提供的方法所建立的荷叶清轻茶指纹图谱，能有效地表征荷叶清轻茶的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定荷叶清轻茶质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
4、本发明提供的荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
图1为本发明混合对照品的色谱图。
图2为本发明的荷叶清轻茶样品的对照指纹图谱。
图3为本发明荷叶清轻茶样品的8批次供试品指纹图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例用到的仪器与试剂如下：
实验器材
1.1仪器
日本岛津公司全波段扫描(200-800nm)高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统Prominence SIL-20A，二极管阵列检测器SPD-M20A和自动温控柱温箱CTO-20A，KQ3200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，BP121S电子分析天平(SARTORIUS)。
1.2药品与试剂
荷叶清轻茶样品来自江苏海昇药业有限公司；绿原酸对照品(批号110753-201314)购自中国食品药品生物制品鉴定所；大黄酚对照品(批号19011601)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇(分析纯)；磷酸(分析纯)；乙腈(色谱纯)；水(超纯水)。
实施例1一种荷叶清轻茶指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，荷叶清轻茶供试品溶液的制备：
取8批次的荷叶清轻茶样品20g(荷叶4g、决明子3.5g、山楂3.5g、桑叶2g、莱菔子2.5g、火麻仁2g、桑椹2.5g)打粉后置500mL圆底瓶中，加甲醇溶液100mL，超声提取30min，过滤，滤液置于100mL容量瓶中，加甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液；
步骤2，混合对照品溶液的制备：
取精密称定绿原酸、大黄酚对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/mL绿原酸、0.1048mg/mL大黄酚组成的混合对照品溶液。
步骤3，分别精密吸取8批荷叶清轻茶供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：Purospher STAR LP RP-18endcapped，流动相：乙腈和0.1％磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：245nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，梯度洗脱程序如下表：
程序
时间(min)
乙腈体积(％)
1
0
5
2
10
5
3
18
13
4
118
23
5
125
35
6
190
100
步骤4，将步骤3中获得的8批荷叶清轻茶供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012A；选择8批次荷叶清轻茶的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次荷叶清轻茶的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品荷叶清轻茶中有13个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。绿原酸保留时间为27.094min，大黄酚保留时间为162.082min。
步骤5，步骤3中获得的荷叶清轻茶指纹图谱和混合标准品图谱(图1)进行比对，指认主要成分，对比出荷叶清轻茶中1、13号色谱峰分别为：绿原酸(保留时间27.094min)、大黄酚(保留时间162.082min)。
同时本发明使用自动生成的对照HPLC指纹图谱R来生成共有色谱峰模式，分析计算获得江苏海昇药业厂家的8批荷叶清轻茶中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的荷叶清轻茶中药建立的指纹图谱能够很好的检测江苏海昇药业多批次荷叶清轻茶的质量，结果如表1。
表1各批次样品与共有模式间的相似度
实施例2指纹图谱检测的方法学研究：
1、方法学考察
1.1精密度考察
取荷叶清轻茶样品20g(荷叶4g、决明子3.5g、山楂3.5g、桑叶2g、莱菔子2.5g、火麻仁2g、桑椹2.5g)，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μL，按上述实施例1色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，对色谱图中13个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于0.8％，共有峰峰面积RSD均小于0.9％，说明仪器精密度较好。
1.2稳定性考察
取荷叶清轻茶样品20g(荷叶4g、决明子3.5g、山楂3.5g、桑叶2g、莱菔子2.5g、火麻仁2g、桑椹2.5g)，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录色谱图，对色谱图中13个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于1.1％，共有峰峰面积RSD均小于1.5％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
1.3重复性考察
取荷叶清轻茶样品6份，每份20g，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中13个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD均小于2.1％，共有峰峰面积RSD均小于1.9％，说明该方法重复性良好。
以上实验结果表明，本发明提供的荷叶清轻茶指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价荷叶清轻茶的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
实施例3
选用20名体胖，大便不规律，脘腹不适亚健康人群，年龄21～45岁，每天日饮2代茶(荷叶8g、决明子7g、山楂7g、桑叶4g、莱菔子5g、火麻仁4g、桑椹5g)，连续服用7日，晨起大便通畅、精神佳，有效率100％。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
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